赖型钩体内鞭毛基因的扩增,克隆,核苷酸序列测定及其在大肠杆…

根据钩体内鞭毛蛋白ｆｌａＢ基因核苷酸序列自行设计一对引物，以赖型钩体ＤＮＡ为模板，用ＰＣＲ扩增到约８４０ｂｐ的片段。扩增片段经酶切（Ｂａｍ ＨＩ、Ｐｓｔ Ｉ）定向克隆入ｐＵＣ８。重组质粒ｐＬＦ１插入片段与哈勒焦型钩体ｆｌａβ基因相比，核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性很高。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明有一约３３ｋｄ的特异蛋白带，表达量占菌体蛋白１１％。免疫印迹试验表明此区带能被抗赖型钩体内鞭毛（轴丝）抗血     

问号赖型钩体内鞭毛基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌的 …

为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原，以探讨制备新疫苗的途径，利用聚合酶链反应扩增其编码基因完整的开放阅读框架，扩增产物经ＳａｌＩ、ＣｌａＩ双酶切消化后定向克隆于ＰＴ７－７表达载体上。     

赖型钩体重组质粒pDJH2亚克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

为了探讨ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂ０１７株钩体ＤＮＡ片段可否作为本重疫苗广谱保护性抗原的候选，采用重组ＤＮＡ技术，将ｐＤＪＨ２的１．９ｋｂＤＮＡ片段分别一ＰＴ７－７，ｐＲＳＥＴ系列重组，转化为大肠杆菌进行亚克隆，ＩＰＴＧ诱导表达，结果显示：阳性亚克隆ｐＤＪｔ，ｐＤＪｒＢ能在大肠杆菌中一致，免疫印迹在６８ｋｄ处分别有印迹，用ｐＤＪｔ亚克隆重组质粒主动免疫豚鼠，可抵抗强和株攻击，表现出免疫保护作用本实验结     

问号赖型钩体内鞭毛基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌的表达

为了获得重组表达的钩体内鞭毛亚单位蛋白抗原，以探讨制备新疫苗的途径，利用聚合酶链反应扩增其编码基因完整的开放阅读框架，扩增产物经ＳａｌⅠ、ＣｌａⅠ双酶切消化后定向克隆于ｐＴ７－７表达载体上。重组质粒转化入大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）中，经ＩＰＴＧ诱导表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示此产物相对分子量为３４ｋｄ，产量占细菌总蛋白的１１．８％。用插入片段为探针，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交提示可能有两个相关的基因存在于钩体的基因组内。Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交证实该表达蛋白可与内鞭毛抗血清在３４ｋｄ处出现印迹，与钩体内鞭毛同类蛋白带位置一致，本实验克隆了钩体内鞭毛Ｂ类基因并表达了相应抗原。     

赖型钩体pDC38核酸序列测定及其与流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ompL1核酸序列的类似性匹配

为了探讨赖型钩体 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段基因组 Ｄ Ｎ Ａ 编码、位置与ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因的关系,作者采用在流感伤寒型钩体外膜蛋白基因ｏｍ ｐ Ｌ１ 首尾区段设计一对引物,以 ｐ Ｄ Ｃ３８ 插入片段作模板进行 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增、测定和类似性匹配（ａｌｉｇｎｍ ｅｎｔ）。结果发现：ｐ Ｄ Ｃ３８ 含有 ２．７ｋｂ 和３．０ｋｂ 两个插入片段,３．０ｋｂ 片段含有 １ 个ｏｍ ｐ Ｌ１ 基因全拷贝。结论：类似性匹配表明,ｐ Ｄ Ｃ３８ 和ｏｍ ｐ Ｌ１ 相同碱基８６４ 个（９０％ ）,碱基变异（不配对）９６（１０％ ）个, ｐ Ｄ Ｃ３８ 可用于钩体诊断、分类、鉴定、疫苗和发病机理的研究。     

赖型钩体DNA重组质粒rpDJt及其表达蛋白P68对豚鼠的免疫保护研究

为了进一步鉴定赖型钩体ＤＮＡ重组质粒ｒｐＤＪｔ及其纯化表达蛋白质Ｐ６８的免疫保护作用，采用随机、双盲和对照法对５０只豚鼠进行了３次和６个部位主动免疫接种，并于接种后３０天以强毒力、大剂量活钩体攻击。结果：Ｐ６８组存活率１００％（７／７）；ｒｐＤＪｔ组存活率７７％（１０／１３）；ｐＴ７－７组（无重组质粒）存活率２５％（３／１０）；全钩灭活疫苗组存活率９３％（１３／１４）。作者认为该质粒的表达蛋白质Ｐ６８可作为钩体基因工程亚单位疫苗的候选抗原。     

赖型钩端螺旋体基因库的构建及致病性钩端螺旋体DNA同源序列的克隆

作者应用质粒载体pUC9构建了肺弥漫性出血型构端螺旋体(钩体)病的主要病原——赖型钩体的基因库,并从中筛选出与致病钩体DNA同源的重组质粒pCX7和pCX9。重组质粒pCX9可识别致病钩体017株DNA1.7kb片段、601株9.0kb片段及610株30.0kb片段,而不与非致病的双曲钩体Patoc I株和illini细螺旋体DNA杂交。本研究结果进一步表明:致病钩体与非致病钩体DNA的同源性很低;致病钩体间DNA同源性较高。     

人β-NGF基因的体外扩增、克隆及其序列的分析

目的　对人β－ ＮＧＦ基因进行体外扩增和克隆及其序列分析,为其在真核细胞中的表达及其临床应用打下基础。方法　本实验设计并合成一对特异性引物,采用聚合酶链反应分别从人脑ｃＤＮＡ 和人睾丸ｃＤＮＡ 以及人脑基因组ＤＮＡ中扩增出β－ 神经生长因子（β－ ＮＧＦ）基因,并和Ｔ４ 载体相连接,经筛选得到人β－ ＮＧＦ克隆,并用Ｓａｎｇｅｒ 双脱氧末端终止法进行序列分析。结果　凝胶电泳显示在预期的位置出现阳性条带。结论　阳性克隆经序列分析证明克隆基因序列正确     

以λgt11作载体构建赖型钩体基因文库及其重组质粒pDL121的克隆和在E.coli表达的研究

为探讨赖型钩体抗原基因特点及其表达产物作为疫苗的可行性，采用问号赖型０１７株钩体经ＨｈａⅠ和ＡｌｕⅠ限制性内切核酸酶部分消化，行ＥｃｏＲⅠ限制酶切位点甲基化，加上ＥｃｏＲⅠ接头与去磷酸化的λｇｔ１１ＤＮＡ－ＥｃｏＲⅠ臂连接，体外包装后转染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，建成含２．１×１０６重组子的问号赖型０１７株钩体基因文库。用抗赖型钩体兔血清从上述基因文库中筛选出一个强阳性克隆，λＤＬ１２，亚克隆入ｐＵＣ１８质粒，获重组质粒，ｐＤＬ１２１。ＥｃｏＲⅠ酶切证实该重组质粒含有１ｋｂ的外源插入片段。ｐＤＬ１２１经ＩＰＴＧ诱导后，在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现２３ｋｄ特异条带。免疫印迹表明该蛋白带可被抗赖型钩体兔血清识别。     

人降钙素基因的克隆及其序列分析

目的：克隆人降钙素基因（ｈＣＴ）并经序列分析予以确证。方法：首先自新鲜全血中用含ＴｒｉｔｏｎＸ－１００的缓冲液提取基因组ＤＮＡ，经酒精沉淀和洗涤后，作为模板，加入上下游引物，应用聚合酶链反应直接扩增出ｈＣＴ的编码序列。并将此段ＤＮＡ插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳｍａＩ位点之间。最后用ＰＣＲ－双脱氧末端终止法进行序列分析。结果：成功地克隆了ｈＣＴ，证实所得ｈＣＴ基因克隆含编码人降钙素３２个氨基酸的全长ＤＮＡ序列９６ｂｐ。结论：已获得人降钙素基因克隆，为后续研究打下基础     

钩端螺旋体赖型017株外膜脂蛋白LipL41基因的克隆及原核表达

目的　构建钩端螺旋体外膜脂蛋白 L ip L41基因的重组原核表达质粒 ,为进一步制备以 L ip L41为目的基因的亚单位疫苗提供实验依据。方法　根据钩端螺旋体 L.kirscneri RM5 2株外膜脂蛋白 L ip L41基因序列设计引物 ,以赖型钩端螺旋体 0 17株基因组 DNA为模板 ,进行 PCR扩增并 DNA测序 ,以质粒 p GEX1λT为载体 ,插入 L ip L41基因片段构建重组原核表达质粒 ,并检测 L ip L41的表达。结果　测序结果示所得片段为 L ip L41的编码序列 ,酶切及 PCR分析证实重组质粒构建成功 ,SDS- PAGE和 Western blotting分析重组质粒可高效表达蛋白质 L ip L41。结论　 L ip L41基因的重组原核表达质粒构建成功 ,并可在大肠杆菌中高效表达     

急性髓性白血病多药耐药基因的表达及其临床意义

目的 探讨急性髓性白血病（AML）多药耐药基因mdrl表达与临床耐药和化疗疗效的关系。方法 应用反转录－聚合酶链反应（RT－PCR）,检测30例AML患者骨髓和10名正常人外周血单个核细胞中mdrl基因的表达。结果 正常对照组均为阴性表达。AML初治组mdrl阳性率为26.32%,而复发难治组mdrl阳性率为81.82%,两组之间存在明显差异（P＜0.01)。初治组中mdrl阳性患者的首次完全缓解率（20.00%)明显低于mdrl阴性患者的首次完全缓解率（85.71%)（P＜0.01)。结论 AML的mdrl基因过度表达与临床耐药密切相关,是判断疗效及预后的一个重要指标。     

SARS病毒M蛋白编码基因在大肠杆菌中的克隆与表达

目的：克隆SARS冠状病毒膜蛋白M胞外区编码序列，并将其置于大肠杆菌作融合表达。方法：从GenBank获得SARS病毒BJ01株膜蛋白M编码基因序列，人工合成其氨基端129-base-pair(bp)双向单链DNA序列，在5’和3’端分别引入BamHⅠ、Ⅰ酶切位点，退火后形成双链DNA，常规法将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中，构建含M蛋白编码基因的重组原核表达质粒。重组质粒经酶切鉴定，核酸序列测定和分析后转化大肠杆菌(E．co如)BL21感受态细胞，以异丙基硫代一B—D一半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果：核酸序列测定与分析的结果表明，克隆的129bp基因序列与基因数据库中所登记的BJ01毒株序列呈现100％同源性。IPTG诱导后的菌体，经SDs-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示有一个大小为30．1ku的融合表达蛋白产生。结论：M蛋白氨基端胞外区129bp编码基因在E.coli中获得正确表达。