siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究

目的:观察针对HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物对HepG2.2.15细胞转染效果及其对HBVM表达的影响。方法:以pGenesil-siAFP表达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜下观察并计算转染阳性细胞百分率,筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后24h、48h、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中HBsAg和HBeAg。结果:pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物8μL∶2.5μg剂量配比组的平均转染率达到了(55.1±4.3)%,且不影响细胞活性;转染后48h和72h后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抑制作用显著(P<0.05)。结论:8μL:2.5μg剂量配比组的pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比,能有效抑制HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg。     

高效小鼠CD40siRNA基因片段的筛选及对淋巴细胞CD40基因表达的影响

目的: 应用RNA干扰技术筛选高效小鼠CD40siRNA基因序列片段.方法: 体外化学合成小鼠CD40基因为靶标的siRNA 3对(siCD40-1、siCD40-2、siCD40-3),通过脂质体瞬时转染小鼠脾淋巴细胞(实验组),并分别以转染无关siRNA片段及未转染细胞作为对照(对照组).分别采用流式细胞术、实时荧光定量PCR检测转染24 h细胞表面CD40抗原、CD40 mRNA表达,蛋白质印迹检测转染48 h蛋白表达的变化.结果: 与对照组相比,实验组CD40抗原表达、CD40 mRNA及蛋白表达明显下降(P<0.01);3对实验组siRNA能明显抑制CD40基因表达,抑制率分别为69%、78%和41%,差异有统计学意义(P< 0.05).而各对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论: siRNA可抑制小鼠淋巴细胞表达CD40,并具有良好的特异性,其中siRNA-2为最高效干扰片段.     

阳离子脂质体介导小干扰RNA转染EOMA细胞时转染条件的优化

目的 优化在阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000介导下将小鼠NF-κB的小干扰RNA（siRNA）转染入EOMA细胞时的转染条件.方法 将1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000与20 pmol、30 pmol、40 pmol、50 pmol 、60 pmol的带荧光标记的siRNA分别组合,制备成相应的转染混合物,转染小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA细胞）,于转染24 h后在荧光显微镜下计数阳性细胞率、MTT法检测各转染条件下EOMA的细胞活性.结果 在siRNA量相同的情况下,分别采用1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000进行转染其转染效率、细胞毒性无明显差异（P＞0.05）;转染混合物中siRNA浓度为50 pmol时,转染效率最高达到86%,继续增加siRNA的浓度,转染效率提高并不明显;siRNA浓度为60 pmol时转染混合物表现出较高的细胞毒性.结论 以1.0 μl Lipofectamine^TM2000与50 pmol的siRNA组成转染混合物可以实现对EOMA细胞高效转染并保持较高的细胞活性.     

量子点为载体转染survivin siRNA至人舌鳞癌Tca8113细胞的研究

目的靶向survivin基因的siRNA通过量子点为载体转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,研究其对survivin基因表达的影响,为量子点在肿瘤的基因治疗方面提供实验依据。方法 Survivin siRNA通过量子点转染至人舌鳞癌Tca8113细胞中,同时设立LIPOFECTTAMINE2000脂质体为转染载体的对照组以及未转染的空白组,采用实时定量RT-PCR检测各组Tca8113细胞中survivin mRNA表达的改变情况。结果实验组用50pmolQD转染100pmol survivin siRNA入Tca8113细胞48h后,检测到survivin siRNA mRNA表达量相对于空白组下降64%,QD与siRNA的使用比例为1∶2;对照组中用100pmol lipofectamine2000脂质体转染100pmol survivin siRNA入Tca8113细胞48h后,检测到survivin siRNA mRNA表达量相对于空白组下降90%,QD与siRNA的使用比例为1∶1。结论量子点为载体转染survivin siRNA能够有效的抑制Tca8113细胞survivin mRNA的表达,量子点有望作为RNA干扰技术的新型载体。     

PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的:构建针对遗传印记基因PEG10的siRNA真核表达载体,体外观察其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响. 方法:设计针对PEG10基因的3个siRNA靶序列,构建真核表达载体siRNA1,siRNA2和siRNA3,脂质体分别转染HepG2细胞后实时定量PCR,检测其对HepG2细胞PEG10基因表达的影响,MTT法、流式细胞仪和激光共聚焦检测转染siRNA后的HepG2细胞的生长活性及凋亡. 结果:成功构建了针对PEG10基因的3个特异性siRNA表达载体. 它们不同程度地抑制了HepG2细胞PEG10基因的表达,以siRNA2抑制效率最高,可达93.99%. HepG2细胞的生长也明显受到抑制(P＜0.05),大量HepG2细胞凋亡,siRNA2凋亡率最高,为66.91%. 结论:靶向PEG10基因的siRNA表达载体可抑制肝癌HepG2细胞的生长,诱导细胞凋亡,该作用与降低PEG10基因的表达有关.     

靶向ST6GalI的siRNA与反义寡核苷酸联合应用对结肠癌细胞转移能力的影响

目的探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响。方法设计并合成靶向ST6GalI的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA不同靶点)、ASO2组(与siRNA相同靶点)、siRNA ASO1组及siRNA ASO2组,应用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA水平,流式细胞术检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质的粘附与侵袭力。结果siRNA组、ASO1组、ASO2组、siRNA ASO1组、siRNA ASO2组中,SW480细胞的ST6GalImRNA表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均明显低于空白对照组、脂质体对照组(P<0.05),以siRNA ASO1组最明显,且siRNA ASO1组与siRNA组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而siRNA ASO2组与siRNA组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应。     

siRNA干预CTGF和TIMP-1对大鼠肝星状细胞胶原分泌的影响

目的研究小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)沉默结缔组织生长因子(connective tissue growthfactor,CTGF)和组织金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMP-1)对肝星状细胞(hepaticstellate cell,HSC)CTGF和TIMP-1基因表达以及对Ⅰ、Ⅲ型胶原分泌的影响。方法根据已筛选出的对CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干扰靶位,将化学合成siRNA CTGF和siRNA TIMP-1以脂质体LipofectamineTM2000介导,瞬时转染HSC-T6细胞,分别设siRNA CTGF组、siRNA TIMP-1组、siRNA CTGF和siRNA TIMP-1联合组、脂质体组及非特异性(negative control,NC)siRNA组,抽提转染24、48h细胞mRNA和蛋白,并收集细胞上清液。应用RT-PCR鉴定CTGF和TIMP-1mRNA的表达;Western blot检测其蛋白表达;ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ型胶原的分泌。结果各干预组转染24、48h后分别与脂质体组和NC siRNA组比较,HSC-T6细胞CTGF及TIMP-1mRNA和蛋白表达均明显下调(均P<0.05),且干预组HSC-T6培养上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量明显减少(均P<0.05)。siRNA联合组分别与siRNA CTGF组和siRNA TIMP-1组比较,于转染48hsiRNA联合组较siRNA TIMP-1组抑制率高,细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原量比siRNA TIMP-1组少,且差异具有统计学意义(均P<0.05);而与siRNA CTGF组比较,其CTGF mR-NA和蛋白抑制率增高,细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原量较siRNA联合组减少,但差异无统计学意义(均P>0.05)。结论针对HSC-T6CTGF mRNA基因全长943位点和TIMP-1mRNA 304位点化学合成的siRNA,对靶基因mRNA和蛋白表达有较好的抑制效果,CTGF和TIMP-1沉默可显著减少细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量;CTGF和TIMP-1两种基因同时沉默,有增强抗肝纤维化效果的可能。     

siRNA对体外培养红系细胞α-珠蛋白基因表达的影响

目的 研究针对α-珠蛋白基因的小分子干扰RNA(siRNA)对体外培养红系细胞α-珠蛋白肽链mRNA表达的影响.方法 将针对α-珠蛋白肽链设计、化学方法合成的siRNA通过脂质体转染体外培养正常人的红系细胞,在转染后24、48、72 h,用流式细胞术检测转染效率,RT-PCR检测α链mRNA表达水平.结果 脂质体转染FCM标记的siRNA进入红系细胞后,24、48、72 h的转染效率分别为61.2%、44.3%、33.7%.siRNA作用于体外培养的红系细胞,经RT-PCR检测,转染后α-珠蛋白基因mRNA相对表达量下降,浓度越高,相对表达量越低.随着作用浓度增加,红系细胞台盼兰拒染率越低;且作用时间越长,台盼兰拒染率也越低.结论 脂质体转染siRNA能特异性地抑制体外培养的红系细胞中α-珠蛋白基因表达,可能会成为β-珠蛋白生成障碍性贫血基因治疗的一个新靶点.     

利用siRNA对β细胞上胰岛素受体的抑制作用

目的:利用siRNA抑制β TC-3细胞中胰岛素受体基因的表达.方法: 化学合成胰岛素受体(IR)基因的4对特异siRNAs(实验组:siRNA-1组,siRNA-2组,siRNA-3组,siR-NA-4组)和1对非特异siRNA(NC组).通过阳离子脂质体将siRNAs分别转染β TC-3细胞,24 h后荧光显微镜下观察不同浓度siRNA转染细胞的效率;应用逆转录PCR检测IRmRNA表达.结果: ①50,100,150,200 nmol/L siRNA转染βTC-3细胞24 h后,转染效率分别为(73.1±4.1)%,(92.9±3.4)%,(90.8±4.0)%,(93.9±2.8)%,选择190 nmol/L浓度作为siRNA转染浓度.②转染100 nmol/L siRNAs 24 h后,与对照组相比siRNA-1,2,3,4组B TC-3细胞IR mRNA表达都有不同程度下调,其中以siRNA-2组抑制效果最为明显,表达减少了70.5%.结论: 靶向IR mRNA的siRNA能在体外特异性的抑制IR的表达,为进一步研究β细胞上IR的功能提供了实验基础.     

靶向ST6GalⅠ的siRNA与反义寡核苷酸联合应用对结肠癌细胞转移能力的影响

目的 探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal Ⅰ)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalⅠ高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响.方法 设计并合成靶向ST6GalⅠ的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染SW480细胞.实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA不同靶点)、ASO2组(与siRNA相同靶点)、siRNA ASO1组及siRNA ASO2组,应用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠ Mrna水平,流式细胞术检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质的粘附与侵袭力.结果 siRNA组、ASO1组、ASO2组、siRNA ASO1组、siRNA ASO2组中,SW480细胞的ST6GalⅠ Mrna表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均明显低于空白对照组、脂质体对照组(P＜0.05),以siRNA ASO1组最明显,且siRNA ASO1组与siRNA组比较,差异有统计学意义(P＜0.05),而siRNA ASO2组与siRNA组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 化学合成的靶向ST6GalⅠ的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalⅠ基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应.     

中心组合设计-效应面法优化长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的处方

目的 采用中心组合设计-效应面法优化长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的最佳处方。方法 以主动载药-pH梯度法制备亲水基修饰阳离子脂质体,以包封率、Zeta电位为指标,考察长春碱与二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）质量比、DPPC与3β-[N-(N′, N′-二甲基胺乙基)胺基甲酰胺基] 胆固醇（DC-Chol）物质的量之比、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇（DSPE-PEG 2000）的质量分数3个因素对考察指标的影响,并对各个因素进行二项式拟合,通过响应面分析选取最佳处方。结果 优化出的长春碱亲水基修饰阳离子脂质体的处方为长春碱与DPPC质量比为0.06、DPPC与DC-Chol物质的量之比为1.00、DSPE-PEG 2000的质量分数为7%。结论 中心组合设计-效应面法应用简便、预测性好,制备的长春碱亲水基修饰阳离子脂质体符合设计要求。     

阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义核酸在K562细胞的摄入和胞内分布的影响

目的探讨阳离子脂质体LipofectinTM对WT1反义寡核苷酸(反义核酸)细胞摄入和胞内分布的影响. 方法采用阳离子脂质体介导WT1反义核酸转染K562细胞,应用流式细胞仪、荧光显微镜分别观察反义核酸的细胞摄入和胞内分布,RT-PCR检测处理前后WT1 mRNA表达水平. 结果 (1)脂质体提高K562细胞对反义核酸的摄入,细胞摄入率达70.9%,平均荧光强度提高6倍以上;脂质体介导转染反义核酸时其细胞浆中类核内体或溶酶体中的点状结构较非脂质体处理时大,胞核内有明显的荧光物质分布;(2)脂质体介导WT1反义核酸可下调WT1 mRNA水平. 结论阳离子脂质体可提高反义核酸的细胞摄入并改变其胞内分布,这可能是它增强反义核酸生物活性的机制.     

瞬时转染siRNA抑制大鼠神经干细胞内MMS2基因的表达

目的建立有效的脂质体瞬时转染法,转染小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),沉默大鼠神经干细胞(neural stem cells,NSCs)内甲基磺酸敏感蛋白2(Methyl Methanesulfonate Sensitive 2,MMS2)的表达。方法设计并化学合成针对MMS2基因的3对siRNA分子序列,采用阳离子脂质体法瞬时转染NSCs,运用实时荧光定量PCR检测NSCs内MMS2基因mRNA的表达。结果 MMS2-siRNA对大鼠NSCs内MMS2基因的沉默效果在转染后36 h达到最大抑制作用;3对特异性MMS2-siRNA序列均有效地抑制了MMS2基因的表达,沉默效率分别为siRNA_A(58±5)%、siRNA_B(64±6)%、siRNA_C(84±3)%,与空白对照组相比均存在显著性差异(P<0.05);siRNA_C沉默效率最高。结论靶向MMS2基因的siRNA分子片段可以有效地抑制NSCs内MMS2基因的表达,为后续相关研究提供实验方法。     

阳离子脂质体包裹bFGF作为免疫佐剂的制备工艺研究

目的 考察阳离子脂质体包裹碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的制备工艺以及在小鼠体内的免疫效应.方法 通过优化如脂质配方、药脂比、挤压次数、冻融次数以及孵化温度等各个工艺参数在保持bFGF高活性的前提下来提高bFGF的包封率.分别用bFGF阳离子脂质体、bFGF弗氏佐剂以及PBS分3组免疫4周龄Balb/c小鼠,连续免疫4次,ELISA测定各组小鼠血清的抗体滴度.结果 优化得到脂质体配方为二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)∶1,2-二油酰-3-三甲铵基丙烷(DOTAP)=2∶1;药脂比为7.5%;液氮速冻,4 ℃孵化60 min,反复冻融6次;过膜挤压10次.通过工艺的改进,bFGF在脂质体中的包封率得到显著提高,达到50%.免疫实验中通过与弗氏佐剂免疫效果比较,阳离子脂质体作为佐剂产生的bFGF的抗体滴度为1∶3200,免疫效果比较令人满意.结论 免疫实验中发现阳离子脂质体作为免疫佐剂,具有很好的佐剂效应.     

β1受体基因治疗对肾性高血压大鼠心室重构的影响

目的:观察阳离子脂质体混合物(DOTAP/DOPE)介导的β1受体反义寡核苷酸单次注射对两肾一夹肾性高血压大鼠血压及心肌胶原含量的影响。方法:用雄性SD大鼠制造两肾一夹肾性高血压模型。β1寡核苷酸(β1ODN)末端用FITC标记,阳离子脂质体混合物与β1反义寡核苷酸(β1ASODN)的摩尔比率分别为0,1.5,2.0,2.5,3.0,经鼠尾静脉注射,β1ASODN注射剂量为0.5mg·kg-1。反向寡核苷酸(β1INODN)注射剂量也为0.5mg·kg-1,比率为2.0。共聚焦检测荧光分布。监测血压,8周后测定左、右心室重量和心肌羟脯氨酸含量。结果:FITC标记的β1ASODN主要分布在心肌细胞的细胞浆中,且呈时间依赖性的减弱。当比率为2.0时,可使血压下降维持27d,可以使血压最大下降39mmHg,其降压效果及维持时间最好。β1INODN组左心室重量/体重、左心室肌羟脯氨酸/心肌干重与假手术组相比显著性升高(P<0.01,P<0.01);比率2.0组的左心室重量/体重、左心室肌羟脯氨酸/心肌干重比β1INODN组显著性降低(P<0.05,P<0.01)。结论:单次注射β1受体反义寡核苷酸对2K1C肾性高血压治疗有效,阳离子脂质体混合物与β1ASODN以不同的比率混合后注射,其降压效果及维持时间以及对左室重构的影响有差异,当比率为2.0时最好;且β1ASODN预防与逆转左室肥厚的同时,也降低左室胶原含?     

GFP质粒DNA/阳离子脂质体复合物的制备及其体外表达

目的 为基因免疫和基因治疗寻找一种简单、经济、有效的DNA投递系统。方法 采用逆向蒸发法,用卵磷脂、胆固醇、十八胺制备成阳离子脂质体包封含绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒pEGFPC1,对三种不同DNA加入量所形成的DNA／脂质体复合物的微球形、包封率、电荷性、转染真核细胞的效果以及对细胞的毒性作用进行初步检测研究。结果 所获得的DNA／脂质体复合物呈球形、平均粒径为562nm;包封率达55％～65％,为阳离子脂质体;都能有效转染真核细胞,但转染效率有差异,DNA／脂质体混悬液中DNA含量、混悬液的加入量以及细胞的作用时间,都对细胞毒性有不同程度的影响。结论 该方法可作为提高基因免疫效果的简单、经济、有效的手段之一。     

正常及糖尿病大鼠肝细胞膜胰高糖素受体放射分析

作者用蔗糖梯度离心分离肝细胞膜,以聚乙二醇为分离剂,建立了大鼠肝细胞膜胰高糖素受体放射分析法。本法的非特异性结合率<5％,特异性结合率25％～35％,批内双管变异为6.83％(n=18),批间重复性符合要求。用受体稀释法和竞争抑制法测定正常及糖尿病大鼠肝细胞膜胰高糖素受体的亲和力均无差异,但糖尿病大鼠肝细胞膜胰高糖素受体浓度较正常大鼠显著增加(P<0.05),尤以低亲和力受体增加明显。作者对受体浓度增加的机理进行了讨论。     

PEG修饰脂质体对阿霉素载药量的影响

目的:在以阿霉素为模型药物用复乳法制备PEG修饰脂质体实验中,发现当制备完毕立即上柱分离时,包封率约为50%;但当样品放置过夜后再测包封率却为98%.本文通过实验分析该现象产生的原因.方法:用不同方法制备PEG修饰的空白脂质体,考察是否仍能吸附阿霉素;制备无PEG修饰的空白脂质体,考察对阿霉素有无吸附作用;设计不同的PEG-阿霉素配比,在不同的孵育时间取样测定对阿霉素的吸附量;将阿霉素溶液直接与PEG20000混合孵育,考察无脂质体时PEG对阿霉素的吸附; 另选土霉素为模型药物,考察是否仍然存在吸附作用.结果:不同方法制备的PEG修饰的空白脂质体对阿霉素都有吸附;无PEG修饰的空白脂质体对阿霉素无吸附作用;PEG对阿霉素的吸附进程受PEG-阿霉素配比、孵育时间的影响;单独的PEG20000对阿霉素也能很好地吸附; 以土霉素代替阿霉素,这种吸附作用仍然存在.结论:该现象是由于PEG链对体相中阿霉素或土霉素的吸附而引起的;这种吸附可能是阿霉素的羟基或氨基对PEG链上氧原子之间的氢键作用.提示这种相互作用的存在能够提高PEG修饰的长循环脂质体,以及含PEG材料的微囊、微球等对这类多羟基或多氨基小分子药物的载药量.     

亚微乳处方因素对亲脂性药物细胞处置的影响

目的：探讨亚微乳处方组成对亲脂性药物细胞摄取和胞内传递过程的影响。 方法：以6-香豆素为模型药物,制备亚微乳。考察油相种类、表面活性剂构成、表面电荷对HeLa细胞摄取的影响,并研究阴离子亚微乳和阳离子亚微乳药物摄取及消除动力学规律,对药物入胞机制进行初步考察。 结果：油相成分和吐温类表面活性剂对细胞摄取无显著影响;司盘类表面活性剂可增加细胞摄取,其中以HLB值为8.6的司盘20效果最好;亚微乳的阳离子修饰可显著增加细胞摄取,加快细胞消除。其摄取速率常数和消除速率常数分别为阴离子亚微乳的4.0倍和1.5倍。6-香豆素主要通过被动扩散方式入胞,阳离子亚微乳细胞摄取增效作用主要通过增加细胞膜接触机会实现。 结论：亚微乳表面特性如乳化剂HLB值及电位可影响亲脂性药物在细胞内的摄取及消除过程。     

Diagnostic accuracy of a bedside D-dimer assay and alveolar dead-space measurement for rapid exclusion of pulmonary embolism: a multicenter study

CONTEXT: A previous study suggested that the combination of a normal D-dimer assay and normal alveolar dead-space fraction is a highly sensitive screening test for pulmonary embolism (PE). OBJECTIVE: To determine if the combination of a normal alveolar dead-space fraction (volume of alveolar dead space/tidal volume 相似文献