EBSS饥饿人鼻咽癌CNE-2细胞株诱导自噬的机制研究

目的:观察饥饿状态下永生化正常鼻咽上皮NP69细胞、鼻咽癌CNE-2细胞的自噬变化及自噬与凋亡的相互作用,为Baf-A1在鼻咽癌中的应用前景提供证据。方法:EBSS溶液替代DMEM溶液在NP69和CNE-2细胞中制造体外饥饿环境,Baf-A1抑制细胞自噬。应用Western blot及透射电镜检测细胞自噬,MTT检测细胞存活率,qRT-PCR检测mRNA表达。结果:与NP69细胞相比,EBSS制造的饥饿环境显著促进CNE-2细胞发生自噬,处理24时后出现大量细胞凋亡,100 nmol/L Baf-A1抑制细胞自噬可延缓饥饿诱导的细胞凋亡。qRT-PCR检测结果:EBSS作用下,LKB1、AMPK、ULK1、Beclin1、ATG5 mRNA水平均显著上升(P<0.05)。结论:EBSS通过LKB1/AMPK/mTOR通路显著诱导CNE-2细胞自噬的发生。     

蛋白酶体抑制剂诱导OVCAR3卵巢癌细胞自噬的机制研究

目的:研究蛋白酶体抑制剂诱导OVCAR3卵巢癌细胞的自噬中PI3K通路的作用。方法:MG1 3 2处理OVCAR3细胞后,光镜观察自噬泡的形成。多种蛋白酶体抑制剂处理OVCAR3细胞后,Western blot检测自噬特异性蛋白LC3的变化。PI3K抑制剂(渥曼青霉素与3-MA)联合多种蛋白酶体抑制剂处理OVCAR3细胞,Western blot检测LC3的变化。采用shRNA技术下调OVCAR3细胞的Beclin 1表达,MG132处理细胞,Western blot检测LC3的变化,吖啶橙(AO)染色观察酸性自噬泡的形成。结果:MG132诱导OVCAR3卵巢癌细胞自噬泡形成,多种蛋白酶体抑制剂均可诱导OVCAR3细胞LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化增强。PI3 K抑制剂与蛋白酶体抑制剂联合应用,与单独应用蛋白酶体抑制剂相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化无改变。下调Beclin 1表达后,MG132诱导的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化及酸性自噬泡的形成均无改变。结论:蛋白酶体抑制剂诱导OVCAR3卵巢癌细胞发生自噬是不依赖PI3K途径进行的。     

小白菊内酯对人甲状腺癌细胞BCPAP增殖及自噬的影响

目的:研究小白菊内酯对人甲状腺癌BCPAP细胞的增殖以及自噬水平的影响。方法:通过MTS法检测不同药物浓度的小白菊内酯对BCPAP细胞增殖的作用。倒置显微镜观察不同给药浓度时细胞的形态变化。免疫荧光技术检测LC3的表达情况。Western Blot法检测自噬相关蛋白LC3Ⅱ与Beclin1的变化。结果:小白菊内酯可以抑制BCPAP的增殖,呈时间与剂量依赖性。随着给药浓度的增加,细胞数量逐渐减少,且形态逐渐改变,细胞皱缩、变圆、透亮,能够反映细胞LC3表达的红光逐渐增强。 Western Blot结果显示,LC3Ⅱ与Beclin1的表达均随着给药浓度的增加而增加。结论:小白菊内酯可以提高甲状腺癌BCPAP细胞的自噬水平,且显著抑制细胞的增殖,呈时间与剂量依赖性。     

微管相关蛋白LC3和自噬基因Beclin1在上皮性卵巢癌中的表达及其意义

背景与目的:有研究表明自噬活性的改变与肿瘤的发生、发展有关。诱导自噬性细胞死亡已经成为杀死肿瘤细胞的新策略。本研究检测微管相关蛋白LC3和自噬基因Beclin1在不同卵巢肿瘤组织中的表达情况,探讨其与上皮性卵巢癌发生、发展的相关性及意义。方法:用免疫组化法检测25例良性卵巢肿瘤、25例交界性卵巢肿瘤及75例上皮性卵巢癌组织的LC3和Beclin1表达,并结合临床病理因素进行分析。结果:良性肿瘤组LC3和Beclin1的阳性率(100%、100%)和交界性卵巢肿瘤组LC3和Beclin1的阳性率(96%、84%)都明显高于上皮性卵巢癌组(57%、57%),且差异具有统计学意义(P均<0.001)。LC3在上皮性卵巢癌中的表达与FIGO分期和肿瘤分化程度相关(P=0.017;0.001)。Beclin1表达与上皮性卵巢癌患者FIGO分期相关(P=0.04)。LC3和Beclin1在卵巢上皮癌中的表达无相关性(P=0.875)。结论:LC3和Beclin1在上皮性卵巢癌中的表达下调,自噬活性的改变可能与上皮性卵巢癌的发生、发展相关。     

苦参碱可能通过自噬抑制肺癌A549细胞的增殖

目的:探究苦参碱对肺癌A549细胞的增殖抑制作用及其对自噬的影响。方法:体外培养肺癌A549细胞,分别用不同浓度的苦参碱处理后,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率;倒置显微镜下观察不同浓度苦参碱时A549细胞的形态变化;采用细胞克隆实验检测不同浓度的苦参碱对A549细胞的增殖抑制程度;Western blot 检测自噬相关蛋白Beclin1、p62及LC3A/B的表达水平;透射电镜下观察经苦参碱处理后A549细胞内自噬泡的变化。结果:苦参碱对肺癌A549细胞有明显的抑制作用,并且呈剂量依赖性;倒置显微镜下发现经苦参碱处理后肺癌A549细胞皱缩、变小、胞内可见大小不一的颗粒状物质;随着苦参碱浓度的增加,肺癌A549细胞形成的克隆集落逐渐变小、变少;Western blot 检测自噬相关蛋白Beclin1、p62及LC3A/B的水平均随着苦参碱浓度的增加而增加,并呈剂量依赖性;透射电镜下观察到苦参碱处理的肺癌A549细胞内自噬空泡明显增加,并且可观察到吞噬线粒体的自噬泡。结论:苦参碱可抑制肺癌A549细胞的增殖,并能诱导细胞内自噬的发生及损伤自噬降解通路,因此我们推测苦参碱可能通过自噬造成细胞内物质和能量的循环紊乱从而抑制肺癌A549细胞的增殖。     

细胞自噬在胃癌中的相关研究进展*

细胞自噬指细胞利用溶酶体降解细胞质中错误折叠的蛋白质及受损细胞器等以重新利用胞内的降解物质、降解胞内有害物质的过程,以维持细胞内环境稳定。正常状态下细胞的自噬维持在低水平,当细胞处在不利因素条件下时,自身自噬也会被激活应对不利因素。自噬在肿瘤发生、发展、转移、复发、药物抵抗等方面有着重要作用,但自噬在这些方面的详细机制仍不清楚。本文对胃癌细胞中自噬相关基因的表达情况及利用自噬促进胃癌细胞死亡等方面进行阐述,自噬治疗在胃癌中具有重要的应用前景。      

自噬基因Beclin1在卵巢癌中的研究进展

卵巢癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一,以手术、铂类和紫杉烷类药物为主的治疗方案已被确立为卵巢癌治疗的标准,但其死亡率仍位居妇科肿瘤之首。自噬是一种高度保守的细胞代谢过程,参与细胞的病理、生理等过程。近年来研究发现自噬与肿瘤有重要而复杂的关系。Beclin1是自噬体形成过程中重要的靶点,具有抑制肿瘤生长的作用,但目前Beclin1与卵巢癌的关系尚不清楚。本文将从Beclin1与卵巢癌发生发展、治疗及耐药的关系这三个方面进行综述,以期为卵巢癌早期诊断及肿瘤的治疗提供新的思路。     

自噬基因Beclin1与上皮性卵巢癌发生、发展的相关性研究

背景与目的:有研究表明自噬的抑制与肿瘤的发生有关,沉默自噬基因Beclin1可导致多种恶性肿瘤的发生.本研究探讨Beclin1基因在上皮性卵巢癌发生、发展中的作用,并分析其过表达对人卵巢癌细胞株SKOV3体外生长的影响.方法:用免疫组化检测25例正常卵巢组织、25例良性上皮性卵巢肿瘤、19例交界性上皮性卵巢肿瘤及69例上皮性卵巢癌组织的Beclin1表达;构建真核表达载体pcDNA3.1/Beclin1,脂质体法分别将质粒pcDNA3.1/Beclin1、pcDNA3.1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,用MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,并用流式细胞仪检测凋亡情况.结果:正常卵巢组织和良性卵巢肿瘤组织中Beclin1表达的积分光密度(integrated optical density,IOD)值均较高,两者之间的差异无显著性(P＞0.05);交界性卵巢肿瘤组织中Beclin1的表达降低,而在上皮性卵巢癌中Beclin1表达的IOD值最低,与正常卵巢组织比较差异有显著性(P＜0.05).ocDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后细胞生长抑制率为(68.75±5.10)%,而pcDNA3.1转染组为(10.91±4.20)%,两者之间差异有显著性(P＜0.05).pcDNA3.1/Beclin1转染后72 h SKOV3细胞的凋亡率为19.07%,高于pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P＜0.05).结论:Beclin1在上皮性卵巢癌中的表达下调,可能与上皮性卵巢癌的发生、发展有关;自噬基因Beclin1的过表达可抑制人卵巢癌细胞SKOV3的增殖,并诱导其凋亡.     

自噬因子Beclin 1和LC3表达与胃癌临床病理特征的相关性研究

目的 探讨自噬因子Beclin 1和LC3表达与胃癌临床病理特征的相关性.方法 采用免疫组织化学方法,检测胃癌组织中自噬因子Beclin 1和LC3的表达情况.结果 Beclin 1蛋白在胃癌组织中的表达率为42.5%(51/120),在癌旁组织其表达率为93.3%(112/120),两者比较有显著性差异(χ2=21.3,P<0.05);LC3蛋白在胃癌组织中的表达率为90.0%(108/120),明显高于癌旁组织的表达率(29.3%,34/120),两者有显著性差异(χ2=24.8,P<0.05).Beclin 1和LC3蛋白表达与胃癌肿瘤分化程度和淋巴结转移密切相关,P<0.05.结论 自噬因子Beclin1和LC3表达可能与胃癌的发生发展有关.     

紫杉醇诱导子宫颈癌H eLa细胞自噬性凋亡的观察

目的观察紫杉醇对体外培养的子宫颈癌HeLa细胞自噬性凋亡的影响,并初步探讨其可能的机制。方法不同浓度（1.2、6、12、24、36 mg/L）的紫杉醇处理体外子宫颈癌HeLa细胞6、12、24、48、72小时后,用MTT法测定其生长抑制率,倒置显微镜及透视电镜观察细胞形态学变化,通过流式细胞术分别测定细胞凋亡率、细胞周期分布,RT-PCR检测自噬基因Beclin1表达的变化情况。结果紫杉醇呈剂量和时间依赖性抑制子宫颈癌HeLa细胞增殖;紫杉醇12 mg/L处理的HeLa细胞,早期（24小时内）可出现明显的细胞自噬性变化,细胞凋亡数明显增加,G2/M期阻滞,且自噬基因Beclin1的表达明显增高。结论紫杉醇具有抑制子宫颈癌HeLa细胞增殖、诱导细胞自噬性凋亡等作用,诱导子宫颈癌HeLa细胞发生自噬性凋亡,其机制可能与上调自噬基因Beclin1的表达水平有关。     

沉默表皮生长因子受体的表达对肺腺癌A549细胞自噬的影响

目的：研究降低表皮生长因子受体（EGFR）的表达对肺腺癌A549细胞自噬活性的影响。方法：A549细胞中加入EGF处理,分为4组,即未处理组和10、25、50 ng/mL EGF处理组,用Western blot方法检测EGFR的蛋白表达;采用转染siRNA降低肺腺癌细胞A549细胞EGFR的表达,将A549细胞分为4组,即未处理组、EGFR siRNA-1组、EGFR siRNA-2组和EGFR siRNA-3组,分别采用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测EGFR mRNA和蛋白表达水平来评价3个siRNA的沉默效果;将A549细胞分为转染EGFR siRNA组、转染空载体组、转染试剂组（只加入等量转染试剂）及未处理组,且4组均加入等量的50 ng/mL EGF,用Western blot检测LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达,观察沉默EGFR表达对自噬活性变化;A549细胞分为转染EGFR siRNA组和转染空载体组,用透射电子显微镜观察自噬小体。结果：转染siRNA后A549细胞EGF蛋白的表达降低,LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的转化水平升高（P < 0.05）,细胞内出现较多自噬小体,自噬活性明显增加。结论：降低EGFR的表达可以提高肺腺癌A549细胞自噬活性。     

Autophagy-based survival prognosis in human colorectal carcinoma

The role of autophagy in cancers is controversial. Here we aim to determine the prognostic significance of autophagy in colorectal carcinoma patients, thereby allowing more rational development of therapeutic strategies. Through transmission electron microscopy, our data first demonstrated high frequency of defective mitochondria was strongly associated with poor overall survival in colorectal carcinoma. Next immunohistochemical study showed the expressions of Beclin 1, LC3B and Bcl-xL in both the center of tumor and adjacent noncancerous mucosal region were also correlated with overall survivals. We developed an autophagy signature for prognosis based on these three major autophagic proteins, further analysis suggested it was an independent prognostic biomarker and had its value even within single clinical stage. Combined TNM stage and this signature could significantly improve the accuracy of survival prognosis. To validate these immunohistochemical results, an internal testing cohort and an independent population were also included. Our findings suggest that autophagy plays an important role in the clinical cancer progression. Therefore autophagic proteins may be valuable prognostic biomarkers in the therapy of colorectal carcinoma and possibly other types of cancers.     

Beclin 1 在 MG132 抗 OVCAR3 卵巢癌细胞中的变化及作用研究简

目的：研究Beclin1在MG132抗OVCAR3卵巢癌细胞中的变化及作用。方法：OVCAR3细胞经小同浓度MG132处理24h后,MTT法检测细胞存活率,Western blot法检测自噬相关Beclin1蛋白的变化。采用细胞转染技术过表达卵巢癌细胞中Beclin1,MG132处理24h后,MTT法检测细胞存活率;Hoechst33258进行核染色观察染色质浓缩和核碎片等凋亡特征性形态学改变。采用shRNA技术下调OVCAR3细胞的Beclin1表达,MG132处理细胞,AO染色观察酸性自噬泡的形成。结果：与空白对照组比较,1、2、5和10μmol/L浓度的MG132作用24h均能明显抑制OVCAR3细胞的生长（均P〈0．05）,5μmol／L浓度接近半抑制率;而且5μmol／L和10μmol／L浓度的MG132作用24h能显著诱导OVCAR3细胞的Beclin1蛋白水平下降（P=0．001）。与卒质粒转染组对比,过表达Beclin1的卵巢癌细胞在MG132处理后核的凋亡明显增加;细胞存活率明显降低,（P=0．00089）。下调卵巢癌细胞中Beclin1表达后,MG132诱导的酸性囊泡蓄积无改变。结论：MG132使OVCAR3细胞中Beelin1降低,Beclin1具有增强MG132抗OVCAR3的作用,但该怍用与自噬无关。     

Prognostic impact of Beclin 1, p62/sequestosome 1 and LC3 protein expression in colon carcinomas from patients receiving 5-fluorouracil as adjuvant chemotherapy

Autophagy is a cellular degradation process that can be activated in tumor cells to confer stress tolerance. During autophagy initiation and autophagosome formation, Beclin 1 binds microtubule-associated protein-1 light chain 3 (LC3I) that is converted to its membrane-bound form (LC3II) and interacts with the ubiquitin-binding protein p62/sequestosome 1 (SQSTM1). We determined the association of Beclin 1, LC3 and p62 protein expression with clinical outcome in resected stage II and III colon carcinomas (n = 178) from participants in 5-fluororuacil (5-FU)-based adjuvant therapy trials. The immunopercentage for each marker was determined and dichotomized for analysis with overall survival (OS) using Cox models. We found that autophagy markers localized to the tumor cell cytoplasm and showed increased expression relative to normal epithelial cells. Overexpression of Beclin 1, LC3 and p62 proteins were detected in 69%, 79% and 85% of tumors, respectively. Expression levels were not significantly associated with clinicopathological variables. In a multivariable analysis adjusting for tumor grade, stage and patient age, Beclin 1 overexpression was independently associated with worse OS [hazard ratio (HR), 1.82; 95% confidence interval (CI), 1.0–3.3; p = 0.042] in patients who received 5-FU-based adjuvant therapy. Neither LC3 nor p62 overexpression was prognostic. In conclusion, Beclin 1 overexpression was associated with reduced survival in colon cancer patients treated with adjuvant 5-FU. These data are consistent with preclinical evidence indicating that autophagy can protect colon cancer cells from 5-FU and support the targeting of autophagy for therapeutic advantage in this malignancy.