人羊膜上皮细胞静脉移植治疗大鼠心肌梗死◆

背景:人羊膜上皮细胞在体外适当诱导条件下可分化为心肌样细胞,可望成为细胞心肌成形术的种子细胞,但在心肌梗死原位是否能分化成心肌细胞值得探讨.目的:探讨人羊膜上皮细胞移植在心肌梗死原位的分化及对心肌梗死后心室重构和心功能的影响.方法:用胰酶消化分离人羊膜上皮细胞,行流式细胞仪检测和免疫组化染色以鉴定其表型特征.结扎 SD 大鼠左冠状动脉前降支以建立心肌梗死模型,实验分为人羊膜上皮细胞移植组、模型组及假手术组,人羊膜上皮细胞移植组于造模后1周经舌下静脉移植Brdu标记的人羊膜上皮细胞.移植后1,4,6周采用超声心动图检查心功能变化,应用苏木精-伊红和Masson染色观察心肌重构的变化,以免疫荧光双染色法检测人羊膜上皮细胞在心肌梗死区的植活与分化.结果与结论:①所分离的人羊膜上皮细胞表达CD29、CD166、CD73和CK19,不表达CD44、CD34、CD45、CD80、CD86和HLA-DR.②人羊膜上皮细胞移植后6周,心肌梗死区仍可见Brdu标记的阳性细胞,表达心肌特异蛋白连接蛋白43、α-辅肌动蛋白和结蛋白.③移植组大鼠左心室纤维化程度明显低于模型组.④移植组大鼠射血分数、左室短轴缩短率显著高于模型组(P<0.01);舒张期左室前壁厚度和收缩期左室前壁厚度也显著大于模型组(P<0.05).提示人羊膜上皮细胞在心肌梗死原位可分化为心肌细胞,可减缓心室重构并改善心脏功能.     

人羊膜上皮细胞移植修复尺神经损伤的临床研究

目的研究人羊膜上皮细胞在修复尺神经损伤中的疗效。方法将65例尺神经（肘一腕）完全离断伤患者按随机数字表法分为2组,常规组32例,行常规神经束膜吻合术进行吻合;羊膜移植组33例,行神经柬膜吻合＋生物羊膜环绕移植术。对2组的VAS评分、肌力、尺神经感觉神经传导速度（SCV）及运动神经传导速度（MCV）的变化进行比较。结果2组患者均随访12～18个月,平均13．9个月。羊膜移植组在术后肌力、尺神经SCV和MCV恢复等方面均优于对照组（均P〈0．05）。结论人羊膜上皮细胞能促进尺神经完全离断伤后感觉、运动功能的恢复。     

羊膜上皮细胞移植治疗脑缺血缺氧新生大鼠

背景：研究表明移植羊膜上皮细胞可改善神经功能,但其作用机制尚不清楚。目的：观察缺氧缺血对新生大鼠脑神经干细胞和神经颗粒素表达的影响,及羊膜上皮细胞移植后对其治疗作用。方法：建立缺氧缺血性脑损伤模型,46只SD大鼠随机抽签法分为3组,移植组和模型组缺血缺氧后经侧脑室分别注入1×1012L-1人羊膜上皮细胞悬液和PBS治疗;假手术组注射等量的生理盐水。结果与结论：移植组大鼠神经功能较模型组明显改善,移植后第3周脑切片检出NSE阳性细胞存在,神经颗粒素在第3周的表达模型组低于假手术组,移植组较模型组增加;而nestin结果显示模型组较假手术组增加,移植组较模型组增加。提示羊膜上皮细胞移植入脑缺血缺氧大鼠脑内后,可减轻缺氧缺血后神经元的损伤,改善神经功能,其机制可能是注射入侧脑室的细胞促进自体神经干细胞的增殖分化和突触再生而实现的。     

羊膜上皮细胞移植治疗脑缺血缺氧新生大鼠

背景:研究表明移植羊膜上皮细胞可改善神经功能,但其作用机制尚不清楚。目的:观察缺氧缺血对新生大鼠脑神经干细胞和神经颗粒素表达的影响,及羊膜上皮细胞移植后对其治疗作用。方法:建立缺氧缺血性脑损伤模型,46只SD大鼠随机抽签法分为3组,移植组和模型组缺血缺氧后经侧脑室分别注入1×1012L-1人羊膜上皮细胞悬液和PBS治疗;假手术组注射等量的生理盐水。结果与结论:移植组大鼠神经功能较模型组明显改善,移植后第3周脑切片检出NSE阳性细胞存在,神经颗粒素在第3周的表达模型组低于假手术组,移植组较模型组增加;而nestin结果显示模型组较假手术组增加,移植组较模型组增加。提示羊膜上皮细胞移植入脑缺血缺氧大鼠脑内后,可减轻缺氧缺血后神经元的损伤,改善神经功能,其机制可能是注射入侧脑室的细胞促进自体神经干细胞的增殖分化和突触再生而实现的。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.目的:研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性.方法:取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达.结果与结论:人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性.结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞.     

人羊膜上皮细胞移植修复免臂丛神经损伤

背景：目前人们把目光多集中在干细胞修复脊髓损伤方面,而对于干细胞移植治疗周围神经损伤的研究却不多,尤其人羊膜上皮细胞修复治疗周围神经损伤的研究和报道更少。目的：探讨人羊膜上皮细胞对臂丛神经的修复作用。方法：应用测力神经根拉钩水平牵拉臂丛神经根的方法制备大白兔臂丛损伤模型,提取人羊膜上皮细胞并扩增培养,扫描电子显微镜下观察人羊膜组织及羊膜上皮细胞的超微结构,人羊膜上皮细胞转染绿色荧光蛋白标记并注射入臂丛神经损伤区,苏木精-伊红染色及荧光显微镜观察羊膜上皮细胞对兔臂丛神经损伤的修复作用。 结果与结论：①分离得到的人羊膜上皮细胞表达上皮细胞标志物角蛋白CK19,不表达间充质细胞标志物波形蛋白,不同程度表达CD29,CD73。扫描电子显微镜观察到人羊膜上皮细胞胞体饱满,连接紧密,细胞状态良好。②人羊膜上皮细胞移植到新西兰大白兔臂丛神经损伤模型后18周,免疫荧光检测到神经损伤区可见有表达绿色荧光蛋白的羊膜上皮细胞。③术后6周实验组大白兔前爪功能开始恢复,术后12,18周实验组大白兔前爪功能得到明显改善,功能评分明显提高,对照组几乎没有恢复。以上结果可见人羊膜上皮细胞参与了臂丛神经损伤的修复。     

体外诱导人羊膜上皮细胞分化为神经样细胞

目的探讨人羊膜上皮细胞体外向神经样细胞诱导分化的条件。方法碱性成纤维细胞生长因子预诱导剂（bFGF）,化学诱导剂全反式维甲酸（ATRA）、丁酸羟基茴香醚（BHA）作为诱导剂,并以不含诱导剂的无血清的MEM培养基作为对照,密切观察分化过程中细胞形态的变化,诱导至6 h、12 h、24 h时,利用免疫细胞化学方法检测神经元特异性标志物的表达情况。结果诱导分化12 h后的ATRA组大部分细胞呈现双极、多极和锥形的典型神经元细胞的形态,免疫细胞化学显示这些细胞表现为NSE染色阳性,而丁酸羟基茴香醚（BHA）组细胞形态没明显变化,两组都不表达神经胶质细胞标记物GFAP。结论 hAECs可以在体外诱导分化为神经元样细胞,全反式维甲（ATRA）诱导效果较丁酸羟基茴香醚（BHA）好。     

人羊膜上皮细胞分化为成骨细胞的特性

背景:研究发现人羊膜上皮细胞系WISH和FC植入裸鼠体内均可分化成软骨和成骨,作者检索关于足月分娩人胎膜的羊膜上皮细胞是否具有成骨特性国内外报道少见.目的:以足月分娩胎膜的人羊膜上皮细胞为前体细胞,观察其在体外定向诱导条件下分化为成骨细胞的能力.设计、时间及地点:细胞分子水平检测,于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.材料:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准.方法:采用机械法剥离胎盘羊膜组织,用胰蛋白酶消化法分离人羊膜上皮细胞,按3×108 L-1密度接种进行原代培养.取第1代人羊膜上皮细胞,设立两组:诱导组以1×108 L-1密度接种于培养皿内,24 h后更换为含体积分数为0.1的胎牛血清、 100 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、5 mmol/Lβ-甘油磷酸的诱导培养液.对照组换液成分为仅含体积分数为0.1的胎牛血清的LG-DMEM培养液.主要观察指标:原代细胞用流式细胞仪分析其表型,免疫细胞化学法检测细胞角蛋白19的表达.诱导后采用钙-钴法检测成骨细胞特异性碱性磷酸酶的表达,茜素红S检测钙盐沉积情况.结果:人羊膜上皮细胞表达间充质干细胞表面标志CD29、CD44和上皮细胞标志细胞角蛋白19.向成骨细胞诱导分化21 d后,人羊膜上皮细胞由圆形变成梭形、三角形,细胞胞浆内碱性磷酸酶呈阳性表达,且可见钙盐沉积.结论:源自足月分娩胎盘的人羊膜上皮细胞具有分化为成骨细胞的特性.     

人羊膜上皮细胞移植急性肝损伤小鼠的定量效果分析

背景：目前已有较多关于人羊膜上皮细胞移植入动物体内的存活、迁徙及相关特性的初步研究,但其对移植效果的定量分析尚未见报道。目的：对脾内移植传代的人羊膜上皮细胞小鼠血清肝生化功能及人血白蛋白的定量分析。方法：40只裸小鼠随机分为4组,每组各10只。肝叶切除＋细胞移植2周组、肝叶切除＋细胞移植4周组、肝叶切除＋盐水组,行半肝叶切除,肝叶切除＋细胞移植组自脾下极移植密度为5×106传代的人羊膜上皮细胞约0.2mL,分别于移植后2周和4周采血;肝叶切除＋盐水组自脾下极注射生理盐水0.2mL;单纯细胞移植组：不行肝叶切除,自脾下极移植密度为5×106传代的人羊膜上皮细胞约0.2mL。检测其各组肝脾组织学、形态学的改变及各组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、人血白蛋白的变化和人血白蛋白表达定量分析。结果与结论：人羊膜上皮细胞移植急性肝损伤小鼠4周后肝脾形态未见明显改变,组织学可检测到特异性细胞,血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、人血白蛋白有明显改善,血清中能检测到人血白蛋白且移植后4周较移植后2周有明显升高。因此,人羊膜上皮细胞移植入肝受损小鼠体内能存活超过4周且仍表达肝细胞样细胞的部分特性及功能,改善小鼠的肝功能,治疗小鼠急性肝损伤。     

人羊膜上皮细胞的干细胞特性

背景：研究发现人羊膜上皮细胞具有类似胚胎干细胞或多能干细胞的多向分化潜能,说明其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。目的：研究体外培养的人羊膜上皮细胞的干细胞特性。方法：取足月剖宫产的人羊膜组织,经酶消化法和差异黏附法获得纯度高的人羊膜上皮细胞,接种于含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中进行原代和传代培养,用免疫荧光法和流式细胞仪检测法检测人羊膜上皮细胞表面胚胎干细胞的表面标记蛋白OCT-4和干细胞表面分子标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105的表达。结果与结论：人羊膜上皮细胞在体外培养条件下呈上皮细胞特有的铺路石样外观,其胞浆中有OCT-4免疫荧光表达,其干细胞标记分子CD29、CD34的表达是阳性,但干细胞标记分子CD44、CD45、CD105的表达为阴性。结果表明人羊膜上皮细胞具有干细胞的某些特性,其可能是未来组织工程重建的一种新型种子细胞。     

人羊膜上皮细胞的研究进展

人羊膜上皮细胞源于胎盘羊膜组织,表达干细胞标志分子及相关基因,但不表达端粒酶基因,具有非致瘤性,同种异体移植后不发生免疫排斥反应,同时还可分泌免疫抑制因子,防止移植后炎性反应的发生,因此可以看作是免疫赦免细胞.人羊膜上皮细胞具有明显的可塑性和多向分化潜能,在不同生长因子的调节下,可分化为肝样细胞、心肌样细胞、神经胶质细胞、神经元细胞和胰岛样细胞等,在细胞替代治疗及组织再生医学上有广阔的应用前景.尽管如此,仍还不能将人羊膜上皮细胞称之为严格定义上的干细胞,凼其小具有长期的自我更新和产生单个细胞克隆的能力,此外人羊膜细胞在体内分化成有功能的各种细胞类型需要进一步研究证实.     

脂肪基质干细胞移植治疗大鼠急性心肌梗死

目的探讨大鼠脂肪基质干细胞(ASCs)移植于梗死心肌后的增殖分化情况及对心功能的影响。方法培养大鼠ASCs,流式细胞术鉴定其表型。将SD大鼠左前降支结扎制造急性心肌梗死模型后,在梗死心肌处植入DAPI标记ASCs(实验组)或DMEM培养液(对照组)。移植后1及4周,超声检查心功能。并取梗死区心肌组织进行移植细胞形态学检查及毛细血管密度测定。RTPCR、ELISA法测梗死区VEGF的mRNA及蛋白表达情况。结果培养获得ASCs,表型为CD44 、CD105 ,CD31-、CD45-。植入梗死区的ASCs可以分化为血管内皮细胞,实验组梗死心肌处血管密度较对照组明显增高(P<0.01),且VEGF基因及蛋白水平在移植后1周均较对照组明显增高(P<0.01)。移植后4周,实验组大鼠左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(FS)较对照组明显提高(P<0.01)。结论ASCs移植可以促进大鼠梗死后心肌血管新生,改善心功能。     

人羊膜上皮细胞有向心肌样细胞分化的特性

目的:通过体外诱导分化实验,评价人羊膜上皮细胞向心肌样细胞分化的能力.方法:实验于2005-09/2006-12在贵州省细胞工程重点实验室完成.①对象:经产妇知情同意,无菌采集健康足月剖宫产胎盘6份,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离,D-Hank's液冲洗后剪成碎片,加入含有0.2 g/L乙二胺四乙酸的0.5 g/L胰蛋白酶溶液,离心、消化、过滤,收集滤液,加入胎牛血清终止消化,重复消化2次.合并3次消化所得的细胞悬液,离心后将细胞沉淀悬浮于L-DMEM培养基中,按1.25×108 L-1密度接种,常规培养3 d后更换培养基,待细胞达80%~90%融合后用胰蛋白酶 乙二胺四乙酸联合消化,终止后离心弃上清,细胞沉淀用培养基重新悬浮,按1×107 L-1密度传代.③实验评估:用流式细胞仪鉴定人羊膜上皮细胞表型;使用10 μmol/L 5-氮杂胞苷和1 mmol/L抗坏血酸磷酸盐诱导第2代人羊膜上皮细胞,免疫荧光染色法检测诱导后细胞中特异蛋白结蛋白和α-辅肌动蛋白的表达,RT-PCR检测心肌特异性转录因子Nkx2.5、GATA-4和心肌特异性收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA的表达.结果:①人羊膜上皮细胞的免疫组化特征:人羊膜上皮细胞几乎不表达CD44,不表达波形蛋白,表达角蛋白19.②人羊膜上皮细胞α-辅肌动蛋白和结蛋白的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达肌系细胞标志α-辅肌动蛋白和结蛋白.③人羊膜上皮细胞Nkx2.5、GATA-4和α-肌球蛋白重链mRNA的表达:人羊膜上皮细胞经诱导分化后,表达心肌特异性转录因子Nkx2.5 mRNA和GATA-4 mRNA，心肌特异的可收缩蛋白α-肌球蛋白重链mRNA未见表达.结论:通过胰蛋白酶消化法分离获得的人羊膜上皮细胞具有向心肌样细胞分化的特性,可能成为细胞心肌成形术的候选供体细胞.     

人参与大鼠羊膜上皮细胞移植对脊髓损伤大鼠功能恢复的影响

目的 探讨人参与羊膜上皮细胞(AECs)移植联合治疗对脊髓损伤大鼠功能恢复的影响.方法 将40只成年雄性Wistar大鼠按随机数字表法分成4组,每组10只.脊髓损伤组:进行脊髓损伤手术,不进行治疗;甲泼尼龙组:脊髓损伤后用大量甲泼尼龙冲击治疗,共3 d;人参+AECs组:脊髓损伤后服用人参超微粉碎颗粒,共20 d,并于伤后7d在脊髓损伤处移植大鼠AECs;假手术组:只打开椎板,暴露脊髓,不造成脊髓损伤.各组定期进行行为学观察(BBB评分),术后30 d行组织学观察和神经电生理[感觉诱发电位(SEP)、运动诱发电位(MEP)]检测.结果 BBB评分(分)在人参+AECs组恢复最为明显,30 d达峰值,与脊髓损伤组和甲泼尼龙组比较差异有统计学意义(8.46±0.38比5.56± 1.03、7.01±0.62,均P＜0.05).组织学观察显示:脊髓损伤组灰、白质组织结构不完整,损伤区可见大片出血和坏死灶;甲泼尼龙组和人参+AECs组治疗后均有恢复,人参+AECs组恢复程度明显优于甲泼尼龙组.与脊髓损伤组和甲泼尼龙组比较,人参+AECs组SEP与MEP的峰-峰值(mV)显著增加(SEP:0.08±0.01比0.03±0.01、0.05±0.01; MEP:42.12±0.47比5.92±1.03、15.38±2.94),潜伏期(ms)明显缩短(SEP:3.71±0.37比5.22±0.26、4.64±0.32; MEP:3.73±0.11比4.72±0.35、4.24±0.31),差异有统计学意义(均P＜0.05).结论 人参与AECs移植联合治疗能有效促进脊髓损伤大鼠功能的恢复.     

间充质干细胞移植联合阿托伐他汀治疗大鼠急性心肌梗死

目的:观察间充质干细胞与阿托伐他汀联合应用对大鼠急性心肌梗死心功能的疗效,并与单纯间充质干细胞移植作比较。方法:实验于2005-02/2005-10在郑州大学基础医学院完成。①剥离6周龄、体质量60～80g SD大鼠股骨和胫骨获取间充质干细胞,置于培养瓶中培养。在培养瓶中加入5-溴脱氧尿嘧啶,调整浓度至10μmol/L,孵育72h,调整细胞密度为4×1010L-1,移植备用。②选取体质量280～300g成年SD大鼠建立急性心肌梗死模型。结扎大鼠左冠状动脉前降支,观察前壁心肌颜色变苍白,收缩力减弱,心电图相应导联ST段弓背向上抬高,确认心肌梗死模型建立成功。将建模成功40只大鼠分成4组。对照组:梗死部位分4点注射L-DMEM培养液;阿托伐他汀组:梗死部位分4点注射L-DMEM培养液,阿托伐他汀10mg/(kg.d)溶入生理盐水2mL,灌喂2周。间充质干细胞组:梗死部位分4点移植间充质干细胞,每点2×106个/50μL。联合组:梗死部位分4点移植间充质干细胞,每点2×106个/50μL,阿托伐他汀10mg/(kg.d),灌喂2周。③术后4周,应用超声检测大鼠左室射血分数和短轴缩短率,生理记录仪测定大鼠左室收缩压、舒张末压、压力变化最大上升与最大下降速率,采用免疫组织化学方法检测细胞组织学变化。结果:建模成功的40只大鼠全部进入结果分析。①大鼠心功能超声检查:间充质干细胞移植组与联合组左室射血分数、短轴缩短率均明显高于对照组和阿托伐他汀组,联合组升高更明显[左室射血分数:(20.87±2.25)%,(30.12±2.17)%,(43.40±3.57)%,(52.78±3.18)%;短轴缩短率:(17.74±1.77)%,(22.46±2.29)%,(29.89±2.50)%,(37.31±3.78)%,P均<0.05]。②大鼠血流动力学检测:与对照组、阿托伐他汀组相比,间充质干细胞移植组与联合组左室收缩压、压力变化最大上升与最大下降速率均明显升高,舒张末压明显降低,联合组改善程度更明显[左室收缩压:(89.43±2.06),(97.58±3.13),(121.11±2.65),(129.84±3.46)mm Hg;舒张末压:(20.48±1.71),(17.37±1.17),(13.99±1.38),(9.89±1.74)mm Hg;压力变化最大上升速率:(3599±301),(4043±216),(5022±218),(5515±408)mm Hg/s;压力变化最大下降速率:(3188±345),(3226±387),(4013±537),(4657±401)mm Hg/s,P均<0.05]。③大鼠心脏组织学检测:对照组、阿托伐他汀组大鼠梗死区心肌纤维化明显,细胞排列紊乱,无新生心肌细胞。间充质干细胞移植组、联合组大鼠梗死心肌内可见5-溴脱氧尿嘧啶标记阳性细胞,对心肌肌钙蛋白T呈现阳性表达。结论:间充质干细胞联合阿托伐他汀应用治疗大鼠急性心肌梗死有协同提高疗效作用,其效果优于单纯间充质干细胞移植。