信号肽和辅助性T细胞表位以及GST表位增强猪带绦虫保护性抗原诱导免疫应答的初步研究

目的：研究信号肽和辅助性T细胞表位以及GST表位增强猪带绦虫保护性抗原诱导的免疫应答。方法：在猪绦虫融合抗原pCC27(本室从六钩蚴cDNA表达文库筛选的三个保护性抗原经拼接所得)基因片段5′末端引入人IL-2信号肽、一个通用型辅助性T淋巴细胞表位，谷胱甘肽还原酶的T和B淋巴细胞表位(TGG)，经pGEX4T-2表达鉴定，序列分析后构建成DNA疫苗，通过肌肉注射途径将这种DNA疫苗免疫小鼠。结果：这种含辅助表位的DNA疫苗诱导的免疫应答效果明显超过对照组，对绦虫卵攻击的保护率为90％。结论：构建了含绦虫融合抗原pCC27及TGG的核酸疫苗，动物试验结果表明．TGG表位既可提高IgG、IgG1、IgG2a的水平，又进一步增强Th1和Th2细胞间的平衡关系。免疫小鼠对绦虫卵的攻击具有很好的保护作用。     

幽门螺杆菌双亚单位表位疫苗的构建及免疫原性研究

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)黏附素(HpaA)和尿素酶B亚单位(UreB)双亚基多表位疫苗,并对其免疫原性进行研究。方法设计引物采用PCR法将黏附素(HpaA)的一个B细胞表位与尿素酶B亚单位的三个TH表位及一个B细胞表位串联起来(HUepi),表位之间用两个赖氨酸(KK)间隔,T-A克隆后构建融合基因表达质粒pET-22b( )-HUepi,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,重组蛋白采用阳离子和疏水层析进行纯化,经鉴定后皮下免疫BALB/c小鼠,检测细胞免疫应答及体液免疫应答。结果PCR法扩增出了约233bp的目的片段;原核表达质粒pET-22b( )-HUepi经酶切及测序鉴定,目的基因序列与设计序列一致;重组蛋白HUepi表达率约20.0%,PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约8.38×103Dr,破菌后电泳证实目的蛋白以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度大于97.6%,经N端测序证实为设计的表位疫苗蛋白,TH表位多肽、表位疫苗蛋白及rUreB均能够刺激表位疫苗致敏的小鼠淋巴细胞增殖(SI>2),并且此疫苗能够刺激机体产生特异性抗体。结论Hp HpaA、UreB双亚基表位疫苗HUepi经基因克隆获得了较高的表达量,并初步显示了较好的免疫原性。为新一代Hp疫苗的研制奠定实验基础。     

弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护性研究

目的以弓形虫多表位抗原基因DNA疫苗免疫小鼠,评价该疫苗对弓形虫感染产生的免疫保护作用。方法利用PCR技术和亚克隆技术,构建弓形虫多表位抗原基因真核表达重组质粒pcDNA3-MAG,以质粒纯化试剂盒大量制备质粒,同时分别以载体质粒pcDNA3和PBS液为空质粒对照和空白对照,与lipofectin按5∶2的比例混合后,经股四头肌注射免疫小鼠,间隔两周,连续免疫3次,通过检测小鼠血清中特异的IgG抗体、IFN-γ和IL-4含量,评价疫苗产生的体液免疫和细胞免疫水平。以强毒型RH株弓形虫感染免疫小鼠,统计小鼠的存活时间,评价疫苗产生的免疫保护性。结果经双酶切及DNA测序鉴定,所构建的重组质粒pcDNA3-MAG读码框架正确。与免疫前及载体质粒和空白对照组相比,小鼠免疫后产生特异性IgG抗体,并引发高水平IFN-γ。攻虫后,实验组较对照组小鼠存活时间明显延长。结论弓形虫多表位抗原基因DNA能诱导BALB/c系小鼠产生特异的细胞免疫和体液免疫,对弓形虫感染可产生一定的免疫保护性。     

弓形虫GJS株表面抗原1基因的原核细胞表达及其抗原性分析

目的构建弓形虫GJS株表面抗原1（SAG1）重组表达质粒,研究SAG1蛋白疫苗诱导的保护性免疫作用。方法根据RH株弓形虫SAG1基因序列设计1对引物,利用PCR方法获得SAG1基因,克隆入pMD18-T载体,测序后进行序列分析;重新设计引物将其亚克隆至原核表达载体pET-30a中,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达;重组抗原经纯化和复性后免疫小鼠,ELISA法测定其抗体滴度的变化,并用弓形虫速殖子攻击检测免疫保护力。结果与已知的SAG1基因核苷酸序列（$76248）及其编码氯基酸序列的同源性分别为99％、97％;表达的SAG1蛋白以包涵体形式存在,该重组抗原能被羊抗弓形虫阳性血清所识别;经间接ELISA检测,小鼠免疫后产生了较高的抗体;动物保护性实验表明,虽然与对照组相比免疫组小鼠存活时间有一定的延长,但差异无显著性。结论成功构建了弓形虫SAG1重组表达质粒,SAG1蛋白疫苗诱导小鼠的免疫保护力不强。     

诱导T细胞免疫反应的日本血吸虫抗原表位的重组表达与免疫原性鉴定

目的  对预测的日本血吸虫T细胞免疫反应表位进行合成与融合表达，并对其免疫原性进行分析。方法根据3个表位(P7、P17、P18)的基因序列，人工合成正、负链寡核苷酸序列，使正链的5 7端带有Nco I酶切位点，负链的3‘端带有Xho I酶切位点。将每条表位肽的正、负寡核苷酸链退火形成双链DNA后，定向克隆人表达载体pET32c(+)，电转化至E．coli DH5a，经PCR、酶切及DNA序列分析鉴定出分别含有P7、P17、P18序列的重组质粒。提取重组质粒转化至E. coli BL21(DE3)中，用异丙基硫代f3-D半乳糖苷对表位肽融合蛋白进行诱导表达，经12%十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析。表位肽融合蛋白用Niz+螯合亲和层析胶纯化。同时根据P7、P17及P18的氮基酸序列人工合成这3个表位肽段。用纯化的表位融合蛋白、人工合成的表位肽体外刺激紫外线致弱尾蚴免疫C57BL/6J小鼠脾细胞，3H-TdR掺入法检测其刺激淋巴细胞的增殖效果。结果P7、P17、P18 3个表位肽基因序列被成功克隆到pET32c(+)中并获得重组质粒，重组质粒均能表达大小约20 kDa的融合蛋白。表达产物用Ni2+亲和层析胶纯化后获得纯化的肽融合蛋白。表位P7、P17重组蛋白或合成肽均能有效刺激小鼠淋巴细胞增殖。结论P7、P17肽段是日本血吸虫的T细胞抗原表位。     

西尼罗病毒多表位基因免疫保护研究

目的探讨西尼罗病毒多表位基因诱导体液及细胞免疫的可行性及其免疫攻毒保护作用。方法将西尼罗病毒多抗原表位基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-M。通过脂质体转染法将该多表位基因导入BHK细胞中,采用RT-PCR和IFA检测其在细胞内的瞬时表达。将重组质粒通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过间接免疫ELISA法、CTL杀伤功能检测和淋巴细胞增殖试验等,检测小鼠体内特异性体液免疫和细胞免疫的水平。在此基础上进行攻毒试验,分析重组质粒DNA对西尼罗病毒攻击的免疫保护作用。结果重组质粒pcDNA3.1-M能够在真核细胞内表达,采用IFA方法能在细胞内检测到西尼罗病毒特异性抗原。在抗原的刺激下,免疫后的小鼠脾淋巴细胞增殖显著,可诱导特异性CTL应答反应。攻毒试验显示,重组多表位基因能够对西尼罗病毒的攻击起到一定的保护作用,达到50%,中和抗体效价达到1∶50,应用免疫佐剂或应用重组蛋白加强免疫后,其保护率为62.5%,中和抗体效价达到1∶90。结论西尼罗病毒多表位基因可诱发特异性免疫应答,对西尼罗病毒感染具有保护作用,为其基因疫苗研制提供了一定的实验依据。     

细粒棘球蚴谷胱甘肽s-转移酶重组抗原的高效融合表达、纯化及免疫特性的研究

目的构建细粒棘球蚴重组蛋白谷胱甘肽s-转移酶(EgGST)的表达载体,获得纯化的重组蛋白,并对其免疫学特性进行初步鉴定,为重组疫苗研制的后续工作提供依据。方法从本室已构建的重组质粒GST/pGEM-T中酶切下GST目的片段,亚克隆入表达载体pET28a,转化入大肠杆菌BL21plys进行融合表达,经His-bind树脂纯化系统小量纯化,得到纯化的重组融合蛋白作为抗原。免疫ICR小鼠,获得抗血清。通过蛋白免疫印迹试验(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测重组抗原的免疫学特性。结果成功构建具有高效表达能力的基因工程菌株,并纯化了重组蛋白,纯化的重组抗原免疫小鼠的抗血清可识别天然与重组抗原,实验组血清与对照组血清抗体含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论重组蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。     

日本血吸虫组织蛋白酶B DNA疫苗与IL-4真核表达质粒联合免疫诱导小鼠保护性的研究

目的　观察日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗与IL 4真核表达质粒联合免疫小鼠的效果。　方法　将小鼠IL 4基因PCR扩增片段克隆入真核表达载体pcDNA3以构建重组表达质粒。小鼠分为 4组 ,每组 12只 ,实验组 (A)每鼠肌注组织蛋白酶BDNA疫苗和IL 4表达质粒各 10 0 μg ,同时设立组织蛋白酶BDNA疫苗对照组 (B)、IL 4表达质粒对照组 (C)和空载体对照组 (D) ,共免疫 3次。 2周后用免疫组化检测表达质粒在小鼠肌细胞的表达 ,3周后经皮肤攻击感染小鼠 40± 1条日本血吸虫尾蚴。计算减虫和减卵率 ,观察免疫保护性。　结果　重组IL 4质粒和组织蛋白酶BDNA疫苗均在小鼠肌细胞表达。用重组IL 4质粒和组织蛋白酶BDNA疫苗联合免疫诱导小鼠产生 43 .2 0 %的减虫率和 76.63 %的减卵率 ,与组织蛋白酶BDNA疫苗单独免疫比较差异均有显著性 (P <0 .0 0 1,P <0 .0 5 )。　结论　联合IL 4表达质粒免疫可能提高日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗的抗血吸虫保护性免疫。     

带有HA标签的HBc蛋白真核表达质粒的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的构建带有流感病毒血凝素9钛表位标签（HA标签）的乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（HBc）的表达质粒,为进一步研究HBe蛋白基因的功能奠定实验基础。方法设计并合成扩增HBc蛋白全长的PCR引物,以野生型的HBV质粒pDolTHBV-1为模板,PCR扩增全长的HBc蛋白,大小为563bp;PCR产物经过Eco砒和XholI酶切后,与线性化的pcDNA3／HA载体连接后转化大肠杆菌,扩增、纯化获得所需质粒,以琼脂糖凝胶电泳、酶切鉴定以及基因测序鉴定其分子质量和插入片段的序列;构建的质粒转染HEK293细胞48h后,RIPA裂解细胞,Western blot检测HBc蛋白表达。结果纯化质粒的相对分子质量为5．9kb,酶切鉴定结果符合目的条带（563bp）大小,插入的寡核苷酸序列与野生型HBV基因序列完全相符,表达的融合蛋白大小为28kDa。结论成功构建了带有HA标签的HBc蛋白的真核表达质粒pcDNA3／HA—HBc蛋白,为进一步研究HBe蛋白的功能奠定了良好的实验基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

Antibody responses and epitope specificities to the Taenia solium cysticercosis vaccines TSOL18 and TSOL45-1A

Taenia solium is a cestode parasite that causes cysticercosis in humans and pigs. This study examined the antibody responses in pigs immunized with the TSOL18 and TSOL45-1A recombinant vaccines against T. solium cysticercosis. Immunization with these proteins induced specific, complement-fixing antibodies against the recombinant antigens that are believed to be associated with vaccine-induced protection against T. solium infection. Sera from immunized pigs were used to define the linear B-cell epitopes of TSOL18 and TSOL45-1A. Prominent reactivity was revealed to one linear epitope on TSOL18 and two linear epitopes on TSOL45-1A. These, and oncosphere antigens from other taeniid cestodes, contain a protein sequence motif suggesting that they may show a tertiary structure similar to the fibronectin type III domain (FnIII). Comparison of the location of linear antigenic epitopes in TSOL18 and TSOL45-1A within the proposed FnIII structure to those within related cestode vaccine antigens reveals conservation in the positioning of the epitopes between oncosphere antigens from different taeniid species.     

Identification of CD4+ T cell epitopes of Taenia solium paramyosin

T cell mediated response is involved in a protective immune response against experimental cysticercosis conferred by immunization with Taenia solium paramyosin (TPmy) to BALB/c mice. In this study, we analysed the TPmy amino acid sequence for predicted CD4+ T cells epitopes. Five different regions of this protein showed that the residues anchor to bind the I-Ad molecule, synthetic peptides containing these epitopes were evaluated for their ability to induce lymphoproliferative responses of spleen cells from TPmy immunized mice. Among them, Tp176 (amino acids 176-192 sequence DDLQRQMADANSAKSRL) was the immunodominant T cell epitope of TPmy. Delineation of this epitope should facilitate analysis of the role of CD4+ T cell response in experimental cysticercosis.     

白念珠菌mp65基因真核质粒的构建及免疫原性研究

目的构建以白念珠菌甘露糖蛋白65(MP65)编码基因mp65为目的基因真核重组表达质粒,并对其免疫原性进行分析。方法PCR法自白念珠菌标准菌株ATCC64550中获取mp65基因,分别插入真核表达载体pcDNA3.1中,将真核表达经质粒大抽提并定量后免疫BALB/c小鼠,ELISA法检测抗体产生水平,流式检测细胞免疫。结果PCR法克隆出全长为1140bp的mp65基因,构建出pcDNA3.1-mp65真核表达质粒,pcDNA3.1-mp65免疫小鼠能诱导产生效价为1∶800的IgG抗体,同时诱导CD4+T和CD8+T细胞百分含量增高。结论白念珠菌真核表达质粒pcDNA3.1-mp65成功构建并能诱导小鼠的体液免疫和细胞免疫。     

口服丙型肝炎复合多表位DNA减毒鼠伤寒沙门活菌苗的实验研究

目的　利用减毒鼠伤寒沙门菌作为载体,探讨丙型肝炎病毒（ＨＣＶ） 口服ＤＮＡ 疫苗的可行性。方法　把ＨＣＶ 复合多表位抗原基因ＰＣＸ 克隆到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３（ＣＭＶ 启动子） ,构建ＨＣＶ 真核表达载体ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ,转化减毒鼠伤寒沙门菌ＳＬ３２６１ ,获得ＨＣＶ 重组口服ＤＮＡ 活菌苗ＳＬ３２６１ （ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ） ,免疫小鼠及家兔后,检测特异性免疫应答及安全性。结果　ＳＬ３２６１（ｐｃＤＮＡ３／ＰＣＸ） 在小鼠及家兔中均可诱发低水平的特异性体液免疫及细胞免疫应答,免疫动物未见明显的毒性反应。结论　ＨＣＶ 口服减毒鼠伤寒沙门菌ＤＮＡ 疫苗可诱发特异性的免疫应答,为ＨＣＶ 疫苗的研究提供新的理论及实验依据     

恶性疟原虫CSP基因重组蛋白及DNA免疫诱导小鼠体液免疫应答比较

本文利用恶性疟原虫FCC1/HN株环子孢子蛋白 (PfCSP)基因DNA质粒通过不同途径、不同剂量免疫小鼠 ,观察其产生的体液免疫应答反应 ,并将其与相应的重组表达蛋白疫苗进行比较。结果显示 :DNA免疫刺激机体产生抗体反应强度的免疫途径依次为肌肉、静脉和皮下 ;宿主对DNA免疫存在一定的剂量依赖性 ;ELISA和Dot -ELISA检测免疫后 4周和 7周 ,DNA质粒组刺激机体产生抗体的滴度均显著低于相应的重组蛋白组。表明PfCSPDNA疫苗与重组表达蛋白疫苗均可刺激小鼠产生特异性体液免疫应答 ,但前者诱导高滴度的抗体反应需要更长的时间     

The humoral immune responses elicited in mice by inoculations with a recombinant protein or DNA based on the circumsporozoite-protein gene of Plasmodium falciparum

The humoral responses elicited in mice by inoculation, in various doses and by several routes, with plasmid DNA containing the gene coding for the circumsporozoite protein (CSP) of Plasmodium falciparum FCC1/HN were compared with those evoked by inoculation with a recombinant expressed protein based on the CSP. With the DNA vaccine, intramuscular inoculations appeared the most effective, followed by intravenous and then subcutaneous injections, the responses in each case being dose-dependent. In both standard ELISA and dot-ELISA, sera from the mice immunized with the DNA were found to have much lower titres of antimalarial antibodies than the corresponding sera from mice immunized with the recombinant protein. Although both 'vaccines' elicited humoral immune responses in BALB/c mice, that based on plasmid DNA took much longer than the recombinant protein to induce high-titre antibody responses.     

猪带绦虫抗原基因TS76的克隆及原核表达

目的　测定和分析自猪囊尾蚴表达型cDNA文库中筛选出的cDNA克隆 (TS76 )的序列 ,并进行该片段的原核表达研究。方法　采用PCR扩增重组 (噬菌体 (TS76中的TS76cDNA片段 ,亚克隆至 pUC18,得到的重组子用于测序 ,并对测定结果进行分析及同源性比较 ;将TS76片段亚克隆到原核表达载体pGEX - 1(T中 ,免疫印迹方法筛选得到能正确表达TS76片段的重组子 pGTS76 ;制备pGTS76原核表达产物 ,进行浓度梯度SDS -PAGE和Westernblotting分析。 结果　TS76克隆含 5 16对核苷酸 ,编码含 83个氨基酸残基的多肽 ,与EMBL数据库中的猪囊虫免疫原性蛋白质mRNA有 383bp的同源区域。重组质粒在大肠杆菌中表达的融合蛋白分子量为 34KD ,能与抗猪囊尾蚴兔血清产生很强的免疫反应。结论　分离到一个编码具较强免疫原性猪囊尾蚴抗原的基因。     

猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达

目的 在成功构建猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的基础上,研究猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因在长双歧杆菌中的表达情况。方法 将猪带绦虫大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转化入长双歧杆菌, IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot分析表达情况。结果 酶切、PCR和测序证实,重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18成功转入长双歧杆菌。SDS-PAGE显示,重组蛋白相对分子质量(M_r)约为55 kD,与预期结果相一致。Western blot显示,重组蛋白能被兔抗血清、囊虫病猪血清和囊虫病患者血清所识别。结论 猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因能够在长双歧杆菌中获得表达,表达的重组蛋白具有特异的抗原性。