内皮祖细胞对局灶性脑缺血大鼠血管内皮修复作用的实验研究

目的 探讨内皮祖细胞对局灶性脑缺血后局部血管内皮的修复作用.方法 60只健康雄件SD大鼠随机分为对照组(5只)、假手术组(5只)和缺血-再灌注组(缺血组,50只),线拴法制备大腑中动脉闭塞模型,流式细胞术和免疫组织化学染色检测外周血 CD34和脑组织AC133表达水平.结果 再灌注后3 d,4d和7 d,缺血组大鼠外周血CD34表达水平降低且显著低于对照组和假手术组(均P<0.01);至再灌注后14d恢复至正常值水平,与对照组和假手术组比较差异无统计学意义(均P>0.05).再灌注后4 d,缺血组大鼠梗死侧大脑半球缺血半暗带区部分血管内皮细胞AC133表达阳性,主要集中于中、小血管内皮细胞胞质;其余各时间点各组大鼠AC133均表达阴性.结论 缺血-再灌注早期外周血CD34表达水平明显降低,梗死侧大脑半球缺血半晴带区部分血管内皮细胞AC133表达阳性,提示内源性内皮祖细胞可能参与局部血管内皮的修复.     

电针预处理对脑缺血再灌注大鼠行为学及外周血内皮祖细胞的影响

目的观察电针预处理对脑缺血再灌注损伤（CIRI）大鼠行为学及外周血内皮祖细胞（EPCs）水平的影响。 方法45只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和电针预处理组（EA组）,每组15只。模型组于造模前将大鼠束缚14 d,采用Longa线栓法制备大脑中动脉缺血再灌注模型;假手术组除不插入线栓外,余同模型组;EA组在造模前14 d行电针预处理,余同模型组。造模当天监测大鼠脑血流量,造模后1 d计算脑梗死体积,造模后1、3、7、21、28 d分别采用改良神经功能缺损评分（mNSS）、旷场实验和Morris水迷宫实验对大鼠相关指标进行检测,取外周血采用流式细胞术测定EPCs水平。 结果模型组和EA组造模过程中各时间点的脑血流量明显低于假手术组,EA组在线栓即刻及再灌注30 min的脑血流量高于模型组,差异均有统计学意义（P<0.05）。模型组和EA组脑梗死体积百分比显著高于假手术组,EA组脑梗死体积百分比显著低于模型组,差异均有统计学意义（P<0.05）。EA组造模后1、3、7及21 d的mNSS评分均低于模型组,差异有统计学意义（P<0.05）。EA组大鼠旷场实验的平均速度在造模后1 d明显高于模型组,目标象限滞留时间百分比在造模后3 d高于模型组,差异有统计学意义（P<0.05）。外周血EPCs水平在造模后2 d高于模型组,差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论电针预处理一定程度上可以改善急性期CIRI大鼠的脑血流状态,减轻神经功能损伤,提升学习记忆能力和运动能力,提高外周血中EPCs水平。     

局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠外周血内皮祖细胞数量的变化及其意义

目的 探讨局灶性脑缺血再灌注损伤(CIR)大鼠外周血内皮祖细胞(EPCs)数量的变化及其意义.方法 50只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组(5只)、假手术组(5只)、CIR模型组(15只)、糖尿病模型组(5只)、糖尿病假手术组(5只)和糖尿病合并CIR组(15只).由链脲佐菌素(STZ)诱导制作糖尿病大鼠模型;采用线栓法制作CIR大鼠模型.各模型大鼠采用Longa评分标准进行神经功能评分.CIR模型组与糖尿病合并CIR组各取5只大鼠采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色,计算其脑梗死体积.用流式细胞仪计数各组大鼠外周血EPCs的数量.结果 糖尿病合并CIR组大鼠神经功能评分[(2.8±1.0)分]明显高于CIR模型组[(1.5±0.3)分],且脑梗死体积[(464.1±169.3)mm3]明显大于CIR模型组[(101.3±57.4)mm3](均P＜0.05).各组中,CIR模型组大鼠外周血EPCs数量最多,糖尿病合并CIR组最少,正常对照组与假手术组多于糖尿病模型组与糖尿病假手术组(均P＜0.01).结论 CIR大鼠外周血EPCs数量增加,有助于修复血管及保护受损脑组织;糖尿病大鼠外周血EPCs数量明显减少,且合并CIR后减少更甚.外周血EPCs数量的检测有助于CIR病情及预后的评估.     

缬沙坦对肾性高血压大鼠模型脑缺血-再灌注后细胞凋亡的影响

目的通过观察血管紧张素Ⅱ受体阻断药缬沙坦对肾性高血压大鼠模型脑缺血。再灌注后神经功能缺损程度和神经元凋亡的影响．探讨血管紧张素Ⅱ受体阻断药的神经保护机制。方法采用Wistar雄性大鼠建立肾性高血压模型，随机分为缬沙坦大剂量组（12mg／kg）、小剂量组（6mg／kg）和缺血-再灌注组．分别于脑缺血2h-再灌注1h和脑缺血2h-再灌注24h时进行神经功能缺损程度评分，并采用TUNEL法和免疫组织化学方法检测海马组织缺血后细胞凋亡发生情况．以及Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达水平的变化。结果缬沙坦大剂量组和小剂餐组大鼠的神经功能缺损程度评分低于缺血-再灌注组（P=0．047，0．043），Bcl-2阳性细胞数目高于缺血-再灌注组（均P=0．000），Bax阳性细胞数目低于缺血-再灌注组（均P=0．000）．且神经元凋亡数目明显减少（均P=0．000）：缬沙坦大剂量组Bcl-2阳性细胞数目明显高于小剂量组（P=0．000）．Bax阳性细胞数目明显低于小剂量组（P=0．000）。神经元凋亡数目较小剂量组明显减少（P=0．000）。结论血管紧张素Ⅱ受体阻断药缬沙坦具有明显改善肾性高血压大鼠模型局灶性脑缺血后神经功能缺损程度、减少神经元凋亡、上调脑组织Bcl-2蛋白及抑制Bax蛋白表达水平的作用．对脑缺血-再灌注损伤后的脑组织有一定的保护作用。     

大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织STAT3变化的免疫组织化学研究

目的 探讨信号转导和转录激活子（ＳＴＡＴ）３在大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤中的表达及其与缺血性神经细胞损伤的关系方法 用ＡＢＣ免疫组化方法观察大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织中的ＳＴＡＴ３蛋白免疫反应阳性细胞分布。结果 正常和假手术大鼠脑内以及脑缺血后的非缺血半球脑组织中未发现有ＳＴＡＴ３免疫反应阳性细胞,脑缺血再灌注损伤后１２小时在栓塞侧梗死区可见少量ＳＴＡＴ３免疫阳性细胞,２４小时后阳性细胞显著增多达高峰,在缺血侧纹状体和缺血皮质周边区表达最明显,１周后梗死周边区少数神经细胞仍有阳性表达。差异有显著意义（Ｐ〈０．０１）。结论 ＳＴＡＴ３活化及超量表达可能介导了缺血神经细胞信号转导过程,并参与了脑缺血神经细胞损伤与修复的病理生理过程。     

雌激素抑制脑缺血再灌注损伤后炎症反应

目的：探讨雌激素对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后炎症反应的影响。方法：大鼠分3组：对照组、双侧卵巢切除（OVX）组、OVX＋17β－E2组（200μg/kg，皮下注射每周1次，共4周）。4周后线检地建立右侧大脑中动脉闭塞（MCAO）1h,2h再灌注0，1，3，6，22，70h模型。在HE染色缺血半球选取10个高倍视野计算脑组织内浸润的中性粒细胞均数，免疫组化检测核转录因子－κB（NF－κB）表达。结果：外源性雌激素替代可以对抗OVX引起的NF－κB过分表达，减少脑实质内中性粒细胞浸润，减轻局部炎症反应。结论：雌激素能抑制脑缺血再灌注损伤后炎症反应。     

高热对大鼠局部脑缺血再灌流损伤的影响

目的 研究短暂高热（脑温40℃）在脑缺血再灌流不同时间对脑损伤的影响。方法 采用自制的大鼠脑温调控装置,分别于大鼠局部脑缺血1b,再灌流2h,24h,48h,对大鼠进行短暂的高热或常温处理,高热或常温处理后24h对大鼠进行神经功能缺损评分。72h后测脑梗死体积。结果 大鼠脑缺血再灌流2h时,40℃高热可导致脑梗死体积显著增大,神经功能显著恶化,而再灌流24h或48h后高热对脑损伤的作用不明显。结论 脑缺血后,短暂高热仅在再灌流早期对缺血性脑损伤有加重作用。高热加重缺血性脑损伤的时间窗可能仅限于脑缺血再灌流后24h内。     

大鼠全脑缺血/再灌注模型之比较研究

目的：观察常用大鼠全脑缺血／再灌注模型在缺血及再灌注过程中ｒＣＢＦ及ＥＥＧ的变化。方法：用ｐｅｒｆｌｕｘ－３型多谱勒灌注监测测定局部脑血流量变化。用脑电图仪监测脑电波变化。结果：２ＶＯ组,３ＶＯ组与颈动脉分流组在缺血２５ｍｉｎ时ｒＣＢＦ较Ｖ４ＶＯ组下降明显。３ＶＯ组颈动脉分流组再灌注３０ｓ内ｒＣＢＦ上升较４ＶＯ组及２ＶＯ组变化较慢。     

脑缺血预处理对大鼠外周血内皮祖细胞及血管新生的影响北大核心CSCD

目的探讨脑缺血预处理对缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)大鼠外周血内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)及缺血区脑组织血管新生的影响,并分析EPCs的数量与血管新生关系。方法 SD大鼠108只,随机分为3组:假手术(sham operation,SO)组、大脑中动脉缺血(middle artery occlusion,MCAO)组、脑缺血预处理(brain ischemic preconditioning,BIP)组,各36只,每组再分为缺血再灌注前0 h、缺血再灌注后3 h、24 h、3 d、5 d、7 d 6个时点,每个时点6只大鼠。用Zea Longa评分标准进行神经功能评分。用流式细胞仪计数外周血EPCs数目。用免疫组织化学染色法检测缺血区脑组织新生血管密度。结果 1神经功能缺失评分:再灌注3 h后,BIP组、MCAO组均出现不同程度的神经功能缺失,且BIP组较MCAO组评分低(5 d:1.00±0.63;7 d:1.00±0.63,P<0.05);2外周血EPCs数目:再灌注3 h后,MCAO组外周血EPCs数目开始降低,BIP组逐渐升高,且BIP组较MCAO组明显增加(24 h:0.58±0.07;3 d:0.80±0.10;5 d:0.68±0.05;7 d:0.52±0.03,P<0.01);3新生血管数目:BIP组、MCAO组分别于再灌注后3 d、5 d出现新生血管,且BIP组较MCAO组多(5 d:14.53±3.44;7 d:41.40±5.62,P<0.01);4Pearson相关分析表明,缺血区脑组织新生血管密度与外周血EPCs数量呈正相关(5 d:r=0.855,P<0.01;7 d:r=0.946,P<0.01)。结论 BIP能促进脑IRI大鼠EPCs的动员,有助于增加缺血区脑组织血管新生。     

自体骨髓内皮祖细胞移植治疗动脉粥样硬化大鼠急性脑缺血的实验研究

目的 探讨自体骨髓内皮祖细胞移植治疗动脉粥样硬化大鼠急性局灶性脑缺血的有效性.方法 高脂膳食制备20只动脉粥样硬化大鼠模型,采集骨髓,分离血管内皮祖细胞(EPCs)并扩增培养,检测其表面标记物的表达;第7天采用线栓法制作急性局灶性脑缺血模型,造模后3 h进行移植,其中实验组经颈静脉自体移植BrdU标记的EPCs,对照组给予等量的PBS.急性脑缺血术后6 h和第1、3、7、10、14天通过神经功能缺损评分(mNSS)量表行行为学评价,免疫组化染色观察BrdU标记的EPCs在缺血脑组织的分布和血管密度.结果体外培养大鼠骨髓来源的EPCs,细胞数目可达到5×106;CD34免疫荧光和FLK-1免疫组化鉴定呈阳性,并能特异性吸附FITC-UEA和内吞DIL-Ac-LDL.第14天实验组mNSS得分为6.13±0.30.对照组为8.50±0.46,比较差异具有统计学意义(P<0.05),实验组神经功能的恢复优于对照组.第28天实验组脑缺血区和血管壁可见BrdU标记的EPCs,而对照组则为阴性.免疫组化染色显示实验组大鼠缺血脑组织血管数为16.87±5.52,对照组大鼠缺血脑组织血管数为12.76±4.94,比较差异具有统计学意义(P<0.05).结论 从活体大鼠骨髓中分离的EPCs通过自体移植后可以进入脑缺血区并长期存活,其能够促进神经功能恢复,这可能与血管再生有关.     

人外周血内皮祖细胞培养方法的建立

背景：成人外周血来源丰富,但内皮祖细胞含量较少,为使其能够更好的应用于组织工程及细胞治疗,有必要建立外周血内皮祖细胞成熟、稳定的体外扩增体系。 目的：建立稳定的人外周血分离、培养和体外扩增血管内皮祖细胞的方法。 方法：应用密度梯度离心法,获取外周血单个核细胞,将分选后细胞接种于预先包埋了人纤维连接蛋白的培养板上,加入内皮祖细胞专用培养基中培养3 d后,洗掉非贴壁细胞,培养至第6天,收集贴壁细胞,应用倒置显微镜和苏木精-伊红染色进行细胞形态学观察;采用MTT法和细胞计数测定第1,3代细胞生长曲线;应用流式细胞仪测定祖细胞和内皮细胞系标志,对培养的细胞进行鉴定。 结果与结论：细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第6天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢,同时表达干细胞表面标志CD34、CD133和内皮细胞表面标志血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体2。证明人外周血可以分离培养内皮祖细胞。     

丁苯酞对急性缺血性卒中患者外周血内皮祖细胞的影响

目的 观察丁苯酞(NBP)治疗对急性缺血性卒中患者外周血内皮祖细胞(EPCs)水平及美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评分的影响;探讨其疗效及潜在机制.方法 筛选首次发病48 h内入院的急性缺血性卒中患者96例,按随机数字表分为NBP治疗组(NBP组)及安慰剂组.NBP治疗30 d为1个疗程.流式细胞仪检测CD34 +/CD133 +/KDR+标记细胞作为EPCs标志.分别检测入院当天(基线期)、治疗第7天、第14天和第30天外周血EPCs水平;并分别于上述时间点及病程90 d时进行NIHSS评分.结果 NBP组第7天、第14天、第30天时EPCs数量较基线期显著增加(均为P＜0.05);且明显高于同期安慰剂组(分别为P＜0.05、P＜0.001、P＜0.001).NBP组第7天NIHSS评分较基线期无明显改善(P ＞0.05);NBP组第14天、第30天NIHSS评分均明显低于基线期(均为P＜0.05)及同期安慰剂组(P ＜0.05、P＜0.001).NBP组第90天NIHSS评分较第30天有进一步降低(P＜0.05).发病后3个月内NBP组缺血事件稍低于安慰剂组(P＞0.05).两组随访期内均无严重不良事件发生.结论 NBP治疗可显著改善急性缺血性卒中神经功能评分,可能通过提高外周血EPCs水平,改善预后,且安全性良好.     

实验性牙移动大鼠外周血内皮祖细胞的培养

背景：观察血管内皮祖细胞在牙周血管改建中的作用规律对于研究正畸牙周改建机制具有重要意义。 目的：对牙移动大鼠外周血内皮祖细胞进行体外分离、培养及鉴定,探讨牙齿移动是否可动员骨髓内皮祖细胞进入外周血。 设计、时间及地点：细胞体外分离培养及生物学指标检测,随机对照动物实验。于2007-09/2008-04在吉林省口腔生物医学工程重点实验室完成。 材料：24只Wistar大鼠,随机分为实验组和对照组,每组12只。 方法：实验组建立大鼠牙移动模型,对照组置牵拉装置但不加力。加力第2天取两组动物外周血制作细胞涂片,检测其中CD133阳性细胞数。同时以Percoll密度梯度分离提取其外周血单个核细胞,培养至第12天,取两组细胞爬片进行相关指标检测。 主要观察指标：以免疫细胞化学染色和免疫荧光化学染色检测细胞表面标志物,荧光化学检测细胞吸收乙酰化低密度脂蛋白及荆豆凝集素1情况,MTT法检测细胞增殖情况。 结果：实验组细胞涂片中CD133阳性细胞率明显高于对照组（P < 0.05）。所培养细胞可同时吸收Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白、FITC标记的荆豆凝集素1,呈CD133、Ⅷ因子、CD34阳性。实验组细胞增殖活性高于对照组（P < 0.05）。 结论：实验初步证实了实验性牙移动可动员大鼠骨髓内皮祖细胞进入外周血。     

急性脑梗死患者内皮祖细胞增殖能力和衰老研究

目的探讨急性脑梗死患者内皮祖细胞增殖能力和衰老的变化。方法诱导分化急性脑梗死患者和基础疾病与其相同的对照组患者的内皮祖细胞,检测2组内皮祖细胞增殖能力、集落、细胞计数和衰老情况并进行对比研究。结果急性脑梗死患者内皮祖细胞增殖能力增强,集落和细胞计数增加,与对照组相比差异具有统计学意义（P〈0．05）;但2组内皮祖细胞衰老差异无统计学意义（P〉0．05）。结论急性脑梗死时内皮祖细胞的增殖能力增强,但易于衰老的转归并未改变。     

颈内动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血内皮祖细胞的变化趋势

目的 观察急性颈内动脉粥样硬化性脑梗死患者外周血内皮祖细胞数目的 变化趋势.方法 分别于发病24 h,以及第4、7、14 和21 天时提取30 例成年急性脑梗死患者外周血单个核细胞,流式细胞术检测CD34和CD133表达水平,计数内皮祖细胞数目.结果 不同处理组患者各观察时间点外周血内皮祖细胞数目比较,差异均有统计学意义(P = 0.000).脑梗死后24 h,脑梗死组和颈动脉硬化组患者外周血内皮祖细胞数目均低于对照组(P = 0.000);脑梗死后第7 天,外周血内皮祖细胞数目减少至最低水平(P = 0.001),至第21 天外周血内皮祖细胞数目接近颈动脉硬化组水平(P = 0.901),但仍低于正常值范围(P = 0.000).内皮祖细胞数目的 变化与血小板计数之间不具有相关性(R2 = 0.852,P = 0.895).结论 颈内动脉系统粥样硬化所致脑梗死患者外周血内皮祖细胞数目低于正常值范围,且于急性期可能存在骨髓动员抑制,同时需要消耗大量内皮祖细胞以进行损伤内皮的修复,使得患者在急性期出现短暂性内皮祖细胞数目减少.     

外周血内皮祖细胞数量变化与颅内动脉瘤的生成

背景：动脉内膜损伤是动脉瘤发生的始动因素,内皮祖细胞能修复受损的动脉内膜。 目的：建立大鼠颅内动脉瘤模型,探讨动脉瘤大鼠内皮祖细胞数量变化及意义。 方法：40只SD大鼠随机分为两组,正常组作为正常对照,不给予任何干预。模型组大鼠手术结扎双侧肾动脉后支以及左侧颈总动脉,术后喂食含8%氯化钠鼠粮。于2周,1,2,3个月末测量大鼠内皮祖细胞变化,并与3个月末测量各组大鼠血压及动脉瘤大小,RT-PCR检测willis环相关基因表达。 结果与结论：模型组大鼠内皮祖细胞数目于2周后就开始下降,与正常组比较差异有显著性意义(P < 0.05),一直持续到3个月末(P < 0.01)。模型组大鼠动脉瘤壁基质金属蛋白酶9表达明显高于正常组正常大鼠(P < 0.01),而内皮型一氧化氮合酶明显低于正常(P < 0.05)。结果提示循环内皮祖细胞数量降低可能是动脉瘤生成的一个重要因素。