远缘链球菌细胞分裂蛋白的表达、纯化和抗体的制备

目的表达与纯化远缘链球菌克隆细胞分裂蛋白(ftsK),制备多克隆抗体并鉴定。方法利用IPTG诱导ftsK在大肠杆菌中表达,随后以再生Ni-NTA柱纯化蛋白。纯化后的蛋白多次注射于新西兰大白兔中,获取多克隆抗血清,ELISA法检测抗体效价,Westernblot法检测抗体特异性。结果获得了纯度较高的远缘链球菌ftsK蛋白及其抗体,多抗效价达到1∶10000,特异性较好。结论成功表达了远缘链球菌ftsK蛋白,获得了效价较高、特异性较强的多克隆抗体,为进一步研究ftsK蛋白功能获取了良好的工具。     

重组登革病毒2型NS1蛋白的分泌表达及其抗体制备

目的 分泌表达重组登革病毒2型NS1蛋白,并制备兔抗NS1多克隆抗体.方法 应用毕赤酵母表达系统表达全长登革病毒2型NS1蛋白,制备抗原,免疫家兔;采集免疫血清,制备兔抗NS1蛋白多克隆抗体;应用Western-blot、ELISA法鉴定和检测抗体效价;经辛酸-硫酸铵法、亲和层析法纯化抗体,SDS-PAGE电泳检测抗体的纯度;用Western-blot、ELISA法检测纯化后IsG性质及效价.结果 重组NS1蛋白获得分泌表达,其免疫血清经Western-blot、ELISA法证实获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,抗体效价为1:6000.结论 重组登革病毒2型NS1蛋白在毕赤酵母真核表达系统中高效表达,纯化产物有较强的免疫原性,成功获得特异性兔抗NS1多克隆抗体,为进一步研究登革病毒NS1蛋白及其抗体在登革病毒致病与免疫机制中的作用奠定了基础.     

柯萨奇病毒B3的多克隆抗体制备

目的制备柯萨奇病毒B3(coxsackievirus B3,CVB3)的多克隆抗体。方法针对CVB3基因的VP1区设计特异性引物,RT-PCR扩增VP1基因并将其克隆到pGEX-6p-1中,经IPTG诱导表达后,以GST-VP1融合蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。采用ELISA、Western blot以及间接免疫荧光检测多克隆抗体的效价和特异性。结果 ELISA检测血清的效价不低于1∶64 000,Western blot和间接免疫荧光显示该抗体具有良好的特异性。结论成功制备了效价较高的CVB3多克隆抗体,可应用于CVB3蛋白的检测。     

Tau40蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备

目的快速纯化tau蛋白，制备tau蛋白的多克隆抗体。方法依次使用差速离心、热失活、离子交换层析的方法纯化体外重组的人tau蛋白；用此纯化的蛋白免疫家兔制备多克隆抗体，用Western blot检测组织来源的样品，确定所制备抗体的特异性和效价。结果采用上述方法成功获得人类全长tau蛋白——tau 40；同时，所制备的tau蛋白多克隆抗体效价高，特异性好。结论本方法所获得的tau抗体效价高，特异性好，可以用于进一步的科学研究。     

人神经元特异性烯醇化酶蛋白表达及抗体制备

目的克隆和表达人的神经元特异性烯醇化酶(HuNSE)基因,制备HuNSE多克隆抗体,以期用于朊病毒病及相关疾病的临床诊断。方法经RT-PCR扩增HuNSE基因和测序验证后,将其克隆于原核表达载体pQE30,在大肠杆菌M15中诱导表达HuNSE蛋白,蛋白经Ni-NTA亲和纯化后,免疫兔子,所制备的抗血清用ELISA、Westernblotting和免疫组化鉴定。结果所表达的HuNSE蛋白相对分子质量约为22000,以其为抗原制备的HuNSE特异性抗血清具有良好的免疫反应性。Westernblotting和免疫组化结果显示抗血清可识别重组和不同哺乳动物脑组织中的NSE蛋白。结论NSE基因在大肠杆菌中获得了高效表达,所制备的NSE特异性抗血清可用于朊病毒病及其他神经退行性疾病的诊断和研究。     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

BLCAP蛋白多克隆抗体制备及其免疫学特性鉴定

目的:利用大肠杆菌BL21(DE3)表达BLCAP融合蛋白并制备和鉴定其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a(+)-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,诱导表达带有His标签的目的融合蛋白,经Ni2+亲和层析纯化回收后免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western blot检测抗体的特异性和亲和性。结果:成功获得分子质量约为28 kU纯化的融合蛋白,免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP的多克隆抗体。ELISA测定显示抗体效价可达到1∶10 000。通过Western blot检测证明该抗体有较好的针对BLCAP蛋白的专一性。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性。制备的特异性和效价良好的抗BLCAP的多克隆抗体,能够满足针对BLCAP免疫印迹和细胞免疫组化检测等实验要求,为今后深入研究BLCAP蛋白性质与功能提供了有用的实验工具。     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

新基因ZNFD的克隆及其多克隆抗体的制备

目的:PCR扩增得到新基因ZNFD(Znf domain containing protein),构建pET32a-ZNFD原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:通过PCR的方法克隆新基因ZNFD,选取部分抗原免疫原性较高的部分ORF序列,克隆到原核表达载体pET32a上,利用大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)表达系统表达ZNFD融合蛋白。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过琼脂糖双向扩散实验和Western blot鉴定其效价和特异性。结果:经测序鉴定已成功克隆ZNFD基因。通过构建原核表达载体pET32a-ZNFD,在大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中使用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约为45 kD的融合蛋白。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强的免疫特异性。结论:得到纯化的ZNFD蛋白,制备的多克隆抗体达到了一定的效价,且具有高特异性,为进一步研究ZNFD的功能奠定了实验基础。     

流行性乙型脑炎病毒重组E蛋白的纯化及多克隆抗体制备

目的：纯化原核表达的JEV E蛋白并制备其多克隆抗体。方法：IPTG诱导大肠杆菌表达JEV E蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化。将纯化后的JEV E蛋白免疫新西兰兔,制备多克隆抗血清。琼脂糖双向扩散实验及间接ELISA检测抗体效价。结果：获得浓度1.85mg/ml、纯度92%的JEV E蛋白,并制备了JEV E蛋白兔多克隆抗体血清。琼脂糖双向扩散实验显示多克隆抗体血清1∶16稀释时仍能观察到沉淀线,间接ELISA法显示1∶200稀释时具有较高效价。结论：纯化了JEV E蛋白,并制备出了多克隆抗体。     

LRP16基因的多克隆抗体制备及表达的探索

目的:制备人LRP16蛋白多克隆抗体并利用该抗体检测LRP16蛋白表达及亚细胞定位。方法:利用已构建的pRSET-C载体和LRP16基因组成的连接产物转化BL-21缺陷型大肠杆菌。诱导该基因原核表达,快速蛋白免疫法获取相应的多克隆抗体,利用免疫组化法观察LRP16基因产物在人多种组织中的表达差异。结果:成功获得高效的LRP16抗体,利用该抗体初步证实LRP16基因编码产物的在不同雌激素受体水平的组织分布特点。结论:制备的LRP16抗体及其全长基因可用于LRP16基因的生理功能及病理学研究,初步发现LRP16基因的表达与雌激素受体呈正相关。     

LRRC4多抗制备及在构建不同级别脑胶质瘤差异表达中的应用

目的:制备兔抗脑瘤候选抑瘤基因LRRC4(leucine-rich repeats containing 4)的多克隆抗体,应用该抗体检测LRRC4表达与脑胶质瘤病理分级的相关性.方法:应用DS Gene1.1软件分析LRRC4全长蛋白,避开跨膜结构域,选取亲水性及抗原性均好的蛋白序列.构建相应的融合表达载体pGEX-4 T-2/276 bp,转入E.coli JM109中IPTG诱导表达.融合蛋白经纯化后免疫新西兰兔,收集并纯化抗血清,获得兔抗人LRRC4多抗,应用该抗体通过Western印迹和免疫组织化学检测LRRC4在正常人胚胎各器官组织中的表达及其在正常脑组织与各级脑胶质瘤中的表达差异.结果:制备了效价高、特异性好的兔抗人LRRC4多抗,进一步证实了LRRC4在正常人脑组织中相对特异高表达,在脑胶质瘤中表达下调(22例/37例)或缺失(15例/37例),其表达水平与脑胶质瘤的病理分级相关.结论:兔抗人LRRC4多抗效价高、特异性好,应用该抗体检测到LRRC4的表达水平与脑胶质瘤病理分级密切相关,为LRRC4后续的研究工作奠定了基础.     

gpc3/mxr7基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的：通过原核表达并纯化GPC3蛋白，免疫家兔获得抗—GPC3多克隆抗体，为深入研究gpc3／mxr7基因的功能及其临床应用奠定基础。方法：将gpc3／mxr7基因片段亚克隆至pPROEX^TM HTb原核表达载体，采用融合6—his的融合蛋白方法原核表达GPC3蛋白质，纯化蛋白后免疫家兔，鉴定并纯化出抗—GPC3多克隆抗体。结果；原核诱导表达出GPC3蛋白，免疫家兔后获得多克隆抗体，经鉴定为抗--GPC3特异性多克隆抗体，并能识别原核、真核表达的外源性及HepG2和Hu-h7细胞内源性GPC3蛋白。结论：GPC3蛋白多克隆抗体能特异识别GPC3蛋白，可应用于gpc3／mxr7基因的功能研究，并为临床原发性肝癌的血清学早期诊断提供新的标记物。     

番茄叶绿体小分子热激蛋白多克隆抗体的制备

目的为深入研究叶绿体sHSP的功能,构建有效的原核表达体系,制备高特异性的叶绿体sHSP的多克隆抗体。方法将PCR方法得到的番茄叶绿体小分子热激蛋白基因(cpshsp)全长cDNA基因片段,克隆入融合表达载体pGEX6p-1中,在强启动子作用下在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中诱导表达,并将sHSP纯化产物免疫新西兰大白兔,western blot检测sHSP多克隆抗体。结果表达菌株经0.2 mmol/L IPTG诱导4h后,GST-CPsHSP形成包涵体,sHSP纯化产物免疫新西兰大白兔后得到叶绿体sHSP多克隆抗体,western blot检测表明该抗体的特异性和效价较好。结论构建的原核表达载体pGEX6p-1/cpshsp,在一定的诱导条件下,在DE3中得到稳定高效的融合表达,为制备叶绿体sHSP抗体提供足够的抗原,为进一步研究叶绿体sHSP的功能奠定了基础。     

兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶多克隆抗体的制备和应用

目的：采用已构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒纯化重组蛋白,制备兔抗破骨细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP-oc）多克隆抗体并鉴定其性能。方法：将构建的pET28a-ΔPTP-oc重组质粒转化至BL21（DE3）中,应用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白表达。表达产物经过Q柱阴阳离子交换和Ni柱亲和层析获得纯化的PTP-oc重组蛋白,将纯化的重组蛋白作为抗原免疫家兔,获得PTP-oc多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体的特异性。结果：成功纯化出PTP-oc重组蛋白。间接ELISA法检测,采用纯化诱导后的重组蛋白免疫家兔获得了兔抗PTP-oc多克隆抗体,多克隆抗体效价达1∶32000以上,Western blotting法检测,所得多克隆抗体有较高的特异性。结论：成功纯化了PTP-oc重组蛋白,制备出PTP-oc多克隆抗体。     

大鼠ANT1蛋白的原核表达纯化及多克隆抗体的制备

目的：表达和纯化大鼠腺苷酸转运体（ANT1）蛋白并制备其多克隆抗体.方法：通过PCR扩增大鼠脑组织中ANT1的编码区序列,构建ANT基因重组载pET28a-ANT1,转化至E. coli BL21（DE3）,IPTG诱导表达,Ni2＋-NTA离子交换树脂层析纯化;纯化的ANT1蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并亲和纯化,并通过Western Blot法鉴定其特异性.结果：成功构建重组质粒pET28a-ANT1,经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了Mr约为32×10^3的目的蛋白;亲和层析纯化后免疫的新西兰大白兔获得其多克隆抗体;曝光后胶片上均可见Mr32×10^3的阳性条带,与纯化的大鼠ANT1重组蛋白处于同一水平,表明纯化的抗ANT多克隆抗体具有高度的特异性.结论：利用基因重组技术,在大肠杆菌中成功表达了大鼠ANT1融合蛋白并制备了其多克隆抗体,为研究腺苷酸转运体蛋白在癫痫发病过程中的作用机制奠定了基础.     

大鼠神经球蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 克隆Wistar大鼠神经球蛋白(NGB)基因,通过原核表达制备其多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.方法 从雄性Wistar大鼠脑组织中提取总RNA,经逆转录PCR得到cDNA,测序证明该基因序列正确后,亚克隆人pET-28a( )载体中,通过双酶切和测序确定序列和阅读框正确.转化大肠杆菌BL21菌株,获得可溶性表达产物,经鉴定、纯化后免疫新西兰兔,分离血清,ELISA法测定抗体效价.结果 神经球蛋白多克隆抗体效价达1:100 000,此多抗可以与293细胞内表达的重组蛋白发生很好的抗原抗体反应.结论 成功制备了兔抗NGB的多抗,为后续研究提供了重要的实验材料.