实时荧光定量PCR快速检测无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染

目的　探讨将实时荧光定量PCR（qPCR）检测细菌16S rRNA基因用于快速判断无菌性体液革兰阳/阴性细菌感染,并评价其分析性能。方法　以细菌16S rRNA基因为目标设计通用引物、通用探针及革兰阴性（GN）菌探针,对14种标准菌株、20种临床菌株、白色念珠菌、乙型肝炎病毒(HBV)、人基因组及阴性对照进行qPCR检测,评价该方法引物和探针的通用性和特异性及检测限。以104 cfu/ml菌悬液、阴性对照的循环域（Ct）值99%置信区间下限分别作为尿路、其他无菌性体液细菌感染判定的分界值。用271例临床无菌性体液标本评价qPCR法的临床效能。结果　通用探针-qPCR,所有实验菌株检测为阳性。GN探针-qPCR,所有实验革兰阴性菌株检测为阳性。通用探针的检测限为1×101～1×102 cfu/ml。GN探针的检测限可低至1.0×101 cfu/ml。判定尿路、其他无菌性体液细菌感染的分界值分别为23.76、29.37。结论　应用细菌16S rRNA基因通用探针和GN探针的qPCR方法通用性好、特异性强、检测限低,可快速检测临床无菌性体液常见细菌感染,为临床提供准确、可靠的病原学诊断依据。     

实时荧光定量PCR检测痰标本中军团菌属

目的建立荧光定量PCR方法,用于检测军团菌属特异性16S rRNA基因,并探讨广州地区军团菌属感染状况。方法利用军团菌属特异性16S rRNA基因保守序列设计引物和探针,优化反应条件和反应体系,对嗜肺军团菌、非嗜肺军团菌及其他细菌进行检测,验证该方法的特异性、敏感性、重复性,对广东省中医院采集的532例肺部感染患者痰液标本进行检测。结果该方法检测军团菌属所有标准菌株均出现阳性信号,其他非军团菌属细菌检测结果均为阴性;检测灵敏度为102CFU/ml,临床检测532例肺部感染患者的痰液标本,荧光法检出军团菌阳性43例,阳性率为8.08%,16S rRNA PCR法加基因测序验证阳性率为7.71%,两者检测结果差异无统计学意义,表明其具有较好的符合性和等效性。结论 16S rRNA基因荧光定量PCR法检测患者痰液标本中军团菌属,具有快速、敏感、特异等特点,适用于临床军团菌属感染调查及快速检测。     

巢式PCR方法在快速检测新生儿败血症病原菌中的应用

目的探讨巢式聚合酶链反应(PCR)方法在快速检测新生儿败血症病原菌中的应用价值。方法以细菌16S rRNA基因为扩增靶序列,设计一对所有细菌通用引物和一对革兰阴性菌特有引物,用巢式PCR方法扩增已知病原菌,检测其特异性。用巢式PCR方法和培养法同时检测新生儿败血症血液,对2种方法的检测结果进行比较分析。结果已知实验菌株经通用引物扩增后均获得920 bp产物,革兰阴性菌经革兰阴性菌特有引物扩增后获得353 bp产物,而革兰阳性菌、人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无相对应产物。2种方法检测病原菌革兰分型吻合度一致,但巢式PCR方法阳性率高。结论巢式PCR方法检测新生儿败血症病原菌,具有快速、敏感度高等优点,并能对病原菌进行革兰分型,具有一定的实用价值。     

应用通用引物PCR检测诊断细菌和真菌性中枢神经系统感染的价值

目的了解细菌和真菌性中枢神经系统（CNS）感染病原谱,并探讨通用引物聚合酶链反应（PCR)检测技术的病原学诊断价值。方法收集某院2009年1月—2015年3月疑似或确诊CNS细菌或真菌性感染患者资料,分析其脑脊液培养病原菌种类,采用细菌16S rRNA和真菌28S rRNA通用引物对患者脑脊液DNA进行PCR扩增和序列测定,并与同期脑脊液培养及鉴定结果进行比较。结果共收集确诊或疑似CNS细菌或真菌感染者400例,其中脑脊液培养阳性132例。共分离病原菌150株,其中革兰阳性菌48株,革兰阴性菌90株,真菌12株;居前3位的细菌为鲍曼不动杆菌（32株）、凝固酶阴性葡萄球菌（16株）和肺炎克雷伯菌（13株）;最常见真菌为新生隐球菌（8株）。选取88份感染患者脑脊液标本和20例非感染患者脑脊液进行PCR扩增,PCR扩增法灵敏度（35.23％,31/88）高于培养法（28.41%,25/88）（χ2＝4.17,P＜0.05）。PCR扩增和培养法阴性预测值分别为25.97%、24.10%,两种方法的特异度、阳性预测值均为100.00%。PCR扩增测序与培养结果符合率为84.00%（21/25）;PCR检测平均报告时间（48 h）较培养结果报告时间（细菌平均约72 h,真菌平均约96 h）更快速。结论CNS 感染病原分布广泛,以革兰阴性菌为主;通用引物PCR检测具有快速、灵敏、准确等特点,具有良好的临床推广和应用价值。     

实时荧光定量PCR快速检测细菌对抗菌素敏感性与耐药性表型的方法建立

目的 建立快速检测细菌对抗菌素的敏感性与耐药性表型的实时荧光定量PCR(qPCR)方法。方法 用基于细菌16S rRNA基因通用引物和通用探针的qPCR检测大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌临床分离菌株基因组DNA,绘制生长曲线以确定细菌显著生长的最短培养时间。计算细菌在含和不含抗菌素的M-H肉汤中的相对生长率,以VITEK 2 Compact 全自动细菌分析系统的药敏结果为金标准,对细菌相对生长率进行ROC曲线分析,确定区分细菌对抗菌素敏感与耐药的相对生长率分界值。用20株肠杆菌科细菌和10株革兰阳性球菌临床分离菌株验证方法的可靠性。结果 细菌显著生长的最短培养时间为3小时。区分大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌对抗菌素敏感与耐药的相对生长率分界值分别为0.44、0.40和0.48本方法检测30株大肠埃希菌对3种抗菌素的敏感性和耐药性的准确度分别为98.4%和100.0%,30株金黄色葡萄球菌对3种抗菌素的敏感性和耐药性的准确度均为100.0%,30株铜绿假单胞菌对3种抗菌素敏感性和耐药性的准确度分别为60.0%和64.0%。20株肠杆菌科细菌和10株革兰阳性球菌对抗菌素的敏感性与耐药性结果的总准确度分别为92.7%和93.3%。结论 本方法能快速准确为临床提供肠杆菌科细菌和革兰阳性球菌对抗菌素的敏感性与耐药性表型,但对非发酵菌药敏结果的准确性不能满足临床要求。     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

贵州省死亡病例1型猪链球菌的分离及分子生物学特征分析

目的 对来自贵州省1例疑似人感染猪链球菌患者的血液标本进行细菌分离鉴定,了解该菌株的分子生物学特征,为病例的快速确诊提供病原学依据。方法 采用血培养法对疑似感染猪链球菌患者的血液进行细菌分离培养,对分离菌株采用细菌16S rRNA 基因通用引物进行PCR扩增和DNA序列测定,将测序结果通过GenBank数据库的BLAST程序进行在线比对,再用猪链球菌种特异的16S rRNA 基因进行猪链球菌种的鉴定,进一步分别采用PCR检测常见强致病性血清型1、2、7和9型特异的cps 1j、cps 2j、cps 7h和cps9h基因以鉴定其血清型,并对菌株毒力基因gapdh、mrp、sly和ef进行检测。结果 血培养分离出1株链球菌可疑菌株,序列比对结果显示该分离菌株16S rRNA基因与猪链球菌的同源性最高,进一步的猪链球菌特异性PCR检测显示分离菌株16S rRNA基因为阳性,血清型特异PCR检测结果显示cps 1j基因为阳性,而cps 2j、cps 7h和cps 9h基因为阴性,毒力基因检测结果显示分离菌株gapdh,sly和ef毒力基因为阳性,而mrp为阴性。结论 本次从疑似感染猪链球菌死亡病例分离的菌株为猪链球菌1型,其毒力特征为gapdh、sly和ef基因阳性,mrp基因阴性,该病例为1型猪链球菌感染所致,且菌株毒力较强。     

16S rRNA基因检测在新生儿败血症早期诊断中的应用

目的 建立基于16S rRNA基因的聚合酶链反应(PCR)细菌学检测方法,以指导临床快速诊断新生儿败血症.方法 以细菌16S rRNA基因为靶序列,利用计算机软件设计合成所有细菌保守区共有的一对通用引物,通过PCR扩增已知10株实验室保存菌株、人类基因组DNA、巨细胞病毒、白色假丝酵母菌和空白对照,并对其灵敏度和特异性作一评价.结果 对所测已知10株实验室保存菌株均获得920 bp扩增产物,其与人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无交叉阳性反应;PCR阳性率为26.8％,血培养阳性率为11.3％,两者比较有差异有统计学意义(P＜0.05),PCR灵敏度高于血培养.结论 与血培养比较,PCR具有检测速度快、特异性及敏感度高等特点.     

葡萄酒中酒香酵母实时荧光PCR检测方法的研究

目的建立葡萄酒中酒香酵母实时荧光PCR检测方法。方法将滴度为3.0×10~6cfu/ml、3.0×10~5cfu/ml、3.0×10~4cfu/ml、3.0×10~3cfu/ml、3.0×10~2cfu/ml、30 cfu/ml的1 ml菌液加至45 ml酒样中,离心洗涤后利用碱裂解法提取DNA,进行实时荧光PCR检测,测定检测方法的灵敏度;提取革兰阳性细菌、革兰阴性细菌以及5株葡萄酒中相关菌株(包含1株酒香酵母等效菌株)的DNA,进行实时荧光PCR检测,测定检测方法的特异性。结果该实时荧光PCR方法的定量限为6.67 cfu/ml,检出限为0.67 cfu/ml;该方法对酒香酵母及其等效菌株均可检出,对革兰阳性细菌、革兰阴性细菌以及其余相关菌株均无交叉反应。结论该实时荧光PCR方法灵敏度高、特异性好,可准确快速地检测出葡萄酒中的酒香酵母菌。     

布鲁氏菌S2疫苗株实时荧光定量PCR检测体系的建立及应用

目的建立一种布鲁氏菌S2疫苗株的实时荧光定量PCR检测体系。方法依据布鲁氏菌S2疫苗株与其他布鲁氏菌参考菌株全基因组序列的差异, 设计引物和探针, 建立实时荧光定量PCR检测体系。自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所, 收集22株布鲁氏菌参考菌株及8种非布鲁氏菌对照菌株的DNA;同时自布病疫苗生产厂采集环境样本, 使用血液/组织基因组DNA提取试剂盒提取环境样本细菌DNA。对获取的DNA先行普通PCR预扩增, 再以扩增的PCR产物为模板进行实时荧光定量PCR二次扩增(巢式荧光定量PCR), 观察是否出现特异荧光曲线及相应的循环数(Ct值), 并测试其灵敏性。结果建立的实时荧光定量PCR检测体系, 除S2疫苗株外, 其他21株布鲁氏菌参考菌株和8种非布鲁氏菌对照菌株均未检出特异荧光曲线(无Ct值)。建立的检测体系, 检测布鲁氏菌S2疫苗株DNA的最低限为4.34 fg;采集的14份环境样本, 其中3份检测到布鲁氏菌S2疫苗株DNA。结论建立的实时荧光定量PCR检测体系, 能够检测到样本中布鲁氏菌S2疫苗株, 具有较好的灵敏性和特异性。     

实时荧光PCR检测志贺菌特异基因ipaH

目的：建立一种灵敏、快速检测志贺菌的实时荧光PCR方法,研究志贺菌在腹泻病人中的感染情况。方法：针对志贺菌特异性基因ipaH设计引物、探针,应用培养分离的志贺菌进行验证,同时检测360例临床标本并与培养法进行对照。结果：应用实时荧光PCR方法,10株志贺菌检测结果均为阳性,10株非志贺菌结果均为阴性;检测灵敏度达到4 cfu/test。360例临床标本中实时荧光PCR方法检测出29例阳性,培养法检测出12例阳性。结论：实时荧光PCR法检测志贺菌具有灵敏度高、快速方便的特点,可用于检测腹泻病人志贺菌感染。     

多重实时荧光PCR检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌

[目的]建立多重实时荧光PCR方法以检测金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌.[方法]通过设计引物和探针,优化反应条件,建立多重实时PCR,检测金黄色葡萄球菌nuc基因、蜡样芽胞杆菌16S rRNA保守区基因及其ces基因(编码致呕毒素cereulide).该多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,比较其与菌株鉴定结果及ces基因普通PCR检测结果.[结果]多重实时荧光PCR方法检测23株金黄色葡萄球菌、4株蜡样芽胞杆菌菌株和6株乳杆菌,与菌株鉴定结果的符合率为100%.蜡样芽胞杆菌的ces基因检测结果也与普通PCR结果相符.[结论]建立了同时检测金黄色葡萄球菌nuc、蜡样芽胞杆菌168保守区基因及ces基因多重实时PCR方法,可应用于金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌在种水平上的菌株鉴定、以及蜡样芽胞杆菌cereulide毒力菌株的鉴定.     

细菌核糖体23 S亚单位基因芯片在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的研究建立快速检测细菌DNA的方法,建立含有10种细菌探针的检测用基因芯片模型. 方法使用合成的扩增细菌核糖体23 S亚单位(23S rDNA)寡核苷酸探针,制备基因芯片;设计23S rDNA通用引物,应用PCR(聚合酶链反应)法,扩增细菌核糖体23S亚单位基因(23S rDNA),扩增后产物与芯片上的探针杂交,用荧光扫描仪检测信号;对23种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用本方法进行检测,并与常规细菌培养法比较. 结果基因芯片检测临床致病菌具有较高的特异性和灵敏性. 结论利用寡核苷酸探针基因芯片检测系统具有一定的种属鉴别能力,比常规培养法快速、准确.     

建立Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法

目的利用Taqman探针实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌。方法根据沙门氏菌属共有基因序列和肠炎沙门氏菌的特异序列分别设计2组引物及探针,运用实时荧光PCR进行特异性、灵敏性及模拟样品的检测实验。结果采用沙门氏菌属探针可检测到25种不同血清型沙门氏菌(共49株),而11株阴性对照菌株未得到扩增;利用肠炎沙门氏菌探针可从25种不同血清型的沙门氏菌(共49株)和11株阴性对照菌株中特异性的检测出全部15株肠炎沙门氏菌;以肠炎沙门氏菌系列稀释度菌液DNA为模板进行实时荧光PCR扩增,菌株的模板浓度与Ct值之间呈现良好线性关系,线性系数(R2)0.993,扩增效率87%,最低检测浓度260cfu/mL;分别接种肠炎沙门氏菌于四种样品进行模拟样品检测,实时荧光PCR检测结果与经典培养鉴定方法的检测结果相吻合。结论实时荧光PCR检测食品中肠炎沙门氏菌的方法特异性强、敏感度高,可应用于食品中肠炎沙门氏菌的检测。     

PCR方法快速检测猪链球菌2型的研究

目的 利用PCR方法鉴定疑似猪链球菌(S.suis)菌株,对其应用效果进行评价.方法 采用S.suis种特异性基因(16s rRNA)和荚膜多糖S.suis2型特异性基因(cps2J)引物对3株疑似S.suis菌株进行PCR扩增,并和常规培养方法进行比较.结果 PCR方法对3株疑似S.suis菌株扩增出16s rRNA和cps2J基因条带,鉴定结果为S.suis2型,与常规培养方法结果相符.结论 与常规培养方法相比,S.suis2型PCR检测方法准确、快速,适合S.suis疫情的快速检测.     

沙门菌和志贺菌双重实时荧光定量PCR的应用效果评价

目的研究沙门菌和志贺菌双色实时荧光PCR法的应用价值。方法收集2017年8月到2018年4月深圳市西丽人民医院临床肛拭子样本2700份,运用双色实时荧光PCR法检测沙门菌与志贺菌,统计阳性检出率,并与培养法的检测结果进行对比。结果 2700份样本中,培养法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为2株、0株,检出率分别为0.07%、0.00%,双色实时荧光PCR法检出沙门菌与志贺菌阳性分别为6株、3株,检出率分别为0.22%、0.11%,双色实时荧光PCR法检出率高于培养法,对比差异有统计学意义(P0.05)。结论双色实时荧光PCR法检测沙门菌和志贺菌的临床效果显著,具有较高的特异性、敏感度及准确率,值得临床推广与应用。     

细菌性感染PCR诊断方法的建立及其应用研究

目的通过通用引物PCR,为建立一种实用、快速可靠细菌感染PCR检测方法奠定基础。方法收集100例疑似血流感染患者的血液进行细菌培养,同时检测细菌16S rRNA基因,测定和分析所得DNA序列,对培养结果与PCR结果进行比较;采用倍比稀释法进行PCR灵敏度检测。结果 100份血液标本中细菌培养8份阳性,阳性率为8.0%;PCR法19份阳性,阳性率为19.0%,细菌培养与PCR检测结果比较,差异有统计学意义(χ2=9.09,P<0.05);测序结果显示DNA序列与GenBank公布的基因序列同源性很高,PCR可检测范围至1.5×102CFU/ml。结论只要严格控制污染,通过16S rRNA基因PCR技术对疑似血流感染的临床诊断具有重要意义。     

循环游离DNA联合16S rRNA基因检测在糖尿病烧伤脓毒症早期诊断中的作用

目的探讨循环游离DNA(cf-DNA)联合16S核糖体RNA(16S rRNA)基因检测在糖尿病烧伤脓毒症患者早期诊断中的作用。方法选择2016年3月-2018年5月山东省滨州市人民医院烧伤科收治的糖尿病烧伤可疑脓毒症患者65例,采取常规血培养及16S rRNA基因检测PCR法进行细菌分离鉴定,并检测患者外周血炎症指标及血糖变化。分析PCR、血培养结果与各指标关系。结果 16S rRNA基因检测PCR法检出65例标本,阳性30例,阳性率46.15%,血培养阳性18例,阳性率27.69%(P<0.05);PCR法检测所需时间低于常规血培养(P<0.05)。PCR法检出革兰阴性菌19株(占63.33%)、革兰阳性菌11株(占36.67%);血培养检出革兰阴性菌13株(占72.22%)、革兰阳性菌5株(占27.78%)。PCR检测阳性患者cf-DNA、C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、空腹血糖(FBG)以及餐后2 h血糖(2h PG)均高于PCR阴性患者(P<0.05)。患者cf-DNA水平与外周血CRP、TNF-α、IL-6水平呈正相关关系(P<0.05)。血培养阳性患者cf-DNA、CRP、TNF-α、IL-6、FBG以及2hPG均高于血培养阴性患者(P<0.05)。结论 16S rRNA基因PCR检测可快速诊断糖尿病烧伤脓毒血症患者感染病原菌,联合cf-DNA运用,有助于糖尿病烧伤脓毒血症患者的早期诊断。     

副溶血性弧菌热稳定直接溶血素基因转录水平差异研究

目的 运用实时荧光定量 PCR 检测24株副溶血性弧菌热稳定直接溶血素（TDH）基因转录水平差异。方法 普通 PCR 法检测分离自患者、海产品和环境中的副溶血性弧菌 tdh 基因,tdh 阳性菌株提取细菌总 RNA 后逆转录合成 cDNA,检测无 DNA 污染后定量至同一浓度,采用实时荧光定量 PCR 同时检测 cDNA 产物中 tdh 基因和内标基因16 S rRNA 的 Ct 值,ΔCt 等于 tdh 的 Ct 值减去16 S rRNA 的 Ct 值,以ΔCt 值反应 tdh 相对于内标基因16 S rRNA 的转录水平。结果 24株副溶血性弧菌的 tdh Ct 值、内标基因16 S rRNA Ct值和各样本两者之差的ΔCt 值结果范围分别为18.04～25.95、8.30～10.93和8.28～15.34,ΔCt 最大值与最小值差为7.06,最高转录水平菌株为最低菌株的133倍（ΔΔCt ＝27.06）。结论 副溶血性弧菌 tdh 基因转录水平存在较大差异,该差异性形成的分子机制以及与该菌的致病性的关系有待进一步研究。     

细菌16S rRNA在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎中的应用

目的 评价荧光定量PCR检测腹水细菌16S rRNA基因在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎患者中的临床应用价值.方法 用细菌16S rRNA基因荧光定量PCR法检测64例非中性粒细胞性腹水疑似自发性细菌性腹膜炎患者及6例慢性肝病伴非感染性腹水患者腹水中的细菌DNA,同时与腹水细菌培养结果进行对比.结果 细菌16S rRNA荧光定量PCR最低可检测到10个拷贝的DNA复制,检测细菌的阳性率明显高于细菌培养的阳性率,分别为15.63%和3.13%,两组差异有统计学意义(x2=5.52,P＜0.05).6例非感染性腹水荧光定量PCR及细菌培养均阴性.结论 腹水细菌16S rRNA荧光定量PCR检测细菌的特异性强、敏感性高,在诊断非中性粒细胞性腹水自发性细菌性腹膜炎患者中具有重要的临床应用价值.