抗粘蛋白1单链抗体的构建及其功能初步分析

目的 分离鼠源抗粘蛋白1(mucin1,MUC1)单克隆抗体可变区基因,构建有结合功能的单链抗体,并初步检测结合活性.方法 提取杂交瘤细胞总mRNA,合成cDNA后,PCR扩增鼠特异性抗体可变区编码基因,通过9个氨基酸的连接子构建表达单链抗体的原核重组表达载体,体外诱导表达纯化后,采用Western blot和流式细胞术方法分析单链抗体与变性或天然状态下抗原的结合活性.结果 在杂交瘤细胞中成功分离到抗体轻重链可变区基因,重组链接后形成单链抗体能够在大肠杆菌中分泌表达,Western blot和流式细胞术分析表明该单链抗体能够与变性或天然状态下的T47D肿瘤细胞表面MUC1特异性结合.结论 成功制备具有生物活性的抗肿瘤相关MUC1单链抗体,该单链抗体具有与MUC1特异性结合的生物学活性.     

抗乳腺癌人鼠嵌合抗体的构建

目的：构建抗人乳腺癌单克隆抗体人鼠嵌合抗体，降低鼠源性抗体应用于人体的免疫排斥反应。方法：采用RT－PCR技术，从分泌抗人乳腺癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株CDI315B分离克隆抗体轻重链可变区基因，对其进行序列分析，将连接组建人鼠嵌合轻链和人鼠嵌合重链，然后分别将它们克隆到真核细胞表达载体pcDNA3。结果：构建的人鼠嵌合抗体基因克隆在真核细胞表达载体上。结论：人鼠嵌合抗体的构建为它的表达和临床应用打下基础。     

提高抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体的表达和抗体的功能鉴定

目的 探讨人-鼠嵌合抗体ch-BD1体内和体外的表达和功能。方法 用分子生物学方法得到系列弱化表达的双氢叶酸还原酶(DHFR)基因片段,将其克隆入载体pDHL-BD1中构建得系列弱化表达DHFR基因的人-鼠嵌合抗体pWSD1-BD1,pWSD2-BD1,和pWSD3-BD1。将这些嵌合抗体以及pDHL-BD1分别转染缺陷表达DHFR基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)/DHFR-细胞,以Northern印迹鉴定其DHFR基因表达水平。将不同浓度的氨甲蝶呤(MTX)加入转染细胞的培养液,测定上清中的抗体水平。用 ~(99m)标记纯化的ch-BD1,加入系列稀释的人膀胱癌EJ细胞溶液中,测定结合在细胞上的抗体放射活性,计算标记抗体的亲和常数。将人膀胱癌EJ细胞注射入3只Balb/C小鼠后肢根部,4周后对肿瘤进行放射免疫显像。将标记抗体注射入小鼠尾静脉,分别于2 h,6 h,22 h和24 h后进行放射显像。结果 构建载体的 DHFR基因表达活性由强至弱的顺序为 pDHL-BD1>pWS1-BD1>pWS3-BD1>pWS2-BD1。MTX浓度为10~(-6)mol/L时ch-BD1的表达水平与DHFR基因的基础表达水平明显相关,DHFR基础水平越高抗体的表达水平亦越高。EJ细胞与标记抗体孵育后,ch-BD1的免疫活性分数为76％,亲和常数为3.56×10~9 M~(-1);鼠单抗BD1的免疫活性分数为81％,亲和常数为1.22×10~9M~(-1)。~(99m)标记的ch-BD1经尾静脉     

抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建及瞬时表达

目的构建及瞬时表达抗人CD28鼠-人嵌合抗体。方法采用基因工程技术,从分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株（克隆号：2F5）中克隆出抗体重链和轻链可变区基因及相应信号肽编码序列。分别与人免疫球蛋白IgG1恒定区重、轻链基因拼接,构建含有重组基因的pIRES表达质粒pIRES/h2F5。转染293T细胞并用抗性药物G418选择培养。采用流式细胞术,检测瞬时转染细胞后嵌合抗体的表达情况。结果抗人CD28鼠人嵌合抗体得到表达并能与CD28分子特异性结合。结论抗人CD28鼠-人嵌合抗体的构建和瞬时表达是成功的,为后续构建稳定分泌抗人CD28鼠-人嵌合抗体的CHO基因转染细胞株奠定了基础。     

抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体的构建和表达

目的:构建嵌合型抗人膀胱癌抗体的真核表达载体,并实现其真核表达.方法:从杂交瘤细胞中克隆得到鼠源单抗的可变区基因,插入嵌合抗体IgG1真核表达载体pDHL中,转染 CHO细胞,实现其真核表达,并对抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体的功能进行初步鉴定.结果:成功构建抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体,并实现其真核表达. 初步的功能鉴定表明抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体具有较好的特异性和亲合力.结论 :构建的抗人膀胱癌人-鼠嵌合抗体真核表达载体在真核细胞内得到表达 ,且其功能较为理想.     

抗HFRS病毒单抗1A8鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体的构建及表达

目的 构建HFRS病毒mAb1A8鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体，并进行表达。方法 将抗HFRS病毒mAb1A8的VH基因和人重链CH1基因加接，VL基因和人Ck基因连接，分别构建了鼠/人嵌合重链Fd基因和轻链基因，将它们克隆人pComb3，构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗表达载体，用辅噬菌体VCSM13超感染，ELISA间接夹心法检测抗体活性。结果 经多种限制性内切酶酶切鉴定载体构建正确，ELISA间接夹心法检测超感染上清为阳性。结论 成功构建了鼠/人嵌合Fab噬菌体抗体表达载体，并在噬菌体表面表达出可结合HFRS病毒抗原的鼠/人嵌合Fab抗体。     

抗CD71人-鼠嵌合抗体的体外抗肿瘤效应研究

目的 对抗CD71人-鼠嵌合抗体体外抗肿瘤效应进行研究。方法 以表达CD71分子的3种人类肿瘤细胞（K562，CEM和SMMC-7721）为靶细胞，以正常人外周血单个核细胞（PBMC）为效应细胞，在效/靶细胞比为50：1的条件下，测定嵌合抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应（ADCC）；以CEM和SMMC-7721为靶细胞，在有新鲜补体存在下，测定嵌合抗体的补体依赖性细胞毒效应（CDC）。结果 抗CD71人-鼠嵌合抗体（D2C）能够通过识别CD71分子，并通过人抗体Fe段介导ADCC。在有新鲜补体存在下，介导CDC。结论 抗CD71人-鼠嵌合抗体对CD71^ 肿瘤细胞可介导ADCC和CDC。     

重组抗死亡受体5人-鼠嵌合抗体的表达和活性研究

目的 获得重组抗死亡受体5(DR5)全长人-鼠嵌合抗体表达并研究其生物学活性.方法 利用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)连接人-鼠嵌合抗体的重链和轻链,形成一个开放阅读框(ORF),插入慢病毒表达载体pWPXL,构建重组抗DR5全长人-鼠嵌合抗体表达载体pWPXL-HF2AL;采用Western印迹测定该嵌合抗体的表达和采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其与抗原的结合特异性;使用四唑氮盐(MTS)比色法分析其对肿瘤细胞的杀伤活性.结果 利用F/2A多肽技术表达的人-鼠嵌合抗体可在F/2A处自我剪切,人-鼠嵌合抗体的轻、重链表达对称并具有与其母本鼠源抗体相似的亲和力和杀伤多种肿瘤细胞的活性.如含3μg/ml嵌合抗体的培养基使结肠癌细胞HCT116、肝癌细胞SMMC7721、肺癌细胞A549和神经胶质瘤细胞U251的细胞存活率分别降低至20.6%±2.6%,35.1%±2.7%,76.1%±6.2%和15.6%±2.0%.结论 成功实现F/2A多肽介导的全长人-鼠嵌合抗体的表达,为肿瘤的生物治疗提供了新的策略.

Abstract：

Objective To express a full-length human-mouse chimeric anti-DR5 antibody from a single open reading frame with tumoricidal activity to various cancer cells.Methods The heavy and light chains of chimeric antibody were joined by the Furin and 2A (F/2A) self-cleavage peptide and cloned into a lentiviral vector of pWPXL.Then the HEK293 cells were infected with the constructed expression vector pWPXL-HF2AL.Western blot,enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and MTS assay were used to detect the chimeric antibody expression,cleavage,binding affinity to the antigen and tumoricidal activity to various tumor cells.Results The recombinant chimeric antibody was successfully expressed from a single open reading frame in pWPXL-HF2AL construct.And it possessed a similar binding affinity to the parental murine counterpoint and strong tumoricidal activity to various cancer cells.For example,on the concentration of 3 μg/ml,it made the relative cells viability of HCT116,SMMC7721,A549 and U251 down to 20.6% ±2.6% ,35.1% ± 2.7% ,76.1% ±6.1% and 15.6% ±2.0% respectively.Conclusions The human-mouse chimeric anti-DR5 antibody of F/2A peptide is successfully expressed.Possessing a strong tumoricidal activity in various cancer cells,it may provide a novel strategy for cancer biotherapy.     

抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4人/鼠嵌合Fab抗体片段的制备及功能鉴定

目的:构建日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的人/鼠嵌合Fab(cFab)抗体片段,并对cFab抗体片段结合活性进行鉴定.方法:用抗体框架区的通用引物PCR扩增抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4的VH及VL基因,测序分析其核苷酸序列.将测序正确的鼠源VH、VL分别与人IgG1的CH1、CL通过Overlap PCR扩增Fd及全长L,再利用Overlap PCR以Fd和全长L基因为模板扩增cFab基因.将cFab基因片段克隆至载体pComb3XSS中构建表达载体pComb3XSS-Fab,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导进行蛋白可溶性表达.通过Western blot和ELISA方法对cFab抗体片段进行检测.结果:构建出抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab表达载体,Western blot结果证实在大肠杆菌Top10F'中表达出cFab可溶性抗体片段,ELISA结果显示cFab抗体片段与可溶性虫卵抗原(SEA)有较好的结合活性.结论:表达、纯化了抗日本血吸虫单克隆抗体NP11-4 cFab抗体片段,cFab抗体片段具有与亲本抗体相同的抗原结合能力,为制备抗日本血吸虫人源化免疫毒素提供了技术贮备.     

HIV-1 gag-gp120嵌合基因重组杆状病毒载体的构建

目的 :构建含有 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体。方法 :利用基因重组技术将 B亚型中国株 HIV- 1的结构基因 gag与 gp12 0嵌合后再通过大肠杆菌 /杆状病毒系统构建重组杆状病毒载体。结果 :酶切电泳显示基因重组正确 ,电镜显示重组杆状病毒大量扩增。结论 :含有B亚型 HIV- 1(中国株 ) gag- gp12 0嵌合基因的重组杆状病毒表达载体构建成功 ,为进一步研究Gag- gp12 0嵌合蛋白的表达及其生物学活性奠定了基础。     

以U1小核核糖核酸为靶向基因构建 HCV特异性嵌合体核酶

目的：以人类U₁小核核糖核酸为载体,构建特异性嵌合体核酶,以期用于HCV感染的基因治疗。 方法：将HCV特异性核酶序列设计为引物序列一部分,以人类U₁小核核糖核酸为模板,经PCR法及2次克隆得到嵌合体,使核酶序列替代U₁结构中第3个茎-环。 结果：经测序证实新建质粒中确实有核酶序列且替代了第3个茎-环。 结论：以U₁小核核糖核酸为靶向基因可以构建出HCV特异的U₁嵌合体核酶。     

抗鼠疫抗原F1的嵌合抗体制备及特性分析

目的：建立抗鼠疫F1嵌合抗体的稳定表达细胞系,表达并纯化嵌合抗鼠疫F1抗体并鉴定其活性。方法：提取鼠源杂交瘤细胞株4C6总核糖核酸（ribonucleic acid,RNA）,逆转录为互补脱氧核糖核酸（complementary DNA,cDNA）,通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）获得抗F1抗体轻链、重链可变区基因,全基因合成嵌合抗体的重链和轻链基因,并克隆于真核表达载体pMH3质粒中,共转染入中国仓鼠卵巢上皮细胞?S（Chinese hamster ovary cell?S,CHO?S）中,经遗传霉素（geneticin,G418）筛选得到稳定表达F1嵌合抗体的细胞株,悬浮培养后收集上清并亲和纯化。采用酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法检测其与F1抗原的特异性结合能力;通过竞争性ELISA比较嵌合抗体和鼠源亲本抗体与抗原的结合能力,同时测定抗体亲和力和质谱分析抗体特性。结果：成功获得稳定分泌抗鼠疫抗原F1 嵌合抗体的稳定表达细胞系,该抗体能够特异性结合F1抗原,抗体的亲和力为2.303×10-9 mol/L。结论：成功制备了抗体鼠疫F1的嵌合抗体,为后续动物体内实验及临床药物研发奠定了基础。     

Expression of Anti-CD4 Human/Murine Chimeric Antibody and Their Killer Tumor Activity

MonoclonalantibodiesagainstCD4molecule(anti-CD4McAb)ofhumanTlymphocyteshavebeensuccessfullyusedforthetreatmentofautoimmunediseasesandpreventionoforgantransplantationrejectioninhuman[1'Zj.However,murinemonoclonalantibodies(Ahs)haveimmunogenicityonhumanandproduceneutralizinghumananti-mouseantibodies(HAMA).ToreducetheimmunogenicityofmurineMcAbinhuman,chimericAhshavebeenproduced,inwhichtheVregionsofthemouseantibodywiththedesiredspecificityarecombinedwithhumanCregions["4j.Inthisstudy,anti-C…     

Anti-proliferative effects induced by anti-CD4 human/murine chimeric antibody and murine anti-CD4 monoclonal antibody

Summary The effects of chimeric anti-CD4 human/murine chimeric antibody and murine anti-CD4 monoclonal antibody (McAb) on the proliferation induced by anti-CD3 McAb, phytohemagglutinin (PHA), IL-2, and allogeneic cells were studied. The results showed that chimeric anti-CD4 antibody and murine anti-CD4 McAb could inhibit the proliferation induced by the above inducers and the inhibitory effects were related to the dosage of the antibodies. This project was supported by a grant from the National Sciences Foundation of China (Serial No. 39370628).     

抗人大肠癌HCAb嵌合抗体在CHO细胞中的高效表达

目的 在CHO细胞中高效表达抗人大肠癌HCAb人-鼠嵌合抗体.方法 从分泌鼠源单抗CAb的杂交瘤细胞中克隆、扩增可变区基因,测序鉴定后连入真核表达载体,转染二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢（dihydrofolate reductase-deficient Chinese hamster ovary,CHO-dhfr-）细胞进行表达.经G418及氨甲喋呤（MTX）梯度加压筛选进行嵌合抗体的高效表达,并用夹心ELISA方法测定嵌合抗体表达产量.结果 采用RT-pCR、夹心ELISA等实验证实了所表达的抗人大肠癌HCAb嵌合抗体的人源性.培养上清中的抗体产量可达20mg/L.结论 成功的实现了抗人大肠癌HCAb人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中高效表达,为其进一步在大肠癌临床诊治中的应用奠定了基础.     

GFR/DDR2嵌和受体的构建和稳定表达的鉴定

目的：将一在细胞膜表面不表达或低表达的受体胞外区与盘状结构域受体2(DDR2)的胞内区融合，构建一嵌和DDR2受体，避免在活化此受体的同时激活与DDR2有相同配体的受体介导的信号通路，为探索DDR2介导的胞内信号途径奠定基础．方法：采用PCR扩增和限制性酶切的方式，将表皮生长因子受体(EGFR)的胞外区与DDR2的跨膜及胞内区进行融合并稳定转染EGFR低表达的293细胞，G418筛选，流式细胞仪检测嵌和受体在膜表面的表达状况．结果：成功构建了EGFR／DDR2嵌和表达载体；筛选到稳定表达此嵌和受体的293细胞株．结论：融合并稳定表达了EGFR／DDR2嵌和受体．