小干扰RNA对鼻咽癌CNE-2细胞Bcl-2基因的放射增敏研究

目的:探讨Bcl-2基因的特异性小干扰RNA(siRNA)对鼻咽癌细胞的辐射增敏作用.方法:构建Bcl-2基因的特异性siRNA的真核表达载体,并借助脂质体将其转入鼻咽癌CNE-2细胞.荧光显微镜观察转染效率;流式细胞仪检测Bcl-2蛋白在鼻咽癌细胞的表达,并检测CNE-2细胞的凋亡率;流式细胞仪检测Bcl-2基因的特异性siRNA真核表达载体联合X射线照射后CNE-2细胞的凋亡率.结果:流式细胞仪检测结果显示:转染组明显降低了Bcl-2蛋白在CNE-2细胞的表达,且转染组的细胞凋亡率明显增加.转染联合X射线照射后细胞凋亡率也明显增加,且明显高于阴性对照+X射线组和单纯X线照射组.结论:siRNA可以有效干扰鼻咽癌CNE-2细胞内Bcl-2基因的表达,可明显增强鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性.     

核转录因子-κB在肝细胞生长因子介导的肝干细胞抗凋亡效应中的作用

目的:研究核转录因子-κB(NF-κB)在肝细胞生长因子(HGF)介导WBF-344细胞凋亡信号转导调控中的作用。方法:为明确HGF对肝干细胞的抗凋亡作用,在加或不加HGF情况下WBF-344细胞用放线菌素D(ActD)20ng/mL、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导细胞凋亡,DNA电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡。为检测NF-κB的活性,用NF-κB报告基因质粒BD Great EscA PeTMSEAP vector瞬时转染WBF-344细胞,通过BD Great EscAPeTMSEAP荧光检测系统检测NF-κB的转录活性。为明确NF-κB活化在HGF介导抗凋亡效应中的作用,我们用NF-κB抑制剂如BAY-11-7082和aspirin(ASA)预处理WBF-344细胞,然后用HGF刺激,再通过ActD20ng/mLTNF-α诱导细胞凋亡效应。为证实这一结论,我们用NF-κB抑制质粒转染WBF-344细胞,筛选稳定表达株。转染细胞用HGF刺激48h,然后检测抗凋亡效应。结果:TNF-α可以诱导ActD致敏的WBF-344细胞凋亡。HGF对WBF-344细胞的凋亡具有保护作用。HGF能够明显促进NF-κB活...     

卡介苗体外诱导鼻咽癌CNE-2Z细胞ICAM-1表达

摘要：目的：探讨卡介苗（bacillus CalmetteGuerin,BCG）对鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）CNE-2Z细胞及细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule1,ICAM-1）表达的影响及可能的调控机制。 方法：显微镜观察细胞形态学变化和记录细胞被胰蛋白酶完全消化所用时间;流式细胞术检测细胞表面ICAM-1表达;免疫细胞化学检测细胞NF-κB表达,western blot检测ICAM-1、NF-κB表达。 结果：BCG作用24、48和72 h细胞对培养介质的粘附力增加,且被胰蛋白酶完全消化所用的时间明显长于对照组［(5.8±0.4)、(7.8±0.4)、(8.8±0.4) min vs (5.0±0.5) min,F=22.01,P<0.01］;流式细胞术检测24、48和72 h组ICAM-1表达的平均荧光强度（MnX）明显高于对照组［(25.2±0.4)、(28.7±1.1)、(37.2±1.6) vs(23.4±0.9), F=112.34,P<0.01］;免疫细胞化学结果表明,BCG作用72 h组NF-κB表达水平高于对照组。western blot结果表明,各组NF-κB和ICAM-1表达均明显高于对照组。 结论：BCG体外诱导鼻咽癌CNE-2Z细胞ICAM-1表达,且该过程可能与NF-κB信号途径有关。     

鼻咽癌细胞放射敏感性与Bcl-2及Bak表达的关系

目的:探讨鼻咽癌细胞株放射敏感性与Bcl-2及Bak蛋白表达的关系。方法:利用免疫荧光技术及流式细胞仪检测Bcl-2及Bak蛋白在两株鼻咽癌细胞株中的表达,并检测照射后Bcl-2、Bak的阳性表达率以及细胞凋亡率。结果:免疫荧光显示两株鼻咽癌细胞中均存在Bcl-2及Bak蛋白的表达,并主要定位于细胞浆中;照射前两株鼻咽癌细胞Bcl-2的表达率分别为CNE-1(87.6±1.2)%,CNE-2(87.7±0.8)%,Bak的表达率分别为CNE-1(11.5±0.8)%,CNE-2(13.5±0.9)%;照射后两株鼻咽癌细胞的凋亡率及Bak的表达随时间变化呈上升趋势,二者呈正相关,而Bcl-2的表达变化与细胞凋亡率的变化无明显相关。结论:在鼻咽癌细胞株CNE-1及CNE-2中,细胞的内在放射敏感性与Bak的表达相关,而与Bcl-2的表达无明显相关。     

NF-kB在冠心病中的表现

目的研究冠心病的病人外周血单个核细胞中NF-κB水平的变化。方法用凝胶迁移率试验(EMSA)检测冠心病患者60例和健康对照组14例静脉血单个核细胞中的NF-κB中的含量。结果冠心病组的NF-κB相对于健康对照组,明显升高,有显著性差异(31.07±15.98vs4.41±3.88,P<0.01)。结论冠心病病人除了有炎症反应蛋白的增加,还有早期的炎症前细胞激动因子的转录因子NF-κB的激活。     

尿白蛋白诱导肾小管上皮细胞损伤的作用机制研究

目的：研究尿白蛋白诱导肾小管上皮细胞损伤的机制。方法：用去脂的小牛血清白蛋白(BSA)20mg/mL加入肾小管上皮细胞内，EMSA、RT-PCR及流式细胞仪分别检测不同时限核转录因子-κB(NF-κB)活性、骨桥蛋白mRNA表达及细胞凋亡的情况。体外培养的肾小管上皮细胞作为空白对照。结果：去脂的小牛血清白蛋白可刺激肾小管上皮细胞内NF-κB活性增加，骨桥蛋白mRNA表达上调，细胞凋亡率增加。结论：尿白蛋白诱导小管上皮细胞损伤与诱导肾小管上皮细胞内NF-κB活性增加，导致骨桥蛋白mRNA转录上调及细胞凋亡有关。     

多肽cSN50通过核质转运受体Importinα抑制HepG2细胞核因子-KB及其下游因子的表达

目的 研究乙醇、内毒素是否通过核转录因子NF-kappaB即IκB-NF-κB-importinα途径引起细胞炎症、凋亡和诱导下游基因TNF-α、Caspase-3的表达;cSN50作为一种穿膜多肽通过阻断NF-κB与importinα结合,从而抑制NF-κB核转位及其下游基因的表达,起到保护细胞的作用.方法 应用流式细胞仪观察HepG2经不同浓度乙醇、内毒素刺激后的细胞凋亡率;分光光度计法测Caspase-3活性;ELISA法检测细胞培养上清TNF-α;Western blot法检测NF-κB p50、importinα3、IκBα,间接免疫荧光法测p50、IκBα、importinα3的活化水平.结果 乙醇、内毒素刺激后TNF-α、Caspase-3的值量效上与空白对照组比差异均有统计学意义(P均＜0.05),细胞核内p50显著增加(P＜0.05),胞浆IκBα下降(P＜0.05),cSN50( 100 μmol/L)能部分阻断P50的核转位及其下游因子的表达(P＜0.05).结论 急性酒精肝损伤中,NF-κB的核转位在此损伤中起重要作用,cSN50能部分抑制被刺激后的HepG2细胞核中NF-κB活性及其下游基因的表达.     

CXCR4抑制剂AMD3100联合硼替佐米对人淋巴瘤细胞株Ramos增殖、凋亡的影响

目的探讨CXCR4抑制剂AMD3100、硼替佐米对人淋巴瘤细胞株Ramos协同诱导凋亡作用。方法 1检测淋巴瘤患者骨髓单个核细胞中CXCR4及核因子κB(NF-κB)表达水平;2AMD3100、硼替佐米单用以及联合用药分别处理Ramos细胞,利用CCK-8法检测细胞增殖;利用流式细胞术检测细胞凋亡;Wester blot检测NF-κB、Bcl-2、Bcl-xl、c-IAP1及Caspase-3表达水平。结果 1淋巴瘤患者骨髓单个核细胞中CXCR4、NF-κB表达增高;2AMD3100、硼替佐米作用Ramos细胞后,随着药物浓度的增加,对细胞增殖的抑制作用逐渐增强、凋亡增加,两药具有协同作用(P0.05);3AMD3100、硼替佐米单药组NF-κB、Bcl-2、Bcl-xl及c-IAP1表达降低,Caspase-3表达升高,联合用药组作用增强。结论 AMD3100、硼替佐米对Ramos细胞的增殖抑制、凋亡促进具有协同作用,其作用机制可能是通过抑制NF-κB、Bcl-2、Bcl-xl、c-IAP1及增强Caspase-3表达。     

急性胰腺炎患者核因子-κB激活的检测

目的探讨核因子-κB激活在急性胰腺炎患者血液中的表达与时间关系。方法急性胰腺炎患者20例,对照组12例。采用流式细胞术检测外周血中核因子-κB激活。结果胰腺炎组各时段(<24h、24~48h、48~72h、>72h核因子-κB激活明显高于对照组,P<0.05。24h内核因子-κB明显激活(54.07±18.17)%;24~48h达高峰(70.03±5.62)%,48h以后逐渐减弱,一周后NF-κB激活向正常水平接近。对照组各时段核因子-κB激活不明显(P>0.05)。结论急性胰腺炎患者早期外周血中NF-κB明显激活。可望应用NF-κB抑制剂抑制NF-κB激活,控制急性胰腺炎的进展。     

三氧化二砷诱导白血病细胞凋亡与核因子-κB活化的关系

为了研究三氧化二砷（As2O3）诱导白血病细胞凋亡与核因子-κB（NF-κB）活化以及血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶-9（MMP9）表达的关系,应用流式细胞仪Annexin V FITC法检测白血病细胞系K562-n凋亡;采用免疫组织化学方法半定量分析K562-n细胞NF-κB、VEGF、MMP9表达的动态变化.结果显示：As2O3在诱导K562-n细胞凋亡的过程中可活化NF-κB,而VEGF、MMP9的表达也随之增强.地塞米松（DXM）1μmol/L能显著增加As2O3诱导K562-n细胞凋亡的作用和抑制K562-n细胞NF-κB活化,细胞凋亡增加率为43.04%,（P＜0.05）,NF-κB活化抑制率为31.15%（P＜0.05）,VEGF、MMP9变化与NF-κB一致.结论：As2O3诱导K562-n细胞凋亡的过程中可使NF-κB活化,VEGF、MMP9表达亦随之增强;DXM可通过抑制NF-κB活化增强其诱导K562-n细胞凋亡的作用,VEGF、MMP9的表达也随之下降.     

RNAi-chk1在抑制小鼠Lewis肺癌细胞生长作用的实验研究

目的观察chk1-RNAi联合放疗对Lewis肺癌细胞的抑制及凋亡情况。方法以脂质体Lipofectimine-2000介导,将chk1-536的siRNA表达载体转染小鼠Lewis肺癌细胞株,将其分为空白对照组、错义序列组、siRNA组,2Gy照射组、2Gy照射+错义序列组、2Gy照射+siRNA组。应用MTT法检测转染细胞抑制率、流式细胞术分析转染siRNA后细胞的凋亡,并应用RT-PCR检测转染细胞chk1-mRNA表达水平。结果 chk1-siRNA转染联合辐射组的Lewis肺癌细胞,与对照组相比较生长增殖受抑制、细胞凋亡增加;MTT法检测和流式细胞术分析示:chk1-siRNA转染联合辐射组的Lewis肺癌细胞生长增殖受抑制,细胞凋亡增加(P<0.05);同时,RT-PCR法检测该组细胞中chk1mRNA表达量下降(P<0.05)。并且siRNA转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡。结论针对chk-1的RNAi可以提高Lewis肺癌细胞的抑制率及放疗引起的肿瘤细胞的凋亡,对肿瘤有治疗作用,与放疗有协同作用。     

60^Coγ射线照射对心肌细胞蛋白表达的影响

目的研究60^Coγ射线照射对体外培养的大鼠心肌细胞蛋白表达的影响。方法体外培养新生大鼠心肌细胞,分为未照射组（OGy组）、5Gy、10Gy、20Gy照射组,分别用60^Coγ射线0Gy、5Gy、10Gy、20Gy单剂量照射心肌,在照射后48h：（1）用蛋白检测试剂盒检测各组心肌细胞中的总蛋白含量;（2）用流式细胞仪检测检测各组细胞的细胞周期变化;（3）用带绿色荧光蛋白基因的腺病毒（AdGFP）感染各组心肌细胞,感染后48h用流式细胞仪检测各组心肌细胞中所含的绿色荧光蛋白的平均荧光强度（MFI）,间接比较各组心肌细胞中绿色荧光蛋白的生成量。结果照射后48h,各照射组心肌细胞中的总蛋白含量较未照射组减低,照射组心肌细胞的绿色荧光强度明显弱于未照射组（P〈0．01）,抑制程度与照射剂量呈正相关。结论60^Coγ射线单剂量照射抑制体外培养的心肌细胞的蛋白合成。     

HRE对A549细胞中Egr-1启动子辐射诱导表达的影响

目的构建乏氧/辐射双敏感启动子介导的增强型绿色荧光蛋白表达载体,探讨HRE对A549细胞中Egr-1启动子在乏氧和常氧条件下辐射诱导表达的影响。方法利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;利用基因重组技术构建HRE/Egr-1双敏感启动子介导增强型绿色荧光蛋白的表达载体pcDNA3.1-HRE/Egr-1-EGFP,经酶切、PCR和测序鉴定正确后,质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,不同剂量照射和不同浓度乏氧后,流式细胞术检测EGFP的表达,以此反映Egr-1的表达特性。结果酶切、PCR和测序鉴定pcDNA3.1-HRE/Egr-1-EGFP质粒构建正确。流式细胞术结果显示常氧条件下,不同剂量X射线照射后,A549细胞中EGFP表达在随着时间延长而逐渐增加,2Gy和4 Gy照射后12 h时达到最大,而6 Gy、8 Gy和10 Gy照射后在8 h时达到最大,而后逐渐降低,与0 h表达比较具有显著性差异(P0.05,P0.01)。0.1%-2.5%的氧浓度条件下,EGFP表达随着氧浓度和剂量的增加而逐渐增加,在1%氧浓度时表达量最大,与常氧条件下不同剂量照射后8 h表达比较具有显著性差异(P0.05,P0.01);在5%-10%氧浓度条件下,EGFP表达与常氧条件下基本一致。结论 HRE具有增强A549细胞中Egr-1启动子诱导表达的特性,对肿瘤基因-放射治疗具有参考意义。     

致死剂量γ射线照射小鼠脾淋巴细胞凋亡特征及与Bax和Bcl-XL表达的关系

目的观察致死剂量γ射线照射后小鼠脾淋巴细胞凋亡特征及其与Bax和Bcl—XL表达的关系。方法清洁级C57小鼠225只,随机分为0、6、9、12、15和20Gy6个组,经γ射线全身一次照射,于照射前和照射后6h～28d活杀取材,用原位末端标记法(TUNEL)和Annexin—V流式细胞术(FCM)检测淋巴细胞凋亡和坏死情况,用碱性磷酸酶免疫组化技术检测Bax和Bcl—XL蛋白的表达。结果①各剂量组小鼠外周血白细胞在照射后6h出现一过性升高,以后迅速下降。6Gy照射后7d降至最低,至照射后28d基本恢复到正常水平。②不同剂量照射后6h脾淋巴细胞凋亡率达高峰;照射后6～24h,≤12Gy照射后凋亡率随照射剂量的增加而升高,≥15Gy照射后凋亡率下降。③FCM检测结果证实,6～12Gy照射后6h,脾淋巴细胞凋亡率呈现出量-效关系,≥15Gy照射后凋亡率下降,而坏死率明显升高。DNA凝胶电泳图谱分析支持上述结果。④照射后6h,6Gy照射后脾淋巴细胞Bax蛋白表达增加,至12Gy达峰值,显示出量-效关系;≥15Gy未显示出量-效关系;Bcl—XL蛋白随照射剂量增加而持续降低,在6～12Gy也显示出较好的量-效关系。结论6～12Gy照射后脾淋巴细胞死亡方式以凋亡为主,≥15Gy照射后凋亡与坏死均为淋巴细胞的重要死亡途径。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl—XL在致死剂量照射引起的淋巴细胞凋亡调控中起重要作用。     

Therapeutic effect of pEgr-IL18-B7.2 gene radiotherapy in B16 melanoma-bearing mice

To evaluate the antitumor role of genes B7.2 and IL18, the radiation-inducible dual-gene coexpression plasmid pEgr-IL18-B7.2 was constructed and its effects on tumor were detected both in vitro and in vivo. After the introduction of pEgr-IL18-B7.2 into B16 melanoma cells, followed by X-ray irradiation, higher expression levels of B7.2 and IL18 compared with control were found both by flow cytometry and enzyme-linked immunosorbent assay. It was shown that even low-dose irradiation was able to induce their expression, which could be tightly regulated either by giving cells different doses of radiation or the same dose at different time points. pEgr-IL18-B7.2 was then packaged with liposome and injected into melanoma tumor-bearing mice. The tumors received 5 Gy of local X-ray irradiation every other day for a total of five treatments. B16 tumor growth slowed significantly when treated with pEgr-IL18-B7.2 plus X-radiation versus either treatment separately. Both 1 and 3 days after the last irradiation the group of mice with combined gene and radiation therapy showed significantly higher tumor necrosis factor (TNF)-alpha secretion in peritoneal macrophages, upregulated splenic cytotoxic T lymphocytes (CTLs) and natural killer (NK) cells, and higher interferon (IFN)-gamma secretion than those in either individual treatment group or the control group. The stimulation of host anticancer immunity by increased secretion of IL-18 and upregulated immunogenicity of the tumor cells by increased expression of B7.2 on their surface, in addition to the direct effect of local X-irradiation on the tumor cells, may contribute to the novel effect of the combined therapy.     

苦参碱对受192铱照射人员骨髓细胞端粒酶活性及细胞凋亡的影响

目的:观察苦参碱对受192铱(192Ir)低剂量照射人员骨髓细胞端粒酶活性及细胞凋亡的影响。方法:以受192Ir迁延性低剂量照射(0.05～0.66 Gy)患者54例为研究对象,分别予复方皂矾丸、苦参碱和安慰剂组治疗。采用端粒重复扩增(TRAP)-ELISA方法检测端粒酶活性,AnnexinV-FITC及PI双染,应用FACScan进行流式细胞术定量检测细胞凋亡率,观察受照人员治疗前后骨髓象、骨髓细胞端粒酶活性、细胞凋亡率变化。结果:受照人员骨髓各系均可见形态学异常,总异常率(减低+极度活跃)为20.4%;骨髓细胞端粒酶活性随时间迁延而升高,细胞凋亡率则随时间迁延而降低。经苦参碱及复方皂矾丸组治疗后6个月各系形态异常、端粒酶活性亦逐步恢复接近正常,骨髓细胞凋亡率增高。其中以苦参碱组治疗后疗效更为显著(P<0.01)。结论:苦参碱作为辐射防护剂可诱导受辐照射人员骨髓细胞凋亡,抑制其端粒酶活性高表达。     

137Csγ射线对白膜不同成分的影响

目的137Csγ射线对白膜不同成分的影响。方法MTT法测辐照前后淋巴细胞的增殖情况;用荧光素FITC标记DH5α细菌,FCM分析粒细胞荧光强度的变化;用细胞色素C还原法检测中性粒细胞O2-的生成以及用ELISA法测单核细胞辐照前后细胞因子的分泌情况。结果25 Gy能完全灭活T细胞;辐照后粒细胞离体12h后有明显凋亡出现,但辐照前后粒细胞吞噬DH5α的能力无明显改变;而粒细胞释放的O2-在辐照后有明显升高;单核细胞经辐照后仍能分泌细胞因子,且IFN-γ的分泌量较未照组有所下降,而TNF-α的分泌量随着时间的推移呈逐渐升高趋势。结论γ射线对白膜中各成分都有不同程度的影响。分离后的粒细胞应尽早输注,由细胞因子参与的临床输血问题以及由此带来的风险,应当引起关注。     

DNA-PK基因沉默对卵巢癌细胞细胞凋亡的影响

目的 探讨DNA-PK基因对沉默卵巢癌细胞凋亡的影响及机制.方法 DNA-PK shRNA以脂质体介导转染卵巢癌细胞株Skov3,24h后接受2Gy X射线照射,继续培养48 h.收集细胞,标记Annexin Ⅴ/PI,流式细胞术分析细胞凋亡情况,同时,RT-PCR检测p53和p21 mRNA的表达量.结果 2Gy辐射引起2.40％±1.53％ Skov3细胞凋亡,高于对照组（t=2.618,P=0.026）,而转染DNA-PK shRNA的Skov3细胞经2Gy照射,凋亡细胞为18.74％±4.15％,明显高于单纯2Gy照射组（t=9.052,P＜0.001）及DNA-PK shRNA转染组（2.77％±1.73％）（t=8.869,P＜0.001）.RT-PCR检测结果显示,2Gy照射组,Skov3细胞p53 mRNA表达量高于对照组,而DNA-PKshRNA转染的Skov3细胞接受2Gy照射,其p53 mRNA表达量降低,接近正常水平,单独转染DNA-PK shRNA组p53 mRNA表达量无明显变化.转染DNA-PK shRNA的Skov3细胞经2Gy照射,其p21 mRNA表达量低于2Gy照射组接近正常组水平,单独转染DNA-PK shRNA组Skov3细胞p21 mRNA表达水平与正常对照组相当.结论 DNA-PK shRNA可增加辐射后巢癌细胞株的细胞凋亡,其可能机制是通过下调p53和p21 mRNA表达,而启动细胞凋亡.