bcr/abl特异性siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的构建bcr/abl的特异性siRNA真核细胞表达载体,并初步探索对K562细胞bcr/ablmRNA和P210蛋白的影响。方法根据GenBank数据库提供的bcr/abl基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),再转化为能表达其小发卡结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pTER质粒定向连接,构建受控于人RNA聚合酶启动子H1的真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定;在脂质体的介导下转染K562细胞,用RT-PCR分析bcr/ablmRNA的表达,细胞化学染色检测P210蛋白的表达。结果构建bcr/abl融合基因siRNA真核表达载体pTER117、pTER363,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致,转染K562细胞24h后,pTER117、pTER363分别使bcr/ablmRNA的相对水平下降52%、43%,使P210蛋白分别下降47%、40%。结论bcr/abl融合基因siRNA真核细胞表达载体构建成功,并有效干扰K562细胞bcr/abl的表达。     

姜黄素衍生物Fm04抑制K562细胞增殖及其对P210bcr/abl信号通路的影响

目的 研究姜黄索衍生物Fm04对K562细胞的增殖及对P210bcr/abl信号通路的影响.方法 应用MTT法检测姜黄素衍生物Fm04对K562细胞增殖的影响;应用Western blot法检测P210bcr/abl及其下游通路蛋白表达的变化和线粒体细胞色素C的变化;比色法测定Caspase-3、Caspase-9活化程度.结果 Fr004对K562细胞的抑制作用呈量效、时效关系,4 μmol/L Fm04作用24 h,抑制率88.4%,半数抑制浓度1.45 μmol/L,强度约为姜黄素的7倍;Western blot表明Fm04可显著下调P210bcr/abl及其下游信号通路蛋白,减少细胞线粒体内细胞色素C含量;Fm04处理组Caspase-3、Caspase-9浓度值增加.结论 Fm04显著抑制K562细胞的增殖并减少P210的蛋白含量从而下调P210bcr/abl下游多种信号分子表达,通过激活caspase的活化和线粒体内细胞色素C的释放,最终诱导K562细胞的凋亡.     

阿司匹林和塞来昔布对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响

目的：观察阿司匹林和塞来昔布及二者分别联合阿那曲唑对乳腺癌细胞MCF-7增殖的影响,探讨并比较阿司匹林和塞来昔布的抗肿瘤作用。方法：MTT法检测不同浓度的阿司匹林（2.5 、5.0和10.0 mmol•L^-1）和塞来昔布（30、60和120 μmol•L^-1）分别作用人乳腺癌细胞株MCF-7不同时间（24、48和72 h）的细胞增殖抑制率,以不含药物的培养液作为阴性对照组,以阿霉素作为阳性对照组。MTT法检测不同浓度阿那曲唑（0.5和1.0 mmol•L^-1及其分别联合不同浓度阿司匹林（2.5、5.0和10.0 mmol•L^-1）和塞来昔布（30、60和120 μmol•L^-1）作用于MCF-7细胞48 h的细胞增殖抑制率,以不含药物组为阴性对照组。结果：①阿司匹林各剂量组细胞增殖抑制率随药物浓度的增加、作用时间的延长而提高(P<0.01)。②塞来昔布各剂量组的细胞增殖抑制率随药物浓度的增加、作用时间的延长而升高(P<0.01)。③10 mmol•L^-1阿司匹林和120 μmol•L^-1塞来昔布单独作用72 h抑制率分别达68.88%和87.00％;阳性对照组阿霉素2.0 μmol•L^-1作用72h抑制率达86.30％。④0.5 μmol•L^-1阿那曲唑与阿司匹林联合各剂量组的抑制率均明显高于0.5 μmol•L^-1阿那曲唑单药组(P<0.05),0.5 μmol•L^-1阿那曲唑联合10.0 mmol•L^-1阿司匹林对MCF-7的抑制率明显高于0.5 μmol•L^-1阿那曲唑联合2.5、5.0 mmol•L^-1阿司匹林(P<0.05)。0.5 μ mol•L^-1阿那曲唑分别与60、120 μmol•L^-1塞来昔布联合组的抑制率明显高于0.5 μmol•L^-1阿那曲唑单药组及0.5 μmol•L^-1阿那曲唑与30 μmol•L^-1塞来昔布联合组的抑制率(P<0.05),0.5 μmol•L^-1阿那曲唑联合120 μmol•L^-1塞来昔布对MCF-7的抑制率明显高于0.5 μmol•L^-1阿那曲唑联合60 μmol•L^-1塞来昔布(P<0.05)。1.0 μmol•L^-1阿那曲唑分别联合10.0mol•L^-1阿司匹林、60和120 μmol•L^-1塞来昔布各组的抑制率明显高于1.0 μmol•L^-1阿那曲唑单药组(P<0.05),1.0 μmol•L^-1阿那曲     

Bcr/abl融合基因的小干扰RNA对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察特异性bcr/abl融合基因的siRNA对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法　设计并化学合成bcr/abl融合基因融合位点b3:a2 21个核苷酸 siRNA作用于K562细胞,用WST-8法检测细胞增殖抑制率;RT-PCR 检测 bcr/abl mRNA表达水平;PI单染流式细胞仪检测细胞周期;Annexin V-PI双染测定细胞凋亡比例;Hochest33258 染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果 ①Bcr/abl siRNA作用K562细胞24h,48h,72h后,明显抑制K562细胞增殖,各浓度组间的增殖抑制率无明显差异(p>0.05);②Bcr/abl siRNA能显着下调bcr/abl mRNA水平,各浓度组间差异无显著性(p>0.05);③Bcr/abl siRNA作用组细胞周期阻滞于G1期;④Bcr/abl siRNA作用后细胞出现明显的早期凋亡群,各浓度组间的早期凋亡率差异无统计学意义(p>0.05),细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论 　特异性bcr/abl siRNA可显着抑制K562细胞bcr/abl融合基因的表达,抑制细胞的增殖,诱导凋亡,但其作用未显示明显的剂量依赖性。     

氯化甲基汞对NB4和K562白血病细胞凋亡及增殖的影响

目的：研究氯化甲基汞（MMC）对NB4和K562白血病细胞凋亡及增殖的影响。方法：NB4、K562细胞经1.25、2.50、5.00、10.00和20.00 μmol•L^-1MMC、三氧化二砷（ATO）分别作用0、6、12、24、48和72 h,采用MTT法测定细胞的存活率,采用Hoechst 33258染色后荧光镜下观察细胞凋亡情况。结果： NB4和K562细胞接触10 μmol•L^-1 MMC 24 h后,细胞存活率分别为22.0%和70.0%,与对照比较差异有显著性（P值分别为0.000和0.014）;NB4和K562细胞接触10 μmol•L^-1ATO 24 h后,细胞存活率分别为24.4 %和52.0%（P值分别为0.001和0.000）;荧光镜检呈现明显的凋亡图像。MMC与ATO对NB4、K562细胞诱导凋亡及抑制增殖作用相似。结论：MMC能诱导NB4和K562细胞凋亡,抑制其增殖,并呈时间剂量依赖性。     

维生素K3诱导人肝癌细胞SMMC-7721损伤中Bcl-2和Bax表达的变化及意义

目的：探讨Bcl-2、Bax在维生素K3 (VK3)诱导人肝癌细胞SMMC-7721损伤过程中的变化,为研究VK3诱导肝癌细胞损伤的机制提供参考。方法：体外培养SMMC-7721细胞,取对数生长期细胞分为对照组和不同浓度VK3处理的实验组（20、40和60 μmol•L^-1）,MTT法检测各组SMMC-7721细胞生存率;紫外分光光度法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率;RT-PCR检测Bcl-2及Bax mRNA表达水平;Western blotting检测Bcl-2及Bax蛋白表达水平。结果：与对照组比较,20 μmol•L^-1 VK3组细胞存活率、LDH释放率、Bcl-2和Bax mRNA表达量及其蛋白表达量未见明显变化;与对照组比较,40和60 μmol•L^-1 VK3组细胞存活率降低(P<0.05或P<0.01);LDH释放率增加(P<0.05或P<0.01);Bcl-2 mRNA表达率降低(P<0.05);Bax mRNA表达量率升高(P<0.05);Bcl-2蛋白表达水平下降(P<0.05);Bax 蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论：40 μmol•L^-1剂量的VK3能够诱导SMMC-7721细胞损伤,其机制可能与下调Bcl-2和上调Bax蛋白表达有关。     

1-磷酸鞘氨醇对豚鼠心室肌细胞钙电流的影响

目的：研究1-磷酸鞘氨醇（S1P）对心室肌细胞膜钙离子通道的作用及机制。方法：Langendorff离体心脏逆向灌流法分离豚鼠心室肌细胞,随机选取心室肌细胞分为正常对照组和S1P 0.1、1.0和10.0 μmol•L^-1剂量组以及百日咳毒素（PTX）0.1 mg•L^-1+S1P1.0 μmol•L^-1组。采用全细胞膜片钳技术分别记录各组心室肌细胞Ca²⁺电流。 结果：1.0 μmol•L^-1的S1P使豚鼠心室肌细胞Ca²⁺电流从给药前的(0.256±0.030)mV增加到（0.367±0.090）mV（P<0.05）,10.0 μmol•L^-1的S1P使Ca²⁺电流从给药前的(0.242±0.030)mV增加到(0.364±0.060)mV(P<0.01),而加入G-蛋白耦联受体阻断剂PTX后,S1P对Ca²⁺通道电流的作用与给药前比较差异无显著性。结论：S1P通过与G-蛋白耦联的细胞膜受体介导促进豚鼠心室肌细胞Ca²⁺通道的开放,并具有一定的剂量依赖性。     

三氧化二砷对人大肠癌细胞端粒酶活性及细胞凋亡的影响

目的：探讨三氧化二砷（As₂O₃）对人大肠癌细胞株 CCL-187 端粒酶活性及细胞凋亡的影响。方法：CCL-187 细胞分为对照组、1.0 μmol•L^-1As₂O₃ 组和 2.5 μmol•L^-1As₂O₃ 组，共同孵育1～6 d。MTT 法计算细胞生长抑制率，电镜下观察细胞形态学变化，RT-PCR 法检测细胞端粒酶 hTERT-mRNA 的表达，TRAP-PCR-ELISA 法检测细胞端粒酶活性。结果：1.0 μmol•L^-1 As₂O₃ 组细胞分化明显，2.5 μmol•L^-1As₂O₃ 组出现细胞凋亡。同时2组端粒酶 hTERT-mRNA 的表达均下调，端粒酶活性降低，且具有时间依赖性，与对照组比较差异有显著性（P<0.01 或 P<0.05）；2.5 μmol•L^-1 As₂O₃ 组与 1.0 μmol•L^-1 As₂O₃ 组比较差异也有显著性（P<0.01）。细胞生长抑制率与细胞端粒酶 hTERT-mRNA 的表达呈负相关（1.0 μmol•L^-1 As₂O₃ 组 r=－0.803，P<0.01；2.5 μmol•L^-1 As₂O₃ 组 r=－0.697，P<0.01），与端粒酶活性的下调呈负相关（1.0 μmol•L^-1 As₂O₃ 组 r=－0.836，P<0.01；2.5 μmol•L^-1 As₂O₃ 组 r=－0.792，P<0.01）；细胞端粒酶 hTERT-mRNA 的表达与细胞端粒酶活性呈正相关（1.0 μmol•L^-1 As₂O₃ 组 r=0.956，P<0.01；2.5 μmol•L^-1 As₂O₃ 组 r=0.988，P<0.01）。结论：As₂O₃ 对 CCL-187 细胞有促进分化及诱导凋亡的作用，其机制可能是下调细胞端粒酶 hTERT-mRNA 的基因表达，从而抑制端粒酶的活性。     

OHAP-1对大鼠C6胶质瘤细胞bcl-2/bax基因表达和氧化应激的影响

目的：探讨冲绳巴布蛇毒蛋白-1（OHAP-1）对大鼠C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用及其机制。方法：MTT法检测2.5、5.0和10.0 mg•L^-1 OHAP-1对C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用;RT-PCR法检测OHAP-1对C6胶质瘤细胞bcl-2和bax基因表达的影响;分光光度法检测胶质瘤细胞中丙二醛 (MDA）的含量和超氧化物歧化酶(SOD）的活性。结果：2.5、5.0和10.0 mg•L^-1OHAP-1对C6胶质瘤细胞生长抑制率（49.77％、67.65％和76.42％）高于对照组（P<0.001）。随着OHAP-1剂量的增加,bcl-2 mRNA的表达逐渐下降,bax mRNA的表达逐渐升高,bcl-2/bax亦逐渐减小。2.5、5.0和10.0 mg•L^-1组MDA含量高于对照组(P<0.01),且SOD活性低于对照组(P<0.01);5.0和10.0 mg•L^-1组MDA含量高于2.5 mg•L-1 组和对照组(P<0.001),10.0 mg•L^-1组SOD活性低于2.5 mg•L^-1 组和对照组(P<0.001);10.0 mg•L^-1组SOD活性低于5.0、2.5 mg•L^-1组和对照组(P<0.01)。结论：OHAP-1通过氧化应激使bcl-2/bax mRNA表达降低可能是抑制C6胶质瘤细胞增殖的重要原因之一。     

溶血磷脂酸对豚鼠心室乳头肌动作电位及收缩力的影响

目的：观察溶血磷脂酸（LPA）对离体豚鼠心室乳头肌动作电位及收缩力的影响。方法：健康成年豚鼠18只，随机分LPA 0.1、1.0、10.0 μmol•L^-1组，每组6只，采用给药前后自身对照的方法观察LPA对豚鼠乳头肌的作用。对10.0 μmol•L^-1组，灌流洗脱后，加入四乙基铵(TEA)20 mmol•L^-1+ LPA 10 .0 μmol•L^-1，观察TEA对LPA作用的影响。结果：LPA1.0和10.0 μmol•L^-1组乳头肌收缩幅度由给药前的100%增加到(122.6±7.9)% 和(139.48±8.2)%（P<0.05或P<0.01）。LPA 0.1 、1.0和10.0 μmol•L^-1组心室肌动作电位的幅度（APA）由给药前的（106.79±11.80 ）、（96.86±9.81）和（100.22±7.55）mV升高到（113.49±12.66）、（112.54±10.07）和（118.91±10.62）mV（P<0.05或P<0.01）；动作电位50%时程（APD₅₀）和动作电位90%时程(APD₉₀)均较给药前延长（ P<0.05）。20 mmol•L^-1的TEA 可使LPA 10.0 μmol•L^-1对APD₅₀的作用降低（P<0.05）。结论：LPA可增加豚鼠心脏乳头肌动作电位幅值，延长动作电位时程，增加心室肌收缩力。     

姜黄素与 STI571对慢性粒细胞白血病细胞株K562作用的体外研究

目的 研究姜黄素（Cur）、STI571以及二者联合应用对慢性粒细胞白血病细胞株K562的影响,探索两药的不同效果及联合应用机制.方法 锥虫蓝排染法计算K562细胞增殖抑制率;Western blot方法检测Cur、STI571以及二者联合应用对K562细胞P210bcr/abl蛋白含量及其下游信号蛋白激酶C（PKC）的影响;用金氏公式评价两药的协同效果.结果 Cur和STI571联合应用对K562细胞呈剂量依赖性的抑制作用,协同指数Q值均＞0.85;Western blot显示,Cur和STI571联合应用对P210bcr/abl及PKC的下调呈明显增强作用.结论 Cur与低剂量（0.1,0.15μmol/L）的STI571联合应用对抑制K562细胞增殖呈单独相加;而较大剂量则可明显协同下调P210bcr/abl和PKC的表达水平.     

小分子酪氨酸激酶抑制剂AG-490对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞增殖凋亡的影响

目的探讨酪氨酸激酶抑制剂AG-490对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞的增殖及凋亡的影响。方法采用MTT法观察AG-490在体外对人慢性髓系白血病急变细胞株K562细胞增殖的影响,光学显微镜下观察AG-490对K562细胞形态的变化,流式细胞术检测AG-490对K562细胞凋亡及细胞周期的影响,逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及实时荧光定量PCR技术检测AG-490作用后K562细胞bcr/abl融合基因及凋亡相关基因c-myc mRNA的表达水平。结果 AG-490可明显抑制K562细胞的增殖,并随药物作用时间的延长和浓度的增加,抑制作用越明显（P〈0.05）;AG-490可使细胞周期阻滞于G1期,促使其凋亡（P〈0.05）。AG-490作用于K562细胞48 h后bcr/abl融合基因的表达无明显改变（P〉0.05）,而c-myc的表达水平明显降低（P〈0.05）。结论 AG-490可能通过阻断JAK2信号通路而下调c-myc的表达,使K562细胞阻滞于G1期,从而抑制K562细胞增殖,促使其凋亡。     

酪氨酸蛋白磷酸酶2高表达对p210bcr/abl诱导的慢性粒细胞白血病细胞增殖与凋亡抵抗的影响

目的研究Src癌基因同源的酪氨酸蛋白磷酸酶2(Shp2)在慢性粒细胞白血病(CML)细胞中的表达,及其在p210bcr/abl诱导的白血病细胞恶性增殖和凋亡抵抗中的作用。方法收集25例p210bcr/abl阳性CML患者白血病细胞样本,8例非肿瘤病人骨髓和10例正常人外周血细胞样本作阴性对照,K562和KU812白血病细胞系作为p210bcr/abl阳性对照,KG1白血病细胞作为Shp2阳性对照。用Western印迹技术定量分析与比较Shp2在白血病细胞和正常骨髓造血细胞中的表达情况,通过特异性抑制剂分别下调Shp2和白血病融合基因p210bcr/abl后,观察Shp2表达对p210bcr/abl阳性白血病细胞增殖与凋亡的作用。细胞增殖与凋亡检测应用流式细胞仪。结果(1)磷酸化Shp2蛋白在92%患者CML白血病细胞样本中呈高表达状态,而在8例非肿瘤患者骨髓和10例正常人外周血细胞中低表达或不表达。磷酸化Shp2/β肌动蛋白比值分别为0.91±0.62、0.16±0.09和0.03±0.05(P均<0.01)。(2)下调Shp2蛋白表达后,白血病细胞凋亡率从4.89%上升到38.69%(P<0.01),而S期细胞从33.6%下降到10.8%(P<0.01)。(3)特异性抑制p210bcr/abl融合基因表达蛋白后,白血病细胞中磷酸化Shp2蛋白明显下降,同时出现明显细胞凋亡与生长抑制现象。结论(1)磷酸化Shp2蛋白在慢性粒细胞白血病细胞患者中呈过度表达状态,并且与白血病细胞恶性增殖与凋亡抵抗密切相关。(2)bcr/abl融合基因阳性患者的白血病细胞中Shp2的过度表达可能由p210bcr/abl蛋白激活引起。     

Genistein 对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响

目的 研究Genistein抑制K562细胞生长的机制及对CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响。方法 用RT－PCR方法检测Genistein作用于K562细胞前后CyclinD1基因和bcr-abl融合基因的mRNA表达变化,用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡。结果 K562细胞中CyclinD1基因、bcr-abl融合基因的mRNA和CDK4蛋白表达阳性,用Genistein与K562细胞共同孵育后,bcr-abl融合基因的mRNA表达阴性,CyclinD1的mRNA和CDK4蛋白表达下降,细胞阻滞于G2／M期,K562细胞出现凋亡。结果 bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4蛋白在K562细胞中高表达,Genistein能使K562细胞生长受抑,诱导其调亡,抑制bcr-abl基因的mRNA表达,并使CyclinD1基因的mRNA和CDK4蛋白表达下降,表明bcr-abl融合基因、CyclinD1基因和CDK4对慢粒发展存在内在关系。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

三尖杉酯碱诱导慢性髓系白血商K—562细胞凋亡的实验研究

目的 阐明三尖杉酯碱（HT）作用于K562细胞的机制。方法 应用细胞形态，DNA凝胶电泳和流式细胞仪等检测，观察HT对K562细胞株的作用方式，进一步用RT-PCR方法研究bc/rlabl基因在转录水平的改变。结果 0.01-100.00μg/ml浓度HT可诱导K562细胞凋亡，并呈时间和剂量依赖性，随着药物作用时间的延长，bcr/abl基因的转录下调。结论 低浓度HT就可通过抑制bcr/abl基因的表达，诱导K562细胞凋亡。     

三尖杉酯碱诱导慢性髓系白血病K-562细胞凋亡的实验研究

目的阐明三尖杉酯碱（HT）作用于K562细胞的机制。方法应用细胞形态、DNA凝胶电泳和流式细胞仪等检测,观察HT对K562细胞株的作用方式,进一步用RT-PCR方法研究bcr/abl基因在转录水平的改变。结果0.01～100.00μg/ml浓度HT可诱导K562细胞凋亡,并呈时间和剂量依赖性。随着药物作用时间的延长,bcr/abl基因的转录下调。结论低浓度HT就可通过抑制bcr/abl基因的表达,诱导K562细胞凋亡。