豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性

目的　研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性特征。方法　 (1)用小池技术建立起内皮细胞通透性的体外模型 ;(2 )研究该体外模型耳蜗微血管内皮细胞的跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透曲线 ,并与脑及肺的内皮细胞通透性进行对照。结果　 (1) 3种内皮细胞的体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,贝克 时间变化图均呈抛物线型上升曲线 ,其通透性从小到大依次为脑、耳蜗、肺内皮细胞 ,各组间相差显著 (P <0 .0 1) ;(2 )耳蜗、脑及肺 3种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态增加过程 ,以 5× 10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻均到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小分别为脑 (2 4 4 .7± 4 6 .9Ω/cm2 ) >耳蜗 (118.9± 18.5Ω/cm2 ) >肺 (4 6 .6± 5 .9Ω/cm2 ) ,且各组间相差显著 (P <0 .0 1)。结论　该模型下耳蜗微血管内皮细胞的通透性与其活体时的通透性特征基本一致。     

豚鼠耳蜗微血管内皮细胞体外通透性的研究

目的　研究豚鼠耳蜗微血管内皮细胞的体外通透性特征。方法　在成功建立豚鼠耳蜗微血管内皮细胞体外通透性模型的基础上 ,研究该体外模型跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白的通透性。结果　①耳蜗微血管内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻呈动态变化过程 ,以 5× 10 4/cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,其跨细胞电阻峰值大小为 (118 9± 18 5 )Ω/cm2 ;②体外模型中加入12 5I 牛血清白蛋白后 ,其通透性呈上升期抛物线型曲线 ,90min内几乎呈直线。结论　跨细胞电阻及对12 5I 牛血清白蛋白变化曲线能反映体外耳蜗微血管内皮细胞的通透性特征     

层流流体剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响

目的本实验系在考察层流剪切力对脐血CD34＋细胞体外扩增的影响作用。方法从脐血中分离出CD34＋细胞,接种入实验室自制的层流剪切力实验装置中,在不同大小的层流流体剪切力（0.5,1,2,4dyn/cm2）加载下进行体外扩增培养。结果较小的层流剪切力（0.5,1dyn/cm2）可促进造血干/祖细胞扩增,有利于早期造血干/祖细胞的维持,并能促进更多的细胞由G0/G1期进入S期 较大的层流剪切力（2,4dyn/cm2）抑制了造血干/祖细胞的扩增,导致其迅速分化 并使S期细胞的比例减小。结论在生物反应器体外扩增培养脐血CD34＋细胞时,其层流流体剪切力应控制在1dyn/cm2范围内。     

氧自由基对豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡的影响及其机制

目的 研究氧自由基诱导豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡及其可能机制.方法 以黄嘌呤氧化酶作用于黄嘌呤而产生氧自由基.不同浓度氧自由基作用于豚鼠耳蜗微血管内皮细胞,用流式细胞术检测凋亡细胞的百分比;用免疫细胞化学法检测Bax及Bcl-2蛋白表达;用RT-PCR方法检测Bax及Bcl-2 mRNA的表达.结果 氧自由基作用后,与空白对照组相比,各个浓度的氧自由基作用组豚鼠耳蜗微血管内皮细胞凋亡率均明显升高(均P<0.01),同时,BaxmRNA及蛋白的表达均显著增强(P<0.05或P<0.01),Bcl-2 mRNA及蛋白的表达明显减弱(均P<0.01).结论 氧自由基可诱导豚鼠耳蜗微血管内皮细胞发生凋亡,其发生机制与其调节Bax/Bcl-2 mRNA及蛋白的表达有关.     

豚鼠内耳微血管内皮细胞的跨细胞电阻

目的　研究豚鼠内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻的动态变化及峰值大小。方法　①胶原酶消化法分离培养豚鼠内耳及脑微血管内皮细胞 ,免疫组化法进行鉴定 ;②建立起内皮细胞通透性的体外模型 ,研究该模型下内耳内皮细胞的跨细胞电阻 ,并与脑及肺内皮细胞进行比较。结果　①培养细胞致密融合时具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观 ,与肺内皮细胞株的形态一致 ,经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子 ,95 %以上的培养细胞的胞浆中呈棕黄色阳性反应 ;②三种内皮细胞在培养增殖过程中其跨细胞电阻值呈动态变化过程 ,以 5× 10 4 cm2 的细胞密度接种时 ,7d左右电阻到达峰值 ,内耳、脑及肺三种内皮细胞的跨细胞电阻峰值大小分别为 (118 9± 18 5 )Ω cm2 ,(2 44 7± 46 9)Ω cm2 ,(4 6 6± 5 9)Ω cm( n =6) ,三者相差非常显著 (P <0 0 0 1)。结论　内耳微血管内皮细胞跨细胞电阻峰值小于脑内皮而大于肺内皮细胞 ,证明了三者通透性的差别。     

TNF-α对体外培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的影响

目的 研究TNF-α对体外培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性的影响.方法 体外分离培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞并建立耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性体外模型,实验分TNF-α组和对照组.依据作用时间和浓度不同,检测其对伊文思蓝的通透率变化.结果 TNF-α能显著增加耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性,使伊文思蓝的通透率显著升高(P＜0.01),且随TNF-α浓度升高和作用时间的延长而升高.结论 TNF-α可以显著的增加耳蜗血管纹微血管内皮细胞的通透性.     

肿瘤坏死因子对豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞纤维肌动蛋白的影响

目的 观察肿瘤坏死因子(TNF-α)对豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞纤维肌动蛋白(F-actin)的影响,为研究豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞通透性改变的机制提供依据.方法 体外分离培养豚鼠耳蜗血管纹微血管内皮细胞,用0.05、0.1、0.2 ng/ml浓度的TNF-α作用90 min后,用免疫荧光激光共聚焦扫描显微镜法测定其中各组的F-actin含量变化,对照组为空白对照.结果 TNF-α能使耳蜗血管纹微血管内皮细胞的F-actin含量明显减少(P<0.01),且TNF-α的浓度越高F-actin的含量降低越明显.结论 通过TNF-α的作用能够改变豚鼠耳蜗微血管内皮细胞内F-aetin密度及含量.     

不同流动剪切力调节大鼠成骨样细胞增殖的体外研究

目的　从细胞水平探索机械应力刺激调节骨改建的机制 ,并探讨促进骨改建的最适生理应力值。方法　对体外培养的大鼠成骨样细胞施加一系列不同大小的流动剪切力 ,利用流式细胞技术衡量其细胞的分裂增殖能力。结果　大鼠成骨样细胞受到流动剪切力后 ,细胞与流动方向一致的长轴被拉长 ,细胞沿流动方向排列。随着剪切力的增加 ,成骨样细胞的增殖指数 (PI)不断增加 ,当剪切力为 12 dyn/cm2 时 ,PI值与对照组相比有显著性差异 (P<0 .0 5 )。随剪切力的继续增加 ,PI值开始下降 ,当剪切力大于 14dyn/cm2 时 ,PI值与对照组相比显著下降 (P <0 .0 1)。结论　机械应力对骨改建的调节作用与成骨细胞受到应力诱导产生的流动剪切力的刺激有关 ,低剪切力对细胞的增殖影响不大 ,中等大小的剪切力 (12 dyn/cm2 )明显刺激细胞的增殖 ,高剪切力将抑制细胞的增殖。     

豚鼠血迷路屏障通透性的体外模型

目的 研究豚鼠血迷路屏障通透性体外模型的建立方法及其通透性特征。方法 （1）用组织块贴壁培养法分离培养豚鼠耳蜗微血管内皮细胞，免疫组化法进行鉴定；（2）用小池技术建立起内皮细胞通透性的体外模型，并研究该模型中耳蜗、脑及肺3种内皮细胞对^125I-牛血清白蛋白的通透性；（3）研究豚鼠血迷路屏障对^125I-牛血清白蛋白的通透性。（3）研究豚鼠血迷路屏障对^125I-牛血清白蛋白的通透性。结果 （1）培养细胞致密融合对具有内皮细胞培养时典型的“铺路石样”外观，经免疫组化检测其内皮细胞标志性抗原Ⅷ因子，95％以上的培养细胞的胞质中呈棕黄色阳性反应；（2）耳蜗、脑及肺3种内皮细胞的体外模型中加入^125I-牛血清白蛋白后，贝克－时间变化图均呈抛物线型上升曲线，90min内几乎呈直线；（3）豚鼠血迷路屏障对^125I－牛血清白蛋白的通透性曲线与体外模型相似。结论 血迷路屏障的体外模型能大体反映在体时的通透性特征。     

内毒素致豚鼠血迷路屏障通透性及其超微结构观察

目的研究内毒素(ETX)致豚鼠血迷路屏障的动态变化情况.方法采用听泡内注入内毒素,以伊文思蓝(Evans Blue,EB)为示踪剂,测量EB通过耳蜗血迷路屏障的渗出量,应用透射电镜观察耳蜗外侧壁形态学的变化.结果内毒素使耳蜗血迷路屏障EB渗出量随时间的变化而变化,12 h开始有EB渗出,24 h达高峰,与12、72 h比较,有显著性差异.生理盐水组超微结构无变化,内毒素组血管纹血管内皮细胞呈不同程度的损伤,细胞间的间隙增宽,有炎性细胞浸润.结论内毒素能使血迷路屏障通透性增加,其原因主要是由血管纹微血管内皮细胞连续性中断及细胞间的紧密连接开放所致.     

大鼠脑微血管内皮细胞的体外培养方法

目的建立一种简便可靠的脑微血管内皮细胞的培养方法.方法新生SD乳鼠脑皮质经匀浆、过滤、消化和差速贴壁等方法对大鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养及传代培养,对培养的细胞进行形态学观察,并用Ⅷ因子相关抗原进行免疫细胞化学鉴定.结果培养的细胞呈单层贴壁生长,约7～9d后呈典型的"铺路石"征象,免疫细胞化学鉴定证实为内皮细胞.结论此种脑微血管内皮细胞培养方法的建立为体外研究脑血管疾病提供了可靠的手段.     

小鼠脑微血管内皮细胞的体外培养

目的 探讨脑微血管内皮细胞的体外培养方法并进行细胞超微结构研究及组织型纤溶酶原激活物（ＴＰＡ）活性测定。方法 取新生小鼠脑组织,通过匀浆、过筛、胶原酶消化、差速粘附等技术对鼠脑微血管内皮细胞进行原代培养,待细胞铺满瓶底时,用０．１２５％胰酶－０．０２％ＥＤＴＡ消化,离心收集内皮细胞,进行传代培养。原代、传代各取８例,吸取培养液用酶联免疫吸附试验测试ＴＰＡ活性。结果 经Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学鉴定     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

糖尿病大鼠脑内微血管细胞外信号调节激酶磷酸化的研究

目的研究链脲佐菌素诱导的Ⅰ型糖尿病大鼠脑膜、脑实质微血管的病理改变及其中细胞外信号调节激酶ERK1/2及其下游作用底物转录因子Elk-1的磷酸化状态,探讨糖尿病血管的发病机制。方法应用链脲佐菌素制备Ⅰ型糖尿病大鼠模型,HE染色观察制模后3d和2、4、8周脑膜、脑实质微血管病变,免疫组织化学观察高血糖状态下脑内微血管中p-ERK1/2及下游作用底物p-ELK1的表达情况。结果 p-ERK1/2、p-ELK1在各时间点正常对照组和糖尿病组大鼠脑膜、脑实质微血管中均有不同程度的表达。p-ERK1/2在糖尿病4、8周组脑膜、脑实质微血管中表达均明显上调;p-ELK1在糖尿病4、8周组脑膜、脑实质微血管内皮细胞中表达均明显的上调(P<0.05),分别与糖尿病3d、2周组及各期正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。糖尿病各组与正常对照组各组脑膜微血管平滑肌细胞中p-ELK1的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论在糖尿病4、8周组SD大鼠脑内微血管中存在ERK1/2信号转导通路的异常激活。     

脑内皮细胞趋化因子受体5 参与β-淀粉样蛋白引起的T细胞跨内皮迁移

 目的利用血-脑屏障的体外模型,分析脑内皮细胞上的趋化因子受体5（CCR5）在β淀粉样蛋白（Aβ）引起的T 细胞跨内皮迁移过程中的作用。方法培养人脑微血管内皮细胞（HBMEC）,建立体外血-脑屏障模型,分析T 淋巴细胞跨内皮迁移的能力。结果Aβ能够促进T淋巴细胞穿过体外血-脑屏障模型,HBMEC 中CCR5 过表达能够促进T淋巴细胞穿过体外血脑屏障模型,HBMEC 中CCR5 缺失突变能够抑制T淋巴细胞穿过体外血-脑屏障模型。结论HBMEC 中CCR5 参与Aβ引起的
T淋巴细胞的跨内皮迁移。     

TRPV4在小鼠脑血管内皮细胞中的表达及对血管张力调节作用研究

目的 比较瞬时受体电位(TRP)通道家族中香草素受体亚家族(TRPV)和经典瞬时感受器电位亚家族(TRPC)在小鼠脑、心和肝微血管内皮细胞表达差异,寻找脑微血管中具有特异性高表达亚型,阐明其对脑动脉血管舒张的调节作用.方法 挖掘GEO数据库中芯片表达谱数据,分析各个通道亚型差异表达情况,再采用免疫组化检测TRPV4、TRPP2和TRPC1在脑基底动脉中表达情况,血管张力实验检测TRPV4通道在调节小鼠脑基底动脉舒张中的效应.结果 通过分析表达谱数据显示,在小鼠脑、心和肝三种微血管内皮中,TRPV4通道在脑微血管内皮细胞显著高表达,而TRPC3通道显著低表达.TRPV4、TRPP2和TRPC1在脑基底动脉内皮和平滑肌层也显著表达.TRPV4通道激动剂GSK1016790A能浓度依赖地舒张苯肾上腺素引起的脑基底动脉收缩,而且其舒张效应可以被TRPV4通道阻断剂HC067047所阻断.结论 与心和肝血管内皮细胞相比,TR-PV4通道在小鼠脑血管内皮细胞中显著高表达,可能在调节脑血管内皮功能中具有重要意义.     

Transport and regulation mechanism of the colloidal gold liposomes in the brain microvascular endothelial cells

Objective:Blood-brain barrier is the key barrier of brain in the innate immune.It can prevent the harmful substances from the blood into the brain.In order to keep the brain in a relatively stable environment and maintain the normal function of the nervous system,it can also pump harmful substances or excess substances outside the brain selectively.Among them,brain microvascular endothelial cell tissue is a key part in the blood-brain barrier's function.The number of the patients with central nervous system(CNS)diseases increased year by year.The therapeutic drug is usually inhibited by the blood-brain barrier and is difficult to work.Therefore,how to modify the drug and to make it easier to cross the blood brain barrier is the key point to cure CNS.At present,more than 95%research focus only on how nano drugs can enter the cell,the way and efficiency to enter the cell and the research of effect of nano drug etc.For the process of drug carrier in endocytosis,intracellular transport and release and regulation of research are rarely reported.Clathrin and P-glycoprotein are related protein in endocytosis and exocytosis with nano drug.Clathrin is located on the plasma membrane.It participates in endocytosis of some nutrients,and maybe the entry into the cell of some drugs.P-glycoprotein is located in the membrane of cerebral capillary endothelial cells.It can efflux drugs relying on ATP.Although there is a certain understanding of the cell in the inner swallow and efflux.But the process of the liposome drug is not clear.To solve the above problems,using colloidal gold liposome nano materials to trace liposome's transport and regulation mechanism in brain microvascular endothelial cells,and study endocytosis,release,distribution and regulation mechanism of nano liposomes in brain microvascular.The solution of this problem can guide to construct reasonable drug carrier,and look forward to clarifing the molecular basis and mechanism of nano drug carriers across the BBB.This work has important theoretical and practical significance for the development and application of liposomes in the future.Results:For untreated cerebral microvascular endothelial cells,the cells incubated with colloidal gold liposomes can uptake of liposome colloidal gold,and with the extension of time,there are gold colloids in the plasma membrane,endoplasmic reticulum,Golgi apparatus and lysosomes in order,and finally colloidal gold liposome exports out of the cell.For cerebral microvascular endothelial cells treated by sodium azide,compared with untreated cells,the cells incubated with colloidal gold liposomes,cannot be observed liposome colloidal gold in them.For cerebral microvascular endothelial cells treated by reserpine,the cells incubated with colloidal gold liposomes,compared with untreated cells,colloidal gold liposome cannot export out of the cell.Conclusions:The uptake of liposomes in brain microvascular endothelial cells require clathrin's participation.The excretion of liposomes from brain microvascular endothelial cells require P-glycoprotein's participation.After colloidal gold liposome entering brain microvascular endothelial cells,it moves into the endoplasmic reticulum,Golgi apparatus and lysosomes in order.Finally colloidal gold liposome exports out of the cell.     

小鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养

目的建立小鼠心肌微血管内皮细胞培养体系。方法 4～6周的清洁级C57小鼠的心室肌,利用胰蛋白酶及Ⅱ型胶原酶消化过滤收集的滤液进行重新悬浮种植于明胶包被的培养瓶中,通过倒置电镜观察细胞的生长形态及生长状态,得出生长曲线,并利用免疫荧光鉴定(心肌微血管内皮细胞特异性抗原vWF)培养出的小鼠心肌微血管内皮细胞。结果通过形态学观察及免疫荧光鉴定证实为小鼠心肌微血管内皮细胞。培养的小鼠心肌微血管内皮细胞第1、2天生长相对缓慢,而到第3、4天细胞呈对数生长,第6、7天细胞达到融合。结论采用明胶包被培养瓶,通过机械剪切、蛋白酶消化、过滤方法,并进行了相关鉴定,可获得较纯的小鼠心肌微血管内皮细胞,这为研究心肌微血管内皮细胞的迁移、血管再生等提供了实验来源。     

通心络对Aβ损伤脑微血管内皮细胞中炎性因子及信号通路NF-κB表达的影响

目的探讨通心络对β淀粉样蛋白片段（Aβ1-42）诱导的人脑微血管内皮细胞中炎性因子、信号通路NF-κB表达的影响。方法采用人脑微血管内皮细胞,给予不同剂量的通心络预处理,并用20μmol/L的Aβ1-42干预24 h诱导细胞损伤,检测经处理后细胞内炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α及信号通路NF-κB的表达。结果 Aβ1-42可诱导人脑微血管内皮细胞炎性反应,IL-1β、IL-6及TNF-α均不同程度升高,信号通路NF-κB表达增强,而通心络可有效降低IL-1、IL-6、TNF-α及信号通路NF-κB的表达,且呈现剂量依赖性。结论 Aβ1-42可通过信号通路NF-κB诱导人脑微血管内皮细胞的炎性反应,而通心络可以逆转这一现象,这可能是通心络治疗老年性痴呆（AD）的作用机制之一。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。