shRNA对乳腺癌细胞VEGF-C表达的抑制作用

目的:观察RNA干扰技术对乳腺癌MDA-MB-231细胞VEGF-C表达的影响.方法:制备针对VEGF-C的三种小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),分别是siRNAa、siRNAb、siRNAc,筛选靶向基因最有效siRNA,据此设计短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)寡核苷酸链,构建pGenesil-1/VEGF-C重组质粒表达载体.利用脂质体将此质粒转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、免疫组织化学染色法和Westem blot方法检测VEGF-C的变化情况,利用Quantity One软件对RT-PCR、Western blot图像进行半定量分析,用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量并分析免疫组织化学染色法结果.结果:RT-PCR结果显示siRNAa、b、c对MDA-MB-231均有抑制作用,与空白对照组、脂质体组的差异性显著(P＜0.05),siRNAa抑制率最高(72.41%).利用针对siRNAa合成的shRNA与质粒pGenesil-1构建表达裁体pGenesil-1/VEGF-C,酶切鉴定及测序结果均表明构建成功.将其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后,RT-PCR、免疫组织化学染色法和Western blot方法检测均表明VEGF-C的表达明显受到抑制(P＜0.05).结论:shRNA RNA干扰技术可以有效沉默人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中VEGF-C的表达,提示该技术可能是抑制乳腺癌淋巴管生成的有效手段.     

bmi-1shRNA逆转录病毒表达载体的构建及稳定转染LoVo细胞系的建立

目的构建针对原癌基因bmi-1的shRNA逆转录病毒表达载体,建立稳定转染的LoVo细胞系,探讨稳定转染bmi-1shRNA对大肠癌细胞LoVo靶基因表达的影响,为下一步应用RNAi技术治疗打下基础。方法设计合成靶向bmi-1基因编码短发夹RNA的两条寡核苷酸序列,另设计无义对照序列,构建重组载体pSIREN-bmi-1及pSIREN-bmi-1-C,载体经脂质体2000介导转染LoVo细胞,通过嘌呤霉素筛选,建立稳定转染的LoVo细胞系,显微镜观察、MTT检测、荧光定量PCR、Western blot检测bmi-1表达受抑后对细胞的增殖影响。结果成功构建了针对bmi-1基因的shRNA表达载体,建立了稳定转染的LoVo细胞系,bmi-1shRNA对LoVo细胞bmi-1 mRNA表达抑制率为80%、bmi-1蛋白抑制率为82%,P<0.05。结论针对bmi-1基因的shRNA表达载体能够明显抑制结肠癌细胞LoVo的增殖能力,bmi-1 mRNA与蛋白表达受抑制,但对细胞形态学无明显影响。     

Survivin shRNA重组慢病毒构建及对A549细胞增殖的影响

背景与目的 Survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的成员,在多种肿瘤组织中高度表达而在终末分化细胞中极少表达,因此可以作为癌症治疗的理想靶点.本研究旨在通过构建Survivin基因shRNA的慢病毒质粒并干扰肺癌细胞A549中Survivin的表达,分析其对细胞增殖的影响.方法 设计Survivin干扰靶序列,构建重组质粒;将pLL3.7-Survivin转染293T细胞后利用Hela细胞检测病毒的滴度并感染A549细胞,应用RTPCR和Western blot检测干扰效果;MTT与流式细胞术分析其对细胞增殖的影响.结果 本研究成功构建了重组质粒;重组质粒可抑制A549细胞中Survivin基因的表达;细胞受阻于G2/M期.结论 本研究构建的重组质粒可抑制Survivin基因的表达并影响细胞的增殖,其为研究RNAi介导的肺癌基因治疗打下基础.     

Survivin shRNA干扰对食管癌细胞CDK4 mRNA表达的影响

目的： 以shRNA抑制食管癌ECA109细胞内Survivin的表达,探讨Survivin shRNA干扰对CDK4基因表达的影响。方法：ECA109细胞分为Survivin shRNA干扰组、质粒对照组和空白细胞组,采用RNA干扰技术沉默ECA109细胞株中Survivin基因的表达,RT-PCR检测各组细胞中Survivin和CDK4 mRNA的表达,Western blot方法检测各组细胞Survivin蛋白的表达,流式细胞术检测细胞周期的改变。结果：与质粒对照组及空白细胞组比较,Survivin shRNA干扰组细胞Survivin mRNA及蛋白表达下调,CDK4 mRNA表达明显降低,差异均具有统计学意义(P均<0.05);Survivin shRNA干扰组G2期延长,G2期细胞比例增加,细胞G2期增殖阻滞。结论：Survivin基因可能在转录水平对CDK4具有调控作用,其具体调控机制有待进一步研究。     

靶向cortactin基因的shRNA重组质粒的构建和筛选

目的 构建靶向cortactin基因的shRNA重组质粒,并筛选出沉默cortactin基因效果最明显的shRNA重组质粒。方法 设计并合成3对针对cortactin基因不同位点的shRNA片段,构建相应的重组质粒（命名为pBSilence1.1-cortactin-shRNA1-3）,并进行酶切鉴定和测序分析。通过脂质体转染方法将各重组质粒及阴性对照质粒分别转染至人肝癌HepG2细胞中,转染24 h后荧光显微镜下观察各组细胞的转染情况,并采用RT-PCR检测各组细胞mRNA的表达情况。结果 构建的重组质粒经酶切鉴定与测序分析证实完全符合设计要求, 转染成功的细胞在荧光显微镜下显示绿色荧光,3组重组质粒组HepG2细胞的cortactin基因mRNA表达水平明显低于阴性对照组和空白对照组（P<0.05）。与pBSilence1.1-cortactin-shRNA1和pBSilence1.1-cortactin-shRNA2两组相比,pBSilence1.1-cortactinshRNA3组的cortactin基因mRNA表达降低更加显著（P<0.05）。结论 成功构建并筛选的重组质粒能有效抑制HepG2细胞中cortactin基因mRNA表达,为下一步研究沉默cortactin基因对肝癌细胞生物学行为的影响提供了实验基础。     

靶向活化T细胞核因子1基因的shRNA质粒表达载体的构建

 目的　利用pRNAT-U6.1／Neo质粒构建靶向NFAT1基因的3个shRNA,为下一步探索肺癌基因治疗的RNA干扰途径奠定基础。方法　设计3对shRNA（NFAT1-sh-1、NFAT1-sh-2、NFAT1-sh-3）,以人类基因同源性差的无关序列（NFAT1-sh-NC）作为阴性对照。筛选与人类其他基因同源性小、特异性针对目的基因的siRNA。合成并克隆至带有U6启动子的pRNAT -U6.1／Neo质粒中,构建质粒表达载体,通过凝胶电泳鉴定后转化至大肠杆菌中进行培养,并提取质粒进行DNA测序鉴定。结果　成功构建和筛选出靶向NFAT1基因的3对shRNA质粒表达载体,GC比例为40 ％～55 ％。结论　构建的3个靶向NFAT1基因shRNA质粒表达载体有助于肺癌靶向基因治疗RNA干扰的研究。为筛选有效的基因干扰载体,以及对荷瘤肺癌裸鼠靶向RNAi抗肿瘤细胞生长的研究鉴定了基础。     

利用siRNA抑制人骨肉瘤细胞survivin的表达

目的构建生存素(survivin)短发夹状RNA表达载体,检测其对骨肉瘤细胞survivin mRNA及蛋白表达的影响。方法体外构建survivin shRNA表达载体pSilence2.1-neo-survivin,转染骨肉瘤细胞系MG-63,RT-PCR、免疫组化方法检测转染前后survivin mRNA及蛋白的表达,MTT比色法检测细胞增殖活性。结果pSilence2.1-neo-survivin载体转染能显著抑制survivin mRNA、蛋白表达,转染后48h细胞增殖的抑制率为61.83%。结论pSilence2.1-neo-survivin可显著抑制MG-63细胞survivinmRNA、蛋白的表达及细胞的增殖活性。     

SET基因shRNA慢病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达鉴定

目的： 构建SET基因shRNA慢病毒表达载体,为研究SET在三氯乙烯毒性机制中的作用提供技术支持。 方法：通过NCBI检索SET序列,设计合成5对shRNA片段,退火后连接到慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector。挑取筛选的单菌落,经PCR和测序鉴定后提取质粒。将质粒共转染到293T细胞,收集病毒上清,转导入L-02肝细胞中,利用嘌呤霉素筛选得到SET缺陷型细胞,最后利用荧光定量PCR和Western blot鉴定干扰效果。结果：PCR和测序结果证明双链shRNA正确插入慢病毒载体pLVX-shRNA1 vector,共转染293T细胞得到高滴度病毒,转导L-02细胞筛选出SET基因缺陷型细胞。结论：利用慢病毒介导的RNAi技术成功构建了SET基因缺陷型细胞。     

携带沉默IGFIR shRNA和表达Wtp53的重组慢病毒的构建和鉴定

胰岛素样生长因子Ⅰ类受体（insulin．1ikegrowthfactorIreceptor，IGFIR）的胞内信号转导涉及众多信号通路，与多种肿瘤的发生、发展关系密切。p53基因与IGFIR家族关系密切，能够抑制IGFIR启动子活性及mRNA水平。本研究构建IGFIR基因shRNA和同时表达Wtp53慢病毒载体（pPRIME-WtP53-shlGFIR），感染肝癌HEP3B细胞，观察能否下调IGFIR和上调P53蛋白水平，为研究肝癌的基因治疗奠定基础。     

靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体的构建和鉴定

[目的]构建靶向细胞周期蛋白E的shRNA真核表达载体。[方法]针对cyclin E基因，设计1对寡核苷酸，形成双链后将其将其插入Psilencer2.1-U6-neo质粒，构建cyclin E shRNA真核表达载体，酶切和测序鉴定。转染MCF-7细胞株，应用western blot检测cyclin E蛋白的表达。[结果]酶切和测序结果显示，成功构建特异性针对cyclin E的shRNA表达质粒。转染MCF-7细胞后下调cyclin E的表达。[结论]成功构建靶向cyclin E的shRNA真核表达载体，为进一步应用RNAi技术进行肿瘤基因治疗的研究提供实验基础。     

慢病毒载体介导RNA干扰体外抑制人胰腺癌细胞VIM基因的表达

Objective: To construct a lentiviral expression vector for RNA interference (RNAi) of human VIM gene; and assess its gene silencing effect in pancreatic cancer cell line Panc-1. Methods: Three pairs of human VIM gene short hairpin RNA (shRNA) sequences were designed using a software available on-line and one pair came from document. After synthesis and annealing, four double-stranded oligonucleotides (dsOligo) were cloned into the pGCL-GFP/U6 plasmid, which were subsequently confirmed by polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing analysis. Real-time PCR and Western blotting were used to screen the effective pGCL-GFP-shRNA plasmid in 293T cells, then the most effective one was packed into the recombinant lentivirus Lv-VIM-shRNA with lentiviral packing materials pHelper 1.0 and pHelper 2.0 in 293T cells.The titer of lentivirus was determined by hole-by-dilution titer assay. The silencing effect of Lv-VIM-shRNA in Panc-1 cells were validated by real-time PCR and Western-blotting. Results: An effective Lv-VIM-shRNA was successfully constructed.The titer of lentivirus was determined on 2×109TU/mL. The expressions of VIM mRNA and vimentin were down-regluated in the Panc-1 cells infected with Lv-VIM-shRNA. Conclusion: An effective Lv-VIM-shRNA could inhibit the expression of VIM gene in Panc-1 cells in vitro, which provides a tool for investigating the role of VIM gene in the signaling pathway involved in tumorigenesis and progression of pancreatic cancer and searching new therapeutic targets.     

靶向Rap1b基因shRNA慢病毒载体的构建及其对食管鳞癌细胞Rap1b基因表达的沉默

目的:设计以Rap1b基因为靶点的短发夹状RNA（shRNA）,构建重组慢病毒表达载体并转染食管鳞癌细胞,观察其在食管鳞癌细胞中的表达。方法:应用重组DNA 技术,将设计好的4条基因特异性shRNA序列插至慢病毒表达载体pGLV3-GFP中,构建pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA1/2/3/4。并应用脂质体法转染293T细胞,进行病毒包装及滴度测定。采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）及Western blot分别从mRNA 和蛋白水平检测转染食管鳞癌细胞株Eca109后Rap1b基因的表达情况。结果:测序证实慢病毒载体构建成功,并测定滴度为1×10⁹TU/ml,pGLV3-GFP-Rap1b-shRNA3/4转染后72h和96h均可显著抑制Rap1b基因mRNA及蛋白的表达。结论:成功构建Rap1b基因的shRNA 慢病毒载体,所介导的RNAi能有效抑制食管鳞癌细胞Eca109中Rap1b基因的表达。     

膜-细胞骨架联接分子ezrin shRNA 真核表达载体的构建

 目的 构建膜-细胞骨架联接分子(ezrin)特异的RNA干扰质粒载体。 方法 设计转录短发夹状RNA (short hairpin RNAs, shRNA)的DNA 序列,与pSUPER质粒载体连接; 将构建成功的特异性表达载体(pSUPER-ezrin)转染至人乳腺癌MCF-7细胞系,并应用RT-PCR和Western blot检测ezrin的表达。 结果 与MCF-7细胞和转染空白质粒pSUPER细胞相比,转染pSUPER-ezrin表达载体的MCF-7细胞ezrin mRNA和蛋白的表达明显降低。 结论 构建的ezrin特异性shRNA表达载体可有效地沉默ezrin基因,为进一步研究ezrin表达对乳腺癌转移的影响奠定了基础。     

婆罗双树样基因4 shRNA干扰载体的构建及其对THP-1细胞的转染

 目的　构建针对婆罗双树样基因4（SALL4）的特异性shRNA干扰载体,并转染THP-1细胞,以期为更深入了解SALL4对白血病的作用,为后续研究提供实验工具。方法　设计4条针对不同靶点的SALL4特异性siRNA和一条阴性干扰siRNA,分子克隆方法构建pGPU6／GFP／Neo／SALL4 shRNA干扰载体,转染THP-1细胞,比较未转染细胞、阴性干扰转染细胞和4条SALL4 shRNA转染细胞的SALL4表达情况,找出干扰效果最好的SALL4 shRNA。结果　4种SALL4 shRNA均能有效转染THP-1细胞,实时定量PCR（RT-PCR）与Western blotting结果均显示针对靶点mRNA-1122的pGPU6／GFP／Neo／SALL4 shRNA-B干扰效果最佳,SALL4表达减少量最多（P＜0.05）。结论　成功构建SALL4 siRNA干扰载体,可选择SALL4 shRNA-B载体进一步完成对SALL4基因功能的研究工作。     

靶向尿激酶受体uPAR基因的shRNA表达载体的构建及鉴定

背景与目的：尿激酶受体（uPAR）与肿瘤的侵袭和转移密切相关,抑制uPAR的表达,可以抑制肿瘤的转移。本研究构建uPAR基因短发夹RNA（shRNA）的表达质粒,为舌鳞状细胞癌RNA干涉（RNAi）介导的基因治疗打下基础。方法：根据GenBank数据库提供的uPAR基因序列,选择设计合成能转录shRNA的DNA序列,将它们插入真核表达载体pWH1构建重组质粒,用酶切的方法进行鉴定;最后将构建成功的特异性表达载体（pWH1-uPAR）转染至舌鳞状细胞癌,通过RT-PCR、免疫细胞化学和Western blot观察其对舌鳞状细胞癌uPAR mRNA和蛋白水平表达的影响。利用MTT实验检测细胞增殖能力的变化。结果：成功构建了uPAR shRNA表达载体;与Ts细胞和转染空载体pWH1的Ts细胞相比,转染pWH1-uPAR表达载体的Ts细胞uPAR mRNA和蛋白的表达明显降低。MTT结果显示uPAR shRNA对Ts细胞增殖的抑制率为32.9%。结论：设计构建的真核表达载体可以特异性干扰uPAR基因的表达,为进一步研究uPAR基因的功能和舌鳞状细胞癌治疗提供有效的方法和手段。     

RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系的构建

 【摘要】　目的　利用慢病毒介导的RNA干扰（RNAi）技术,建立RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系。方法　设计针对RYBP基因的5条短发夹状RNA（shRNA）序列,构建RYBP shRNA慢病毒重组载体,分别包装成慢病毒颗粒,直接感染HL-60细胞,同时设空载体和阴性对照shRNA慢病毒对照组。通过观察绿色荧光蛋白表达以监测感染效率,经嘌呤霉素（终质量浓度8 μg／ml）筛选出稳定感染细胞。Western blot实验初步鉴定出蛋白水平最低的RYBP shRNA组,用实时定量聚合酶链反应（PCR）进一步检测该组细胞mRNA表达水平。结果　慢病毒感染的HL-60细胞经嘌呤霉素筛选成功,与对照组比较,5条RYBP shRNA组细胞RYBP表达均有不同程度减低（P＜0.01）,其中以shRNA2沉默效果最佳,且shRNA2组的RYBP基因mRNA水平降低了95 %以上（P＜0.05）。结论　慢病毒介导的shRNA2能高效、稳定地沉默RYBP基因的表达,成功构建了RYBP基因稳定沉默的HL-60细胞系。     

shRNA干扰CDX2基因表达对裸鼠结直肠癌肝转移瘤的影响

目的:建立人结直肠癌裸鼠肝转移瘤模型,探讨干扰尾型同源盒基因2(caudal-related homeobox 2,CDX2)基因表达对结直肠癌肝转移瘤的影响.方法:通过慢病毒载体将CDX2-shRNA体外转染人结直肠癌细胞SW480、HT29,筛选建立稳定干扰CDX2基因表达细胞株和阴性病毒细胞株;将稳定干扰CDX2基因表达的结直肠癌细胞(SW480-KD、HT29-KD)、空白对照细胞(SW480-CON、HT29-CON)和阴性对照细胞(SW480-NC、HT29-NC)接种到裸鼠脾下极包膜内,建立裸鼠结直肠癌肝转移瘤模型,每天称量裸鼠体质量并观察其摄食、活动及精神情况;50 d后处死裸鼠,分别从大体水平以及镜下观察肝转移瘤情况.结果:成功构建裸鼠结直肠癌肝转移模型,H-E染色确认为结直肠癌肝转移.各细胞干扰组(SW480-KD、HT29-KD)裸鼠体质量明显低于相应空白对照组和阴性对照组[SW480-KD:(15.02±2.00) vs (18.00±2.48)、(18.03 ±2.05) g;F=3.761,P ＜0.05;HT29-KD:(15.39 ±2.16) vs (17.96 ±2.48)、(18.30±1.87) g;F=3.721,P ＜0.05].SW480-KD组肝转移瘤数目明显多于SW480-CON组和SW480-NC组[(57.83 ±22.56)vs (29.50±16.90)、(28.20±15.40)个;F=4.197,P＜ 0.05];HT29-KD组肝转移瘤数目明显多于HT29-CON组和HT29-NC组[(56.83 ±29.16) vs (26.40±12.76)、(21.00±11.50)个;F=4.467,P＜0.05)].结论:脾注射法裸鼠肝转移模型可作为体内研究基因功能的理想模型;干扰CDX2基因表达可促进结直肠癌SW480和HT29细胞在体内的转移.     

Livin异构体特异性shRNA对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响

目的: 应用构建成功的Livin异构体(BIRC71, BIRC72)短发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA）真核表达载体转染Hela细胞，探讨其对Livin基因的沉默效应及诱导Hela细胞凋亡的作用。方法: 采用脂质体转染法转染Hela细胞，荧光实时定量PCR、Western blotting检测转染前后宫颈癌Hela细胞Livin基因拷贝数和蛋白表达的变化，将shRNA表达载体流式细胞术检测不同时间（24、48、72 h）的细胞凋亡率。结果: 真核表达载体的转染效率48 h较24、72 h高；转染pGenesil1BIRC71、pGenesil1BIRC72后Hela细胞中Livin拷贝数明显减少（P<0.05），蛋白质表达水平显著降低（P<0.05）；流式细胞术检测24、48、72 h凋亡率，转染Livin shRNA组细胞的凋亡率显著高于对照组（P<0.05），随时间延长（24→72 h）凋亡率相应增加。结论: 靶向Livin的shRNA真核表达载体可以有效特异地阻断Livin基因的表达，明显诱导宫颈癌细胞凋亡。     

MDR1短发夹RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

目的构建在哺乳动物细胞中表达MDR1短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)的表达质粒,并初步探讨其对耐药肝癌细胞MDR1 mRNA的抑制作用及抗肿瘤药物耐药性的影响.方法根据Genbank中MDR1 mRNA设计的两条多聚核苷酸序列,退火形成双链DNA,再与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,在脂质体的介导下转染肝癌细胞株BEL-7402/ADM,RT-PCR分析MDR1 mRNA的表达,MTT法检测阿霉素对细胞的半数抑制浓度(IC50).结果PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功,并能明显地抑制BEL-7402/ADM MDR1 mRNA的表达,对阿霉素的耐药指数降低了17.5倍(299.2/17.1).结论构建的pshRNA-MDR1表达质粒能有效地抑制转染细胞MDR1 mRNA,从而提高肿瘤细胞的药物敏感性.     

靶向 CK18 的shRNA表达载体的构建及其对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

目的： 构建靶向人角蛋白18（cytokeratin 18, CK18 ）基因的shRNA真核表达载体,稳定转染人乳腺癌MCF-7细胞株,观察其对MCF-7细胞增殖的影响。 方法： 设计两条靶向 CK18基因 的RNA干扰序列,命名为CK18-shRNA1、CK18-shRNA2,同时设计阴性对照,将合成的寡核苷酸链与Psilencer3.1-H1/Hygro质粒连接形成重组质粒,并经脂质体介导稳定转染MCF-7细胞,G418筛选后扩增获得稳定转染细胞株,分别采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞株中 CK18 mRNA和蛋白的表达,并进一步通过MTT法检测重组表达载体稳定转染对细胞增殖的影响。 结果： 重组表达载体（Psilencer3.1-CK18-shRNA1、Psilencer3.1-CK18-shRNA2和Psilencer3.1-NC-shRNA）经PCR及DNA测序分析证明序列插入正确,经500 μg/ml G418筛选出稳定转染Psilencer3.1-CK18-shRNA的MCF-7细胞,Psilencer3.1-CK18-shRNA2转染可有效抑制MCF-7细胞中 CK18 mRNA和蛋白的表达,而Psilencer3.1-CK18-shRNA1转染不影响MCF-7细胞中 CK18 mRNA和蛋白的表达水平。与阴性对照Psilencer3.1-NC-shRNA组相比,Psilencer3.1-CK18-shRNA2转染可有效抑制MCF-7细胞的增殖\[（0.40±0.01） vs （0.55±0.06）,P<0.05\]。 结论： 靶向 CK18 的shRNA表达载体稳定转染细胞后可抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖。