血管内皮生长因子重组腺病毒转染鼠骨髓基质细胞及其产物促内皮细胞增殖的研究

目的探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165(VEGF165)基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)后对VEGF基因的转录、表达及其产物生物活性的影响。方法体外培养4只大鼠骨髓基质细胞,用携带VEGF165基因的重组腺病毒转染培养细胞;通过逆转录聚合酶链反应、免疫印记法和酶联免疫吸附法检测VEGF在转染细胞内的转录、表达和细胞外分泌情况;通过血管内皮细胞增殖实验测定转染VEGF165基因后的BMSCs培养上清中VEGF蛋白的生物活性。结果腺病毒介导VEGF165基因转染BMSCs后可以获得有效的转录及表达,其分泌于培养上清中的表达产物可明显促进大鼠主动脉血管内皮细胞的增殖(P<001),具有很强的生物学活性。结论腺病毒可安全、有效地转染BMSCs,VEGF165基因转染的鼠BMSCs可有效表达具有生物活性的VEGF蛋白。     

血管内皮生长因子基因稳定转染兔骨髓基质干细胞的研究

目的 检测人血管内皮生长因子(VEGF)基因稳定转染对兔骨髓基质干细胞(BM-SC)VEGF表达的影响.方法 分离并培养兔骨髓基质干细胞,利用脂质体介导pcDNA3.1-VEGF165转染兔BMSC,G418筛选稳定表达pcDNA3.1-VEGFl65的细胞克隆,RT-PCR、Western blot法检测转染前后细胞中VEGF165 mRNA和蛋白的表达.结果 通过筛选获得了稳定表达pcDNA3.1-VEGF165的细胞克隆.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot结果显示:稳定转染组BMSC中可检测到VEGF165 mRNA和蛋白的表达,空白和空载体组未见VEGF表达.结论 pcDNA3.1-VEGF165载体转染的兔BMSC可稳定表达外源性VEGF165 mRNA和蛋白,可作为治疗骨缺损和骨缺血性坏死研究的种子细胞.     

VEGF转染对骨髓基质细胞成骨功能的影响

[目的]将血管内皮生长因子121(vascular endothelial growth factor 121,VEGF121)基因转染兔骨髓基质细胞(rabbit bone marrow stroma cells,rMSCs)后,研究转染后细胞的成骨功能变化,为进一步利用经基因转染的rMSCs构建组织工程骨血管化打下基础.[方法]体外培养、扩增rMSCs,将其分为转染组和未转染组,脂质体介导下PCDI- VEGF121真核表达质粒转染rMSCs后,G- 418筛选阳性细胞克隆.通过RT - PCR法检测VEGF mRNA水平,通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Ⅰ型胶原检测来评价两组细胞的成骨能力.将阳性克隆细胞和未转染的细胞植入裸鼠股部肌袋内.分别于植入后4、8周处死动物,观察异位成骨情况.[结果]转染组和未转染组的ALP表达随着时间逐渐增强,转染组细胞内ALP水平显著增高,Ⅰ型胶原在转染组细胞内高表达,转染组的rMSCs植入肌袋后,随着植入时间的延长,出现骨髓腔样结构及大量骨小梁,表现出较好的异位成骨能力.[结论]应用VEGF121基因转染rMSCs后,有利于发挥VEGF121的血管化作用,促进rMSCs的成骨能力,将会成为组织工程骨血管化探索的方向.     

脂质体介导血管内皮生长因子基因片段在犬骨髓基质干细胞中的表达及其影响

目的 探讨脂质体介导的重组血管内皮生长因子165(vascularendothelial growthfactor 165,VEGF165)基因转染后的犬骨髓基质干细胞分泌血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)的能力及细胞增殖能力的改变,为改善骨缺血坏死的干细胞治疗方法提供基础.方法 实验分VEGF165基因转染组与空白对照组,从成年犬的胫骨抽取骨髓,体外分离纯化,贴壁培养骨髓基质干细胞,传代培养后以脂质体法将携带荧光蛋白VEGF165基因的穿梭质粒转入实验组骨髓基质干细胞中,在荧光显微镜视下观察转染效率,并通过ELISA法分别检测转染后1、3、5、7、9、11、13 d实验组与对照组培养液中VEGF的含量,对结果进行统计分析.MTT法检测转染细胞的增殖能力,绘制增殖曲线.结果 重组人血管内皮生长因子165(recombinate the human being vasular endotheial growth factor165,hVEGF165)基因通过脂质体能够成功转染犬骨髓基质干细胞并分泌VEGF.h-VEGF165基因转染组培养液中VEGF蛋白含有量较未转染组增高,ELISA结果显示转染后上清液中第2天即可出现VEGF浓度的增高,到第7天时达到分泌高峰,筛选后的细胞上清液中VEGF浓度稳定在300ng/L左右,与对照组相比升高约10倍,其差别具有显著的统计学意义.骨髓基质干细胞转染基因后,细胞的增殖能力同对照组相比无明显差别.结论 采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到犬骨髓间充质干细胞中并可有效表达VEGF. hVEGF165基因转染犬骨髓基质干细胞对细胞的增殖能力无明显影响.     

人VEGF165基因在狗骨髓基质细胞中的表达

目的 :检测转染 pcDNA3 hVEGF165狗骨髓基质细胞的VEGF165mRNA表达。方法 :用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞 ,用免疫组化及RT PCR检测VEGFmRNA的表达。结果 :重组质粒 pcDNA3 hVEGF165转染骨髓基质细胞后 ,免疫组化及RT PCR检测有VEGFmRNA的表达。结论 :采用脂质体介导的方法可将hVEGF165基因转染至狗骨髓基质细胞并表达外源性基因     

种植转染VEGF165基因骨髓基质细胞的脱蛋白异体骨在裸鼠体内的成骨

目的:探讨脱蛋白骨支架种植转染血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)165基因的骨髓基质细胞体内的成骨作用.方法:从狗的髂骨穿刺骨髓分离骨髓基质细胞,应用脂质体转染VEGF165基因,以RT-PCR检测转染的基因表达.随机选取4周龄BALB/C裸鼠30只,随机分为3组,各组10只.实验组A为脱蛋白骨 转染pcDNA3-hVEGF165基因的骨髓基质细胞;实验组B为脱蛋白骨 骨髓基质细胞;对照组C为单纯植入脱蛋白骨 DMEM.在脊柱两侧分开肌间隙,每只裸鼠植入2块脱蛋白骨材料至肌腹内.术后4、8周处死取材,经大体观察、组织形态学与免疫组化方法检查细胞材料复合物植入后的成骨作用及VEGF表达.结果:组织学检查A、B组均有成骨,并随时间延长而新骨增多,但其中转基因的A组其成骨作用明显,并在植入4周后免疫组化可见VEGF表达呈阳性;对照组C无成骨现象.结论:转染VEGF165基因骨髓基质细胞复合脱蛋白骨在体内具有较好的成骨作用.     

血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因转染骨髓间充质干细胞的表达

目的检测兔骨髓间充质干细胞(BMSc)经血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染后外源基因的表达，为进一步利用经基因转染的BMSc构建血管化组织工程骨组织打下基础。方法构建VEGF真核细胞表达载体，利用脂质体介导转染兔BMSc，使用原位杂交、免疫组织化学的方法检测VEGF165在BMSc中的表达。结果成功构建VEGF真核细胞表达载体，原位杂交、免疫组化方法显示经基因转染的BMSc中有阳性棕黄色颗粒出现，而未转染组呈现阴性结果。结论采用基因转移技术可以将VEGF转染至．BMSc中，并有外源性基因和蛋白的表达。     

转染人骨形成蛋白-7基因的骨髓基质细胞异位成骨实验研究

目的 观察转染人骨形成蛋白-7（Bone morphogenetic protein-7,BMP-7）基因的骨髓基质细胞（Bone marrow stromal cells,BMSCs）与胶原膜（BME-10X）复合培养后的异位成骨能力。方法将hBMP-7基因转染Beagle犬BMSC,与胶原膜复合培养后,植入裸鼠皮下,8周后取材,HE、Mallory染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色,观察其异位成骨能力。结果各组均有不同程度Ⅰ型胶原的表达,转染组和未转染组显著高于单纯膜组,转染组又显著高于未转染组（P〈0．05）。结论转染了hBMP-7基因的BMSCs具有更强的异位成骨能力,有望成为牙周组织工程理想的种子细胞,     

人血管内皮生长因子165基因转染人骨髓间充质干细胞的实验研究

Objective To establish an effective method of transfecting human marrow mesenchymal stem cells (MSC) with human vascular endothelial growth factor 165 ( VEGF 165) gene. Methods MSCs isolated and cultured in vitro were divided into transfection group (pShuttle-CMV/VEGF 165 plasmid was transfected into MSCs through liposome-mediating method), empty plasmid group (pShuttle-CMV vehi-cle was transfected into MSCs as control), liposome group (liposome was transfected into MSCs as control) and control group(normal culture). Expressions of Mrna and protein of MSCs were determined by RT-PCR, enzyme-linked immunosorbent assay and Western Blot. Sensitivity to MSCs on VEGF plasmid transfec-tion was detected by MTT test. Results Expression level of VEGF 165 gene Mrna in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively 0.89 ± 0.03, 0. 34 ± 0.04, 0.40 ± 0.03, and 0.30 ± 0.03, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0. 01 ). Content of VEGF protein in transfection group, empty plasmid group, liposome group, and control group was respectively (778 ± 35 ), (543 ± 24), (561 ± 28), (571 ± 23) pg/Ml, and the difference between transfection group and the other three groups was statistically significant ( P <0.01 ). In the transfection group, expression level of VEGF protein peaked on 7th day after transfec-tion, which was decreased gradually later. In transfection group, expression level of V EGF 165 protein was obviously higher than that of the other three groups ( P <0. 01 ), and no inhibitory effect of VEGF plasmid transfection on MSCs proliferation was found. Conclusions The method for transfecting human VEGF 165 gene into MSCs is established in this research, through which target gene and protein can express effectively.     

转化生长因子-β1基因转染骨髓基质细胞的瞬时表达与稳定表达

目的 探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞（BMSCs）的表达能力。方法 取6周龄新西兰白兔BMSCs,传代培养后以3μl阳离子脂质体（Lipofectamine):1μg pcD-NA3J-TGF-β1的比例转染,通过免疫组织化学染色及图像分析对3组15份样本检测TGF-β1表达水平;利用水貂肺上皮细胞生长抑制法检测TGF-β1生物活性,分析转染的量效关系和时效关系。结果 瞬时表达组转染后48h免疫组织化学染色部分细胞呈强阳性,稳定表达组全部细胞呈强阳性表达持续4周以上。图像分析显示转染细胞TGF-β1表达显著增强,与对照组比较差异有非常显著性（P＜0．01）。量效关系显示,在转染体系中pcDNA3-TGF--β1(μg）：阳离子脂质体（μl）为1：3时,TGF-β1表达效率最高;时效关系显示,稳定表达组TGF-β1表达活性较瞬时表达组更强。结论 TGF-β1基因转染可使BMSCs有效地表达活性TGF-β1而产生生物效应。     

hVEGF165基因转染大鼠BMSCs的实验研究

目的构建携带hVEGF165基因的重组腺病毒载体pAdxsi-增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165,体外转染大鼠BMSCs,观察转染后hVEGF165的表达情况以及对BMSCs生长增殖的影响,为进行血管再生的基因治疗奠定实验基础。方法将hVEGF165从原始质粒切下连接到pShuttle-巨细胞病毒-EGFP重组穿梭载体,并转移至pAdxsi载体上,获得重组腺病毒载体质粒pAdxsi-EGFP-hVEGF165,进行酶切鉴定及基因测序。采用PacI限制性内切酶线性化pAdxsi-EGFP-hVEGF165,并转染人胚肾细胞HEK293,收获重组腺病毒,测定病毒滴度。贴壁法培养Wistar大鼠BMSCs,体外转染携带EGFP基因的重组腺病毒(pAdxsi-EGFP),荧光倒置相差显微镜及流式细胞术确定最佳病毒感染复数(multiplicities of infection,MOI)。依据最佳MOI转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165至BMSCs,采用Western blot、RT-PCR及ELISA法检测转染后hVEGF165的表达;MTT法评价转染后BMSCs生长增殖情况。结果酶切鉴定及基因测序提示重组腺病毒载体质粒含有hVEGF165 cDNA;经多轮感染、扩增后,病毒滴度可达1×1010 pfu/mL。荧光倒置相差显微镜观察转染pAdxsi-EGFP后MOI为150 pfu/cell时转染效果最佳,流式细胞仪检测转染效率约88%。Western blot和RT-PCR检测示,pAdxsi-EGFP-hVEGF165转染BMSCs 48 h后在蛋白质和基因水平均可有效表达hVEGF165;ELISA检测示其含量在7 d达高峰,在20 d时仍有表达,1、3、5、7、9、11、13、15、20 d各时间点hVEGF165含量均显著高于EGFP基因转染组及未转染组(P<0.05)。MTT结果显示,各时间点转染pAdxsi-EGFP-hVEGF165的BMSCs与未转染组细胞的吸光度(A)值比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 BMSCs是一种较理想的基因载体细胞,成功制备的重组腺病毒载体质粒可在MOI值为150时将hVEGF165基因有效转染至BMSCs;转染后hVEGF165表达水平较高、持续时间较长,且对BMSCs的生长增殖无明显影响。     

携带人VEGF_(165)和ANG-1双基因的腺病毒载体的构建及目的基因的表达

[目的]构建并鉴定携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因共表达重组腺病毒载体pAd-VIA。[方法]采用基因克隆技术克隆目的基因VEGF165、ANG-1基因,将得到的基因通过引入内部核糖体进入位点序列(IRES),亚克隆至含有报告基因EGFP的穿梭载体pTrack-CMV中,构建携带双基因的腺病毒穿梭载体pTrack-CMV-VIA。进而使用AdEasyTM腺病毒系统重组并包装腺病毒。通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测制备的腺病毒pAd-VIA感染的大鼠骨髓基质干细胞中外源基因VEGF165及Ang-1的表达。[结果]该重组腺病毒质粒经测序、酶切鉴定,证明基因序列正确。转染QBI-293A细胞后,可观察到GFP明显表达。重组合腺病毒载体pAd-VIA获得成功包装,扩增后病毒滴度为2×1010PFU/ml,大鼠骨髓基质干细胞转染48 h后,绿色荧光蛋白表达阳性,ELISA结果显示转染组在感染48 h后,培养细胞上清中的VEGF165浓度为(42.5±2.082)ng/105细胞,ANG-1浓度为(16.67±2.08)ng/105细胞,未转染组几乎未检测到外源基因的表达,有统计学差异(P0.05)。[结论]成功构建携带人VEGF165、ANG-1双基因共表达重组腺病毒载体,为组织工程人工骨血管化的研究奠定基础。     

Transplantation of BMSCs expressing hVEGF165/hBD3 promotes wound healing in rats with combined radiation‐wound injury

The combined radiation‐wound injury is a refractory wound with decreased number or dysfunction of repairing cells and growth factors. This remains a challenge in clinical practice. The object of this study is to evaluate the therapeutic efficacy of a combination of human vascular endothelial growth factor 165 (hVEGF₁₆₅) and human beta‐defensin 3 (hBD3) in the treatment of such wounds. A plasmid‐carrying hVEGF₁₆₅ gene and hBD3 gene was used to transfect rat bone‐marrow‐derived mesenchymal stem cells (BMSCs). The supernatant from the modified BMSCs significantly promoted the proliferation and cell migration of human endothelial cells and it also inhibited the growth of bacteria and fungus, demonstrating the successful expression of the transfected genes. The hVEGF₁₆₅/hBD3‐modified BMSCs were then injected into the sites of combined radiation‐wound injury on rats. It demonstrated that wound‐healing time was shortened significantly in the treated rats. The granulation tissue formation/maturation, skin appendage regeneration and collagen deposition were also improved significantly. Strong expression of hVEGF₁₆₅ and hBD3 was detected in the wound surface at early stage of the healing. The results indicate that topical transplantation of hVEGF₁₆₅/hBD3‐modified BMSCs promoted wound healing, and this gene therapy strategy presents a promising approach in the treatment of refractory wounds such as the combined radiation‐wound injury.     

培哚普利对糖皮质激素诱导的MSCs凋亡及成骨分化的影响

目的 探讨培哚普利对糖皮质激素(GCs)诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)凋亡及成骨分化的影响,并分析可能的机制.方法 将体外培养的MSCs分为5组:空白对照组、地塞米松组(DEX组,106 mol/L DEX)、培哚普利低、中、高剂量组(106 mol/L DEX溶液+0.01μmol/L培哚普利、106 mol/L...     

Endothelial cells incubated with platelet‐rich plasma express PDGF‐B and ICAM‐1 and induce bone marrow stromal cell migration

Platelet‐rich plasma (PRP) is used to accelerate bone repair through the growth factors released by platelets. The purpose of this study was to evaluate if PRP induce human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) to express mRNA for osteogenic growth factors and stimulate the migration of bone marrow stromal cell (BMSC). The effects of PRP were compared to those induced by vascular endothelial growth factor‐A (VEGF‐A) or, as a negative control, by platelet poor plasma (PPP). After incubation with PRP, but not with PPP, HUVEC showed an increased expression of mRNA for platelet derived growth factor‐B (PDGF‐B), and this effect was not inhibited by an anti‐VEGF‐A antibody. The migration of BMSC was more stimulated by HUVEC incubated with PRP than by HUVEC incubated with low serum medium or PPP. Besides, PRP increased the expression of intercellular adhesion molecule‐1 (ICAM‐1) and osteoprotegerin, but did not affect the expression either of the receptor activator for nuclear factor κB ligand (RANKL) or of RANK. These findings support the hypothesis that PRP contribute to bone repair by favoring the pro‐osteogenic function of endothelial cells, including the recruitment of osteoblast precursors and the expression of adhesion molecules for monocyte/macrophages, while inhibiting their pro‐osteolytic properties. © 2009 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 27:1493–1498, 2009     

腺病毒介导人VEGF_(165)和ANG-1双基因转染大鼠BMSCs及对其增殖的影响

[目的]探讨携带人血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管生成素-1(ANG-1)双基因的腺病毒表达载体pAd-VIA转染大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)的体外表达及对BMSCs增殖的影响。[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因的腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,体外转染大鼠BMSCs,通过绿色荧光蛋白(GFP)表达、Western-blotting、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法检测外源基因的表达,利用MTT法检测MOI(multiplicity of infection)=50、100、200、400 pfu/cell不同浓度腺病毒转染后对BMSCs增殖活性的影响。[结果]重组腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,体外转染BMSCs后,有大量的GFP表达,Western-blotting检测显示,转染组与VEGF165和ANG-1抗体结合,在45 KD和14.4 KD左右出现印迹条带;ELISA结果显示:转染组第1、2、3 d,上清中的VEGF165浓度和ANG-1浓度持续增加,未转染组均未检测到外源基因的表达,差异...