NOV基因真核表达载体的构建及在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建肾母细胞瘤过度表达(NOV)基因真核表达载体并检测其在真皮多能干细胞中的表达. 方法 利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,以新生大鼠大脑组织总RNA为模板,扩增出1 178bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后定向克隆入真核表达载体pEGFP-N1质粒中,用脂质体法将重组质粒转染入大鼠真皮多能干细胞中,荧光显微镜观察转染产物,RT-PCR法检测转染细胞中NOV基因表达. 结果 NOV基因cDNA正确克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中;重组质粒体外转染入大鼠真皮多能干细胞后,可见转染细胞有绿色荧光表达.转染细胞中检测到NOV基因. 结论 构建成功NOV基因重组质粒,并能在大鼠真皮多能干细胞中稳定表达,为NOV基因及真皮多能干细胞的作用研究提供了有利的分子工具.     

野生型Ⅱ型神经纤维瘤病基因Ⅱ亚型真核表达载体的构建及其功能

目的构建野生型Ⅱ型神经纤维瘤病基因（NF2）Ⅱ亚型的真核表达载体，观察其在人胚胎肾细胞293（HEK293）中的表达并检测其转染神经鞘瘤细胞（RT4）后的功能。方法以人胎脑cDNA文库中的NF2Ⅱ亚型基因为模板．应用聚合酶链反应技术扩增野生型NF2Ⅱ亚型基因，并定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1质粒中：经鉴定正确的重组质粒pEGFP-NF2Ⅱ亚型，用Lipofectamine2000脂质体导人人胚胎肾细胞293，通过荧光显微镜和Western Blotting法观察基因表达水平：随后转染大鼠神经鞘瘤细胞．利用水溶性四氮唑法观察野生型NF2Ⅱ亚型基因对大鼠神经鞘瘤细胞增殖的影响。结果经序列分析证实，克隆的NF2Ⅱ亚型基因与Genebank中的序列完全一致。DNA琼脂糖凝胶电泳检测显示，经双酶切后的质粒pEGFPcDNA片段大小约为4700bp：NF2Ⅱ亚型基因cDNA片段大小为l770bp，NF2Ⅱ亚型基因的真核表达载体可瞬时转染人胚胎肾细胞293，通过荧光显微镜和Westem Blotting方法得到证实；水溶性四氮唑法检测显示，转染pEGFP-NF2Ⅱ亚型并表达NF2Ⅱ亚型编码蛋白的293细胞与对照组293细胞的增殖指数相同。结论所构建的野生型NF2Ⅱ亚型基因真核表达载体可在人胚胎肾细胞293中表达，且不具有抑制肿瘤细胞增殖的特性。     

pEGFP-N1-APOE ε2重组质粒的构建与鉴定

目的构建pEGFP-N1-APOEε2真核表达重组质粒。方法应用基因定点突变手段,根据载脂蛋白E(apolipoprotein E,ApoE)基因cDNA克隆基因序列和表达载体增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)质粒上的多克隆位点设计引物,对质粒APOE基因cDNA克隆(pMD18-T-APOE3)进行基因定点突变,得到含有APOE2基因的目的片段,将此目的片段插入载体启动子下游,与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的基因融合。重组质粒经菌液PCR、限制性内切酶酶切和测序,鉴定目的基因是否成功插入pEGFP-N1质粒。结果对所得pEGFP-N1-APOEε2质粒插入部分测序结果显示,pEGFP-N1-APOEε2质粒的方向及序列正确,阅读框正确无误,表明APOEε2基因定点突变正确,重组pEGFP-N1-APOEε2质粒构建成功。结论成功构建了pEGFP-N1-APOEε2真核表达重组质粒。     

大鼠Akt1基因真核表达载体构建及其在293细胞中的表达

背景: Akt在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色。虽然Akt的作用机制目前尚有很多的未知领域,但其作为生存信号的一个重要组件,已成为近年分子生物研究中的一个重要课题。 目的：构建Akt1基因真核表达载体 pDC316-Akt1,观察其在293细胞(人胚肾母细胞)中的表达。 设计、时间及地点：观察性实验,于2006-09/12在解放军军事医学科学院分子生物实验室完成。 材料：pDC316质粒,由本元正阳公司提供;DH5α、293细胞为自备。 方法：采用反转录-聚合酶链反应方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1DNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体pDC316的EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点,构建Akt1真核表达载体 Akt-pDC316,脂质体介导法转染293细胞。 主要观察指标：蛋白免疫印迹检测转染293细胞中Akt1的表达。 结果：经测序鉴定,构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞,蛋白免疫印迹检测可见相对分子质量55 000位置有Akt1的表达。 结论：构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分的表达。     

Atrophin-1全长基因稳定转染和瞬时转染真核细胞系的表达分析

目的建立正常(CAG重复次数为19次)和异常(CAG重复次数为82和66次)atrophin-1[齿状核红核苍白球路易体萎缩(DRPLA)致病基因]全长基因真核表达体系,通过观察细胞形态及蛋白质表达水平和分布情况,比较稳定转染和瞬时转染两种细胞表达体系,为进一步研究建立良好的细胞模型。方法基于已构建的GFP-atrophin-1-Q19/Flp-In TREx293和GFP-atrophin-1-082/Flp-In TREx293两种稳定转染细胞株,利用四环素调控系统Tet-on诱导表达。正置荧光显微镜观察正常与异常atrophin-1融合蛋白在细胞中的表达定位,电子显微镜观察细胞超微结构的改变;脂质体介导法将重组真核表达质粒GFP-atrophin-1-Q19和GFP-atrophin-1-Q66瞬时转染293T和SH-SY5Y细胞,HE染色、倒置荧光显微镜和电子显微镜分别观察细胞形态结构、蛋白质表达定位和细胞超微结构,western blotting检测atrophin-1融合蛋白表达水平。结果在稳定转染体系中,绿色荧光信号大多位于细胞核内,异常蛋白质呈不均匀分布且有少数聚集现象;电子显微镜观察异常细胞胞核结构欠完整,核膜皱缩,核内结构紊乱。在瞬时转染293T细胞体系中,HE染色可见异常细胞核内形成粉紫色嗜酸性小体;大量atrophin-1融合蛋白在核内呈点状聚集现象;电子显微镜观察异常细胞核膜皱缩严重,核内大量电子致密物沉积且核仁消失;western blotting检测均表达atrophin-1融合蛋白。在转染的SH-SY5Y细胞体系中,蛋白质表达定位及western blotttng检测结果与转染293T细胞基本一致。结论包含异常扩增多聚谷氨酰胺链的atrophin-1融合蛋白在真核表达体系中可产生明显的核内聚集现象,并引起细胞形态改变,此为研究DRPLA核内包涵体的形成及其在发病中的作用,以及进一步的干预治疗奠定了理论基础。     

Atrophin—1全长基因稳定转染和瞬时转染真核细胞系的表达分析

目的建立正常（CAG重复次数为19次）和异常（CAG重复次数为82和66次）atrophin-1[齿状核红核苍白球路易体萎缩（DRPLA）致病基因]全长基因真核表达体系,通过观察细胞形态及蛋白质表达水平和分布情况,比较稳定转染和瞬时转染两种细胞表达体系,为进一步研究建立良好的细胞模型。方法基于已构建的GFP-atrophin-1．019／Flp—In TREx293和GFP—atrophin-1-Q82／Flp—InTREx293两种稳定转染细胞株,利用四环素调控系统Tet—on诱导表达。正置荧光显微镜观察正常与异常atrophin-1融合蛋白在细胞中的表达定位,电子显微镜观察细胞超微结构的改变;脂质体介导法将重组真核表达质粒GFP—atrophin-1-Q19和GFP—atrophin-1-Q66瞬时转染293T和SH—SY5Y细胞,HE染色、倒置荧光显微镜和电子显微镜分别观察细胞形态结构、蛋白质表达定位和细胞超微结构,Western blotting检测atrophin-1融合蛋白表达水平。结果在稳定转染体系中,绿色荧光信号大多位于细胞核内,异常蛋白质呈不均匀分布且有少数聚集现象;电子显微镜观察异常细胞胞核结构欠完整,核膜皱缩,核内结构紊乱。在瞬时转染293T细胞体系中,HE染色可见异常细胞核内形成粉紫色嗜酸性小体;大量atrophin-1融合蛋白在核内呈点状聚集现象;电子显微镜观察异常细胞核膜皱缩严重,核内大量电子致密物沉积且核仁消失;Western blotting检测均表达atrophin-1融合蛋白。在转染的SH-SY5Y细胞体系中,蛋白质表达定位及Western bloning检测结果与转染293T细胞基本一致。结论包含异常扩增多聚谷氨酰胺链的atrophin-1融合蛋白在真核表达体系中可产生明显的核内聚集现象,并引起细胞形态改变,此为研究DRPLA核内包涵体的形成及其在发病中的作用,以及进一步的干预治疗奠定了理论基础。     

可溶性血管内皮细胞生长因子受体1真核表达载体pEGFP-N1/sflt-1构建及在人脐静脉内皮细胞中的表达

背景：研究表明,可溶性血管内皮生长因子受体Flt-1(sflt-1)基因在多种组织中表达,但其在内皮细胞中的表达尚待证实。 目的：获取人sflt-1基因,构建sflt-1基因真核表达载体pEGFP-N1/sflt-1重组质粒,检测其在人脐静脉内皮细胞中的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-05/12在南昌大学第二附属医院分子中心完成。 材料：pEGFP-N1真核表达载体为南昌大学第二附属医院分子中心保存,人脐静脉内皮细胞株购至南京基凯生物技术公司。 方法：从含有目的基因的质粒克隆模板中,利用酶切的方法获得目的基因,将目的载体进行酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转化细菌感受态细胞,PCR鉴定为阳性的克隆,证明目的基因已经定向连入目的载体。再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确的即为构建成功的融合蛋白表达质粒载体。用脂质体法将pEGFP-N1/sflt-1重组质粒转染人脐静脉内皮细胞。 主要观察指标：①重组质粒的酶切鉴定结果。②重组质粒的测序鉴定结果。③荧光显微镜及蛋白免疫印迹检测sflt-1基因在人脐静脉内皮细胞中的表达。 结果：①对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,与sflt-1基因片段全长2 063 bp理论值相符,证实pEGFP-N1/sflt-1重组质粒构建成功。②重组质粒送至上海捷瑞生物技术公司进行通测,测序结果证实插入片段序列与理论值完全一致。③荧光显微镜下可见重组质粒转染人脐静脉内皮细胞发绿色荧光,蛋白免疫印迹检测表明sflt-1基因能在人脐静脉内皮细胞中表达。 结论：实验成功构建了携带人血管内皮生长因子受体Flt-1的重组pEGFP-N1/sflt-1真核表达质粒,并证实其在人脐静脉内皮细胞中的表达。     

重组外源性人热休克蛋白70基因真核表达载体的构建及鉴定

背景：热休克蛋白70的肿瘤免疫作用近年来受到国内外学者的广泛关注,然而目前常用的诱导内源性热休克蛋白70表达的方法,如热应激、缺血预处理等均存在一些弊端。 目的：拟构建携带并正确表达外源性人热休克蛋白70基因的重组真核表达载体。 方法：外源性热休克蛋白70基因连接入真核表达载体pDC315-EGFP中,转化大肠杆菌感受态细胞,重组真核表达载体外源基因测序及PCR检测鉴定阳性克隆后转染人胚肾293细胞,荧光显微镜及western blot鉴定外源基因在细胞中的表达。 结果与结论：经PCR和测序证实外源性人热休克蛋白70基因正确重组入真核表达载体pDC315-EGFP,转染293细胞后荧光显微镜观察到绿色荧光蛋白GFP的表达,Western blot检测到热休克蛋白70在293细胞中有效表达。     

血管内皮细胞生长因子介导的免疫毒素抗胶质瘤的体外实验研究

目的 构建血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因和铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38)基因的真核融合表达载体,并研究其表达产物对U251细胞的影响.方法 通过PCR获得本实验需要的VEGF165基因片段,通过酶切pRB391质粒获得铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建VEGF165与PE38融合基因的真核表达载体pIREs2-VEGF165-PE38-EGFP,经酶切及DNA测序证实构建成功后,用Lipofectamine2000脂质体转染293细胞,然后用RT-PCR及Elisa法检测VEGF165-PE38融合蛋白在293细胞的表达,并利用转染细胞后的培养上清体外测定VEGF165-PE38融合蛋白对U251的选择性细胞毒作用.结果 酶切分析及DNA测序证实,VEGF165-PE38融合基因被成功克隆入真核表达质粒载体pIRES2-EGFP,RT-PCR及Elisa法检测证实重组基因可在293细胞表达.细胞转染上清对U251具有较强的细胞抑制效应.结论 VEGF165-PE38融合基因构建,表达及其功能的初步研究,为进一步研究其对胶质瘤的靶向毒性及临床应用奠定基础.     

Ⅱ型神经纤维瘤基因突变型的构建及生物学功能研究

目的 构建Ⅱ型神经纤维瘤(NF2)抑癌基因546位点突变的真核表达载体,并在大鼠神经鞘瘤细胞(RT4)中诱导表达.方法 用定点突变法将pEGFP-N1-NF2第546位异亮氨酸(Ⅱe)突变为蛋氨酸(Met)从而构建NF2突变子pEGFP-N1-NF2~(△Ⅱe546Met),经酶切和测序鉴定后用脂质体法将其转染至RT4细胞,同时设pEGFP-N1-NF2转染组做为对照,Westem blot法检测细胞pEGFP-NF2蛋白的表达,MTT法检测转染后细胞的增殖情况. 结果 酶切测序证实定点突变成功,Western blot结果显示RT4细胞能表达pEGFP-NF2蛋白,pEGFP-N1-NF2~(△Ⅱe546Met)转染组RT4细胞抑制率低于pEGFP-N1-NF2转染组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了1个能够在RT4细胞中表达的单个点突变的NF2基因真核表达载体.     

人sTRAIL基因载体构建及其在真皮干细胞的表达

背景：基于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor，TNF)可溶性相关凋亡诱导配体(soluble related apoptosis inducing ligand, sTRAIL)抗瘤的生物特性，克隆sTRAIL基因，构建其真核表达载体，为肿瘤细胞凋亡的实验研究奠定基础。 目的：构建真核表达载体pEGFP-N1/sTRAIL，并转染真皮干细胞，以探究sTRAIL基因导入真皮干细胞的表达情况。 方法：采用RT-PCR二步法，以人胎盘组织总RNA为模板，扩增sTRAIL的cDNA序列，将其克隆入pMD18-T载体，随后亚克隆入载体pEGFP-N1中，构建其真核瞬时表达载体pEGFP-N1/sTRAIL，以Fugene 6转染技术，将sTRAIL基因导入真皮干细胞。倒置显微镜下观测转染后真皮干细胞生长变化及sTRAIL在其中的表达等情况。RT-PCR法对目的基因转染的真皮干细胞进行鉴定。 结果与结论：克隆到sTRAIL基因的cDNA序列，成功构建了其真核表达载体，该真核表达载体能携带sTRAIL基因在真皮干细胞中正常表达。倒置显微镜下观测到转染后真皮干细胞生长状态与未转染的真皮干细胞无差异。以经sTRAIL基因转染的真皮干细胞该基因组DNA为模板，用RT-PCR法能扩增到sTRAIL基因cDNA序列。     

Construction of a eukaryotic expression plasmid for human retina-derived neurotrophin-3

Neurotrophin-3 (NT-3) can promote the repair of central nervous system and retinal damage. In previous reports, NT-3 has been expressed by viral vectors. However, plasmid vectors have a safer profile compared with viral vectors in clinical studies. This study recombined amplified human retinal NT-3 with a eukaryotic expression plasmid containing green fluorescent protein (GFP) to construct an NT-3 expression plasmid, pEGFP-N1-NT-3. The transfection efficiency 48 hours after pEGFP-N1-NT-3 transfection to 293T cells was 50.06 ± 2.78%. Abundant NT-3-GFP was expressed in 293T cells as observed by fluorescence microscopy, suggesting the construct pEGFP-N1-NT-3 effectively expressed and secreted NT-3-GFP. Secretory vesicles containing NT-3-GFP were observed in a constant location in cells by laser scan confocal microscopy, indicating the expression and secretion processes of NT-3 in eukaryotic cells were in accordance with the physical synthesis processes of secreted proteins. Western blot assay showed that pro-NT-3-GFP had a molecular weight of 56 kDa, further confirming NT-3-GFP expression. At 48 hours after transfection, the concentration of NT-3 in culture medium was 22.3 ng/mL, suggesting NT-3 produced by pEGFP-N1-NT-3 was efficiently secreted. This study constructed a human retinal-derived NT-3 eukaryotic expression plasmid that efficiently expressed and secreted NT-3.     

空肠弯曲菌cdtA、cdtB及cdtC真核表达重组载体的构建与表达

目的以空肠弯曲菌(CJ)细胞扩张毒素(cytolethal distending toxi,CDT)cdtA、cdtB及cdtC为目的基因,构建CJ-cdtA、cdtB及cdtC基因的真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-cdtA,pcDNA3.1(+)-cdtB,pcDNA3.1(+)-cdtC,为CJ核酸疫苗的研制提供实验材料。方法用Primer5.0软件分析GenBank中空肠弯曲菌细胞扩张毒素cdtA、cdtB及cdtC基因序列,设计合成相应特异性引物,引入EcoRI、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,PCR扩增cdtA、cdtB及cdtC目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1(+)-cdtA、pcDNA3.1(+)-cdtB及pcDNA3.1(+)-cdtC;通过酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果扩增出特异的cdtA、cdtB及cdtC基因片段,大小约为807bp、798bp、570bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了CJ真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-cdtA、pcDNA3.1(+)-cdtB及pcDNA3.1(+)-cdtC。结论 PCR扩增得到了大小约为807bp、798bp、570bp的CJ-cdtA、cdtB及cdtC目的基因片段;并成功构建了pcDNA3.1(+)-cdtA、cdtB及cdtC真核表达重组载体。     

pDsRed-C1-CDNF真核表达载体在大鼠骨髓间质干细胞中的表达*

背景：骨髓间质干细胞是一类具有多向分化能力的成体干细胞,目前,已有将其作为细胞载体对帕金森病进行治疗的相关报道。 目的：构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并诱导其在大鼠骨髓间质干细胞中表达。 方法：通过RT-PCR的方法从小鼠组织中扩增出CDNF基因片段,并在其两端引入Xho I、BamH I限制性内切酶酶切位点,然后将其克隆至pDsRed-C1真核载体,构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并通过Lipofectin2000将其转染至大鼠骨髓间质干细胞中。 结果与结论：pDsRed-C1-CDNF真核表达载体经双酶切、单酶切、PCR及测序验证正确,提示已成功构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体并已转染至大鼠骨髓间质干细胞中。     

携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组慢病毒载体的构建及体外表达检测

目的 构建携带大鼠脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组慢病毒载体,并检测其体外表达目的 基因的能力.方法 应用基因克隆技术将大鼠BDNF基因克隆人慢病毒载体pFUW中,经过PCR、酶切和测序鉴定后,与包装质粒共转染293T细胞,制备并收集携带BDNF基因的慢病毒,重组病毒感染体外培养Hela细胞,利用实时定量PCR、蛋白质免疫印迹方法检测BDNF的表达情况,观察病毒转染效果.结果 PCR、酶切和测序鉴定,成功克隆了pFUW-BDNF重组子.所包装的重组慢病毒对Hela细胞的感染效率>90%,实时定量PCR、蛋白质免疫印迹方法可以检测到重组慢病毒感染Hela细胞后能高水平表达BDNF.结论 成功构建了携带BDNF基因慢重组病毒载体,并可在体外高水平表达其所携带的目的 基因,为将其进一步应用于神经系统损伤性疾病的治疗研究奠定了方法学某础.

Abstract：

Objective To construct lentiviral vector encoding the SD rat brain derived neurotrophic factor (BDNF) gene and examine its ability to express the BDNF gene in vitro. Methods The specific BDNF sequence was cloned into the plasmid of pFUW to construct the BDNF expression plasmid pFUW-BDNF. The recombinant plasmids were identified by DNA sequencing and restriction digestion. Then the packaging cell lines (293T cell) were cotransfected with the pFUW-BDNF together with the plasmids pLP1, pLP2 and pLP/VSVG by phosphate-calcium deposit method. The recombinant lentiviral vector was used to infecte the Hela cell, the expression of BDNF was detected by real-time quantitative PCR and western blot. Results The results showed the recombinant lentiviral vector carrying BDNF gene was constructed successfully and its infection efficiency in hela cell was above 90%. The recombinant lentiviral vector could up-regulated the expression of the BDNF gene. Conclusions The lentiviral vector carrying BDNF gene can enhance the expression of BDNF gene significantly,which lays the basis for its application in the treatment of the neurodamaged disease.     

pEGFPN1-GDNF真核表达载体的构建及其表达

目的 构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因真核表达载体并观察其在COS-7细胞内的表达.方法 应用RT-PCR从U251细胞总RNA中扩增GDNF cDNA,将其克隆至真核表达载体pEGFPN1,经酶切鉴定及序列分析后,以Fugene HD介导转染COS-7细胞,应用免疫细胞化学和Western blot鉴定其在细胞内的表达.结果 RT-PCR产物为650bp的特异片段,重组质粒pEGFPN1-GDNF经双酶切产生650bp和4.7kb的片段,测序分析结果与文献报道结果完全一致.将其转染COS-7细胞后,免疫细胞化学、Western blot结果表明GDNF蛋白能在COS-7细胞中正确表达.结论 成功构建了pEGFPN1-GDNF真核表达载体,为进一步开展帕金森病的基因治疗研究奠定了基础.     

人野生型parkin基因真核表达载体的构建及其在PC12细胞中的表达

目的 克隆人野生型parkin基因并构建真核表达载体pCDNA3．1—parkin，将重组质粒转染PC12细胞获得高表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆。方法 从胎脑组织中提取总RNA，用RT—PCR方法获得人野生型parkin基因的全长cDNA，插入pCR2．1—TA克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pCD—NA3．1，利用脂质体将重组质粒转染PC12细胞，经G418筛选获得抗性细胞克隆，采用RT—PCR和Western Blot方法鉴定人野生型parkin基因在PC12细胞中的过表达。结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒，RT—PCR和Western Blot证明经G418筛选得到的转基因PC12细胞克隆中存在人野生型parkin基因的表达。结论 成功构建了人野生型parkin基因的真核表达载体，获得了稳定表达人野生型parkin基因的PC12细胞克隆，为进一步研究parkin的生物学功能以及parkin在帕金森病发病机制中的作用奠定了良好的基础。     

Livin基因短发卡RNA表达质粒的构建及其对胶质瘤Livin基因表达的影响

目的构建凋亡抑制基因livin基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体,并观察其在人脑胶质瘤细胞中对livin基因表达的抑制。方法设计有小发夹结构的2条livinβ siRNA对应的DNA序列,将其克隆入pSliencer 3.1质粒,构建重组质粒pSliencer-livinβ,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。以脂质体法将pSliencer-livinβ转染人胶质瘤细胞。采用RT-PCR和Western-blot检测Livinβ蛋白的表达,筛选最有效的一组pSliencer-livinβ质粒。结果酶切及测序证实质粒pSliencer-livinβ构建成功。转染后胶质瘤细胞livinβmRNA和蛋白表达均受到明显抑制。结论成功构建livinβ基因的特异性短发卡RNA（siRNA）真核表达载体能够显著抑制人胶质瘤细胞livinβ基因的表达。