抗华支睾吸虫循环抗原Fab抗体克隆的筛选及序列分析

目的　获得抗华支睾吸虫循环抗原Fab段抗体。方法　将华支睾吸虫代谢抗原包被在固相ELISA板中 ,采用“吸附 -洗脱 -扩增”的方法 ,对已构建的抗华支睾吸虫噬菌体抗体库进行富集。从富集后的抗体库中筛选抗循环抗原抗体克隆 ,并交叉筛选鉴定其特异性。结果　从 2 0 6个克隆中筛选到阳性克隆 2 3个 ,再分别用肺吸虫、肝片虫、姜片虫和日本血吸虫脱脂全虫粗抗原进一步交叉筛选 ,最终获得特异性抗Cs -MAg阳性克隆 3个 (B0 5 ,C10和E38)。对其中 2株 (E38和B0 5 )序列分析表明它们的κ轻链V基因属于人VκⅠ (O2 )亚群 ,J基因属于Jκ1;γ链V基因属于人VHⅠ - 6 9亚群 ,D基因来自D3- 10 ,J基因则来自JH3。结论　用成虫代谢抗原直接包板 ,可以从抗体库中筛选到阳性克隆 ,构建的噬菌体抗体库是成功有效的     

抗弓形虫主要表面抗原1单链抗体的筛选及鉴定

目的采用重组抗原从人源化单链抗体库(Human single fold scFv library)中筛选和鉴定抗弓形虫主要表面抗原1(rSAG1)的单链抗体,对其特异性的弓形虫靶向作用进行分析,为弓形虫靶向生物治疗提供靶向分子。方法以重组SAG1融合蛋白作为包被抗原对噬菌体抗体库进行3轮固相筛选,获得抗rSAG1融合蛋白的阳性克隆;用纯化的原核表达载体pET-32C的亲和标签(Trx-His-Stag)、鼠可溶性抗原和大肠杆菌抗原对上述阳性克隆进行差异筛选,获得能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆;差异筛选获得的特异性阳性克隆转染大肠杆菌HB2151进行诱导表达和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,获得能分泌抗rSAG1单链抗体(anti-rSAG1scFv)的阳性噬菌体克隆;DNA测序分析抗rSAG1的单链抗体基因序列。用Ni2 螯合柱亲和纯化rSAG1单链抗体,并用免疫印迹技术(Westernblot)对纯化的抗rSAG1单链抗体进行免疫反应性检测;免疫组化检测rSAG1单链抗体对弓形虫速殖子的靶向作用。结果经过rSAG1抗原的固相筛选后获得24株阳性克隆,差异筛选后获得5株能特异性结合rSAG1的噬菌体克隆,其中有3株分泌性表达抗rSAG1的单链抗体,DNA测序和Genbank比对表明其为3株不同的抗弓形虫主要表面抗原1的单链抗体;West-ernblot表明亲和纯化的单链抗体能较好结合rSAG1;免疫组化显示抗rSAG1单链抗体可与弓形虫速殖子结合。结论利用噬菌体抗体库技术获得的特异性人源rSAG1单链抗体与弓形虫速殖子有较强的结合能力,这对弓形虫的靶向生物治疗具有潜在应用价值。     

从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体

目的从人源大容量天然抗体库中筛选到抗禽流感病毒H5N1单链抗体。方法运用噬菌体表面呈现技术,用纯化的H5N1禽流感血凝素蛋白HA（A/Anhui/1/2005）对人源大容量天然抗体库进行富集筛选,对获得的阳性克隆进行序列分析,并将其克隆入携带人源Fc段的表达载体,实现scFv-Fc融合抗体的分泌型表达。用ELISA、IFA对所获人源单抗的功能特性进行鉴定。结果经过3轮富集筛选,共获得了82株特异性结合H5N1禽流感病毒HA的人源scFv单链抗体,分别属于5个不同的抗体序列,ELISA、IFA表明从抗体库筛选获得的5株人源单抗与禽流感病毒H5N1及其HA具有较好的特异性,而与甲1型和甲3型人流感病毒无交叉反应。结论从人源大容量天然抗体库中利用高通量的筛选策略在短时间内获得抗禽流感病毒H5N1人源单抗,对于禽流感的紧急预防和治疗具有重要意义。     

日本血吸虫雌虫抗原模拟表位的筛选及免疫保护性

目的　筛选日本血吸虫雌虫抗原的模拟表位 ,并探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。　方法　用日本血吸虫雌虫免疫兔血清IgG作配体对噬菌体随机 12肽库进行 3轮亲和筛选 ,随机挑取 18个噬菌体克隆用Dot ELISA检测其特异性 ,并对其中的 4个阳性克隆进行测序。分别在 0、2、4周用混合噬菌体克隆免疫小鼠 3次 ,第 6周每鼠经腹部感染 40条日本血吸虫尾蚴 ,42d后剖杀冲虫 ,计数虫数和每克肝卵数。　结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体富集了 2 0 0多倍 ,随机挑取的 18个克隆经Dot ELISA鉴定有 17个能与雌虫抗原免疫兔血清呈阳性反应。DNA自动测序的 4个序列与GenBank的已知序列均无同源性。与对照组相比 ,混合噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 2 6.5 7% ,减卵率为 65 .3 4%。　结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟日本血吸虫雌虫特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫。     

日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因的克隆和鉴定

目的　从日本血吸虫成虫cDNA文库中筛选并克隆日本血吸虫特异性IgE相关抗原编码基因。　方法　用ABC ELISA法从日本血吸虫病流行区筛选出高水平抗血吸虫成虫抗原IgE抗体的个体 15人 ,采集血清并混合。混合血清经Protein G柱吸收后 ,用于日本血吸虫成虫cDNA文库的免疫学筛选。PCR扩增阳性克隆插入cDNA片段。序列分析后 ,于该序列第一开读框两端设计引物并分别引入EcoRⅠ和NotⅠ位点 ,PCR扩增并纯化目的基因片段后克隆入质粒载体pGME T ,再亚克隆入表达载体pGEX 6p 1。经IPTG诱导表达 ,对表达产物进行SDS PAGE和Westernblotting鉴定。　结果　阳性克隆插入片段约 12 0 0bp ,第一开读框长 5 0 7bp ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 3kDa。DNA序列分析显示 ,与已知序列同源性小于 4 0 %。重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B能高效表达融合蛋白 ,且能被日本血吸虫特异性IgE抗体识别。　结论　成功构建的重组质粒pGEX 6p 1/Sj4 3B ,Sj4 3B可编码日本血吸虫特异性IgE抗体相关抗原     

日本血吸虫辐照尾蚴模拟表位的筛选和初步鉴定

目的从噬菌体表面显示随机肽库中筛选日本血吸虫辐照尾蚴抗原模拟表位。方法用Sepharose4B亲和层析法,从日本血吸虫辐照尾蚴免疫鼠血清中纯化抗体,经正常血吸虫尾蚴抗原吸收后,用于12肽噬菌体随机肽库的免疫筛选。经三轮筛选,随机挑取20个噬菌体克隆,经DNA序列分析后,对各独立表位进行免疫学鉴定。结果DNA序列分析,获得4个有序列重复的噬菌体克隆;Dot-ELISA分析显示,4个克隆均能被辐照尾蚴免疫血清中IgM型抗体识别,反应强度有一定差别;P1和P2克隆还能被IgG型抗体识别。结论从噬菌体随机肽库中成功筛选到日本血吸虫辐照尾蚴抗原模拟表位。     

日本血吸虫未成熟卵抗血清对日本血吸虫cDNA文库的免疫筛选

目的为了获得抗雌虫生殖和卵胚发育相关抗原的血吸虫基因。方法通过采用抗日本血吸虫未成熟卵SIEA26—28kDa免疫血清对日本血吸虫成虫cDNA文库进行筛选。结果共获得阳性克隆23个,经重复筛选之后,随机挑取其中的5个阳性克隆,分别进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳显示获得单一扩增条带,其大小位于150bp～1.5kb之间。结论从SjcDNA文库中筛选出抗卵相关阳性克隆,有关分析鉴定在进一步进行中。     

全人源肝癌噬菌体单链抗体基因的克隆及活性分析

从噬菌体单链抗体库中筛选克隆全人源肝癌抗体基因并进行活性鉴定.PCR鉴定阳性重组菌中人肝癌ScFv的插入率,以肝癌细胞SMMC-7721为抗原对所建抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的亲和筛选.将筛选后的ScFv采用ELISA法鉴定其与人肝癌细胞的结合活性.ScFv基因插入率为70%.在亲和筛选过程中,肝癌噬菌体单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第一轮的381倍.利用噬菌体抗体库技术筛选出了肝癌噬菌体单链抗体,且筛选后的抗体片段与人肝癌细胞有特异性的结合活性.     

用噬菌体随机肽库鉴定日本血吸虫22.6kDa抗原分子的表位

目的　筛选和鉴定日本血吸虫 (中国大陆株 ) 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6)的表位。　 方法　用纯化的抗Sj2 2 .6的多克隆抗体IgG对噬菌体十二肽库进行 5轮免疫学筛选 ,挑取克隆 ;采用Westernblotting免疫识别 ,将获得的阳性克隆免疫小鼠 ,并采用dot ELISA筛选能刺激小鼠产生较高滴度抗Sj2 2 .6抗体的阳性克隆 ;测定核苷酸序列 ,分析其表位与Sj2 2 .6抗原的同源性。　结果　经 5轮免疫学筛选后挑取的 1 4个克隆 ,用Westernblotting方法均能被抗Sj2 2 .6抗体识别。经动物免疫初步实验筛选 ,共获得 6个免疫原性较强的阳性克隆 ,测序结果获得 4种不同表位 ,其中 1种表位与Sj2 2 .6抗原具有较高的同源性 ,其余 3种表位与其无一级结构的同源性。　结论　获得的 4种日本血吸虫中国大陆株抗原表位 ,1种可能为结构表位 ,3种为模拟表位     

抗人肺癌噬菌体展示可溶性ScFv的筛选与鉴定及其序列测定

目的制备抗人肺癌单链抗体（single chain Fv ferment antibody,ScFv）,并对抗体生物学特性进行初步研究。方法以人肺腺癌细胞系A：为抗原,对5F一11杂交瘤细胞噬菌体抗体库进行富集和筛选。以人肺腺癌细胞系A2和正常人淋巴细胞为抗原,进行酶联免疫吸附试验,从富集后的噬菌体抗体库中筛选出只与A2细胞结合的阳性克隆。筛选的噬菌体克隆转染大肠埃希菌HB2151,得到可溶性单链抗体分泌克隆。可溶性抗体分泌克隆测序。应用ELISA、竞争性ELISA、SDS．PAGE及蛋白质印迹法对其中的2A7．1克隆进行初步鉴定。结果以肺腺癌细胞A2为抗原进行了4轮富集。进一步筛选得到18个仅识别A：细胞而与人淋巴细胞无反应的融合抗体分泌克隆。转染大肠埃希菌HB2151后筛选到能与Az细胞特异结合的可溶性抗体分泌克隆2A7．1。竞争性ELISA结果显示,5F-11能强烈抑制2A7-1与A2细胞的结合。SDS-PAGE蛋白质印迹法显示得到大小约为30X10。的单链抗体。结论通过噬菌体抗体技术成功分离到了鼠单抗5F-11的可溶性ScFv分泌克隆,为进一步的抗体应用研究奠定了基础。     

噬菌体表达的短肽模拟蚯蚓与日本血吸虫共同表位研究

目的采用噬菌体呈现技术,获得蚯蚓与血吸虫的共同表位。方法依次以日本血吸虫病患者血清(SjIg)、蚯蚓免疫兔血清(LtIg)和LtIg、SjIg作为靶分子,以噬菌体12肽库的第三轮扩增肽库为源肽库,进行2轮吸附-洗脱-扩增免疫筛选。每轮随机挑取蓝色噬菌斑各21个,用ELISA方法检测其抗原性,并对其反应性较好的阳性克隆进行测序。结果获得4个阳性克隆可与SjIg、LtIg较好的结合。得到3个阳性克隆的氨基酸序列,它们有蚯蚓与血吸虫共同的线性表位。结论结果说明,从12肽库筛选蚯蚓与寄生蠕虫抗原共同表位是可行的,同时也为获得寄生蠕虫共同抗原提供了一条新的途径。     

利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位

目的　从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位。方法　制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体 Ig G,用此 Ig G包被酶标板对 12肽库进行反复淘选 ,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析。结果　获得一批阳性噬菌体克隆 ,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值 ,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别 ,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性。结论　获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆 ,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础。     

Protective immunity induced by phage displayed mitochondrial related peptides of Schistosoma japonicum

New antigens and strategies are necessary for vaccine development against schistosomiasis japonica. Using a pool of 43 high titred anti-SWA sera from individuals residing in an Schistosoma japonicum endemic area of China, we have cloned a S. japonicum gene by cDNA library screening. The recombinant Sj338 protein has 44-46% identity to a mitochondrial precursor receptor protein of humans and rats. Immunization of mice with the recombinant Sj338 conferred 27-32% (p<0.01) reduction in worm burdens following cercarial challenge. In an effort to identify protective epitopes in Sj338 and increase the level of protection, we screened a random 12-mer peptide library constructed in M13 using a polyspecific anti-Sj338 rabbit serum. After five rounds of biopanning, we identified 30 reactive clones consisting of 11 distinct peptide sequences. These clones shared limited primary sequence homology with the recombinant Sj338 protein. Anti-sera raised against these phage clones recognized recombinant Sj338 and SWAP by Western blot. In murine vaccination experiments using whole recombinant phage without adjuvant, four of these clones demonstrated worm reductions of 11.6-25.1% (p=ns - 0.05) compared to M13 vaccinated animals. Animals vaccinated with all four of these phage demonstrated 34.2% (p<0.01) worm reduction compared to controls vaccinated with M13 clone. These data suggest that mimotope peptides are potential vaccine candidates for S. japonicum.     

抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6抗原识别表位的鉴定

目的 目的 采用噬菌体展示肽技术鉴定抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6的抗原识别表位。 方法 方法 将纯化的抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6作为固相配基筛选噬菌体随机展示12肽库, 按照吸附?洗脱?扩增的淘洗过程进行3轮生物淘洗, 富集特异性结合的噬菌体颗粒。随机挑取第3轮洗脱的独立噬菌体克隆, 分别依次进行噬菌体扩增、基因组DNA抽提和DNA序列分析。选择外源性插入DNA序列完全相同或高度相似的同源性噬菌体, 采用ELISA及免疫印迹分析对其免疫反应性作进一步鉴定, 以确定单克隆抗体5C6的抗原识别表位。 结果 结果 第3轮淘洗物中33个独立噬菌体克隆的DNA测序结果显示, 其中25个噬菌体编码外源性插入肽的核酸序列均为5′?CCACCTAGTAGCAGACCGATTCT? CAGTCGAAGGAAA?3′, 其对应的演绎氨基酸序列为PPSSRPILSRRK, 该肽与日本血吸虫信号蛋白14?3?3及自然界其他已知蛋白的氨基酸序列均无同源性。免疫印迹试验证实此短肽可被自然感染的日本血吸虫病人血清所识别, 而不与健康人血清反应。 结论 结论 本研究成功鉴定了抗日本血吸虫14?3?3蛋白单克隆抗体5C6所识别的模拟抗原表位, 并证明该表位为空间构像表位。     

日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库与新基因分析

目的　筛选与日本血吸虫尾蚴抗原有共同免疫原性的日本血吸虫成虫抗原分子,为血吸虫病诊断和疫苗研究提供新的候选分子。　方法　利用日本血吸虫尾蚴可溶性抗原免疫兔血清筛选日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)成虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。　结果　共筛选出13个阳性克隆,PCR扩增出特异的插入片段。测序分析获4个新基因SjCAI、SjCA、SjCAI2和SjCAI3(登录号分别为AF495883、AF515834、AY118086和AY129303),分别编码353、161、137和72个氨基酸的蛋白。SjCAI蛋白含6个DNA结合锌指,与原肠胚锌指蛋白XLCGF48.2有一定同源性;SjCA蛋白、SjCAI2蛋白和SjCAI3蛋白含N糖基化和磷酸化位点。　结论　筛选Sj成虫cDNA文库获得了新的基因序列。     

噬菌体表达短肽模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的研究

目的　从噬菌体随机肽库中筛选模拟血吸虫致弱尾蚴特异性抗原表位的噬菌体克隆 ,并探讨其免疫保护效果。方法　用紫外线致弱尾蚴免疫兔血清IgG筛选以融合蛋白形式在丝状噬菌体外壳蛋白Ⅲ表达的随机 7肽库 ,三轮免疫筛选后获得的噬菌体克隆经皮下免疫小鼠 3次 ,攻击感染 45d后剖杀 ,观察减虫和减卵效果。结果　经三轮筛选 ,特异性结合的噬菌体富集增加了 10 0多倍 ,随机挑取 2 4个噬菌体克隆经ELISA测定 ,有 2 2个克隆能与致弱尾蚴免疫兔血清IgG特异性反应。混合噬菌体克隆免疫小鼠试验的减虫率与减卵率分别为 33.5 7%和 5 6 .0 7% (P均 <0 .0 0 1)。结论　采用噬菌体随机肽库技术可获得模拟致弱尾蚴特异性抗原表位的短肽分子 ,这些短肽分子能诱导一定程度的保护性免疫     

用日本血吸虫病化疗后再感染人血清对成虫cDNA文库的初步筛选

为了获取日本血吸虫特异的cDNA克隆,用日本血吸虫病流行区化疗后再感染人群血清筛选构建于表达载体λt11的日本血吸虫成虫cDNA文库,再以多聚酶链反应（PCR）技术鉴定免疫筛选的阳性cDNA克隆。结果对cDNA表达库中约8．6×104个噬菌斑进行了筛选,初筛时共挑出59个可能的阳性斑,经两次复筛后,有11个噬菌斑仍呈阳性反应。以阳性噬菌斑DNA为模板,经PCR均扩增出一定大小的片段,从564bp到740bp不等。