整合素连接激酶高表达对新生大鼠心肌细胞增殖的影响

背景:整合素连接激酶在调节细胞生存、抗凋亡以及促进细胞迁移、增殖、分化等方面发挥重要作用。目的:观察整合素连接激酶在新生大鼠心肌细胞内高表达后对心肌细胞增殖能力的影响。方法:取新生3d内SD大鼠心脏,体外分离、培养心肌细胞72h后,分别转染重组腺病毒载体或重组腺病毒载体+整合素连接激酶基因。结果与结论:转染48h,与转染重组腺病毒载体比较,转染重组腺病毒载体+整合素连接激酶基因的新生大鼠心肌细胞内DNA合成增加(P<0.05),有丝分裂增多(P<0.05),心肌细胞数量增多(P<0.05)。在整合素连接激酶的作用下,新生大鼠心肌细胞的增殖能力明显提高。     

血管内皮生长因子对心肌细胞移植治疗心肌梗死有改善血供作用

目的：探讨腺病毒介导血管内皮生长因子165基因（AdVEGF165）转染的乳鼠心肌细胞移植对慢性心梗（MI）大鼠一心功能的影响。方法：体外培养新生大鼠心室肌细胞、标记BrdU、转染AdVEGF165基因；收集培养液上清，ELISA法检测转染细胞VEGF的表达。结扎同种大鼠前降支建立心梗模型，4周后将心梗大鼠随机分为3组。分别注射移植转染心肌细胞（组Ⅰ）、单纯心肌细胞（组Ⅱ）、和DMEM培养基（组Ⅲ）。超声心动图检测移植前厦移植4周后的心功能。处死大鼠，留取心脏标本作HE病理染色厦免疫组化检测，并计数血管密度。结果：AdVEGF165基因转染的心肌细胞表达VEGF升高，较对照组有显著差异（P〈0．01）；超声检测心功提示转染细胞组（组Ⅰ）心功能较其他2组显著改善（P〈0．01）；免疫组化检测显示，移植细胞在移植区存活；HE染色血管计数显示转染组（组Ⅰ）有更多的新生血管形成（P〈0．01）。结论：AdVEGF165基因转染心肌细胞后表达分泌VEGF增加，可促进梗死区新生血管形成，改善心肌血供，有利于移植细胞的存活，能更好的改善心功能。     

腺病毒介导的β2-AR过表达对心力衰竭大鼠心肌细胞IL-18分泌的影响

目的研究β2-AR过表达对心力衰竭大鼠心肌细胞IL-18分泌的影响。方法采用腹主动脉缩窄法建立慢性心力衰竭大鼠模型,胶原酶消化法分离大鼠心肌细胞,用携带β2-AR基因的重组腺病毒转染大鼠心肌细胞,培养48h后,Westem blot法检测心肌细胞β2-AR蛋白的表达及ELISA法测定IL-18的含量。经筛选后心力衰竭大鼠随机分为心力衰竭对照组（HF组）、转染EGFP组（HF＋EGFP组）、转染β2-AR-EGFP组（HF＋β2组）;假手术组也相应随机分为对照组（sham组）、转染EGFP组（sham＋EGFP组）、转染β2-AR-EGFP组（sham＋β2组）。结果与假手术组相比,心力衰竭组左心室舒张末期内径（LVEDD）、左心室收缩末期内径（LVESD）均升高（P〈0．05）,左心室短轴缩短率（FS）及射血分数（EF）均降低（P〈0．05）。Western blot结果显示HF＋β2组心肌细胞β2-AR蛋白表达量高于HF＋EGFP组及船组（P〈0．05）。与sham组相比,HF组IL-18含量显著升高（P〈0.05）;HF＋β2组IL-18含量明显低于琊＋EGFP组及HF组（P均〈0．05）。结论心力衰竭大鼠心肌细胞分泌炎症因子IL-18增加,β2-AR过表达后能抑制心肌细胞IL-18的分泌。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达

背景：过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义。目的：构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率。方法：采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV。线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒。用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度。用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体αmRNA、蛋白表达。结果与结论：成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011pfu/L。重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高。该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础。     

超声对腺病毒载体在大鼠心肌内转染的影响

目的观察超声对腺病毒载体在大鼠心肌内转染的影响。方法取成年雄性SD大鼠40只,随机分为5组：心肌转染3d组、5d组、7d组、20d组和30d组,腺病毒载体转染后分别在不同时间点观察心肌转染面积。另取成年雄性SD大鼠40只,随机分为超声干预组和对照组,转染5d后取材,冰冻病理切片下测定心肌组织转染面积百分比,分离心肌细胞,测定细胞转染率。结果在心肌转染术后第5天,心肌组织转染面积最大,以后呈现逐渐下降趋势。超声干预组心肌组织转染面积百分比显著高于对照组[（9．58±2．95）％傩．（5．13±0．90）％,P〈0．05],超声干预组分离心肌细胞转染率也显著高于对照组[（9．00±2．96）％粥．（5．20±1．95）％,P〈0．05]。结论超声波可以提高腺病毒载体在大鼠心肌内的转染效率。     

骨髓间充质干细胞中突变型人低氧诱导因子1α真核表达载体的表达

背景：转基因小鼠体内实验证实,重组的低氧诱导因子1α可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。目的：构建能够在常氧条件下同时表达突变型低氧诱导因子1α目的蛋白和绿色荧光蛋白报告分子的新型腺病毒真核表达载体,并转染SD大鼠骨髓间充质干细胞,检测该基因在细胞中的表达情况。方法：利用Lipofectamine2000介导将构建成功的重组腺病毒真核表达载体pAd-HIF1αmu-IRES-hrGFP-1转染HEK293A细胞,包装病毒,以最佳感染指数=50将重组腺病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞,并设3个对照组,即阳性对照组：转染Ad-CMV-HIF1α-IRES-hrGFP-1;阴性对照组：转染Ad-CMV-IRES-hrGFP-1组;空白组：未转染病毒。结果与结论：①腺病毒载体成功转染HEK293A细胞,包装成功,细胞内有大量绿色荧光表达。②转染突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体的细胞在常氧条件下蛋白表达量明显高于转其他3组,3个对照组间差异无显著性意义（P〉0.05）。提示突变型腺病毒真核表达载体Ad-HIF1α-IRES-hrGFP-1在HEK293A内成功包装;突变后低氧诱导因子1α基因能够在常氧条件下大量且高效表达。     

腺病毒介导细胞外信号调节激酶2表达对去分化软骨细胞增殖及胞外基质合成的影响

目的：观察腺病毒介导细胞外信号调节激酶2的过度表达对去分化软骨细胞增殖和细胞外基质合成的影响，以及腺病毒介导细胞外信号调节激酶2用于修饰去分化软骨细胞的可行性。 方法：实验于2004-09／2005-05在暨南大学组织移植与免疫研究中心进行。SD大鼠5只，周龄为3-5周，此处请核对体质量为（150&;#177;20）g，分离、培养大鼠肋生长板软骨细胞，利用Adeasy系统构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体。流式细胞仪检测不同感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率，Western blot检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1／2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达，^3H-TdR,^3H-proline和^35 S-sulfate同位素掺入检测携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染对大鼠肋生长板软骨细胞增殖、胶原和蛋白多糖合成的影响。 结果：①成功构建携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体重组腺病毒。②100感染复数的携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染第5代大鼠肋生长板软骨细胞的效率大于90％。③携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体感染的第5代大鼠肋生长板软骨细胞中细胞外信号调节激酶1／2和磷酸化细胞外信号调节激酶2的表达均显著增加，分别是Ad-CMV组的15．58和1．85倍。④同位素检测结果表明携带细胞外信号调节激酶2基因的腺病毒载体的感染促进^3H-TdR、^3H-proline和^35S-sulfate的掺入，分别是对照组的2．52，1.61和1．53倍（P〈0．05）。 结论：腺病毒介导细胞外信号调节激酶2基因的过度表达促进去分化大鼠肋生长板软骨细胞的增殖和细胞外基质成分的合成。     

大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体及在乳鼠心肌细胞中的表达☆

背景:过氧化物酶体增生因子活化受体α是调节心脏脂肪酸氧化的重要核转录因子,利用基因工程技术构建其重组腺病毒载体对研究心脏能量代谢障碍机制具有重要意义. 目的:构建大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因重组腺病毒载体,评价其在原代培养的乳鼠心肌细胞中的表达效率. 方法:采用RT-PCR法自SD大鼠肝脏扩增过氧化物酶体增生因子活化受体α基因,将其克隆至带有增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒载体pAd-Track-CMV.线性化重组穿梭质粒载体并转化入含有腺病毒骨架质粒pAd-Easy-1的感受态大肠杆菌BJ5183构建重组腺病毒载体质粒.用脂质体将线性化的重组腺病毒载体质粒转染于人胚肾293细胞以包装、扩增,纯化病毒后计算滴度.用纯化的重组腺病毒转染心肌细胞,荧光显微镜观察转染效率;荧光定量PCR、免疫印迹法检测细胞过氧化物酶体增生因子活化受体α mRNA、蛋白表达. 结果与结论:成功构建携带大鼠过氧化物酶体增生因子活化受体α基因的重组腺病毒载体,病毒滴度为3.5×1011 pfu/L.重组腺病毒转染心肌细胞的效率达90%以上,被转染细胞目的基因mRNA、蛋白表达显著增高.该载体的成功构建为研究过氧化物酶体增生因子活化受体α基因在心肌能量代谢障碍中的作用奠定基础.     

外源性热休克蛋白70基因对心肌细胞损伤的保护作用

目的：探讨热休克蛋白70（HSP70）基因转染对心肌细胞急性实验性缺氧／复氧损伤的保护作用及其机制。方法：进行大鼠乳鼠原代心肌细胞培养,随机分为4组,对照组、缺氧／复氧（A／R）组、热休克处理后缺氧／复氧（A／R＋HS）组和pCDNAHSP70质粒转导后缺氧／复氧（A／R＋pCDNA HSP70）组。用脂质体包裹pCDNAHSP70质粒,并转导入心肌细胞内。反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测HSP70mRNA表达,Westernblot检测HSP70蛋白表达。以心肌细胞存活率（MTT法）、培养液中乳酸脱氢酶（I．DH）活性、心肌细胞超微结构改变（透射电镜）及Ca^2＋负荷来检测心肌细胞损伤程度。结果：与A／R组相比,A／R＋HS组和A／R’pCDNAHSP7。组细胞存活率显著提高;LDH活性明显降低;细胞超微结构明显改善;心肌细胞Ca^2＋负荷明显减轻。A／R组HSP70mRNA和蛋白含量均较A／R＋HS组和A／R＋pCDNAHSP70组显著减低（P〈0．01）,而A／R＋pCDNA HSP70组的含量与A／R＋HS组相比显著增多（P〈0．01）。结论：通过基因转染使HSP70基因高表达能对抗缺氧／复氧对心肌细胞的损伤,这一作用与其能抗细胞Ca^2＋负荷有关。     

组织工程化成年心肌细胞的构建

背景：采用成年心肌细胞构建组织工程细胞已成为心脏疾病领域新的科研热点。 目的：探讨简单、快捷的成年大鼠心肌细胞分离方法,并初步探索组织工程化成年心肌细胞的构建方式。 方法：采用分段式酶消化方法消化成年大鼠心室肌心肌细胞。分别转染腺病毒和脂质体介导的红色荧光蛋白基因,倒置荧光显微镜、流式细胞仪检测组织工程细胞的构建效率。转染腺病毒介导的缺氧诱导因子1a,采用Western blot检测目标蛋白的表达。 结果与结论：采用分段式酶消化方法可获得大量心肌细胞。流式细胞分析表明所获得的成年心肌细胞的存活率为（87.03±0.70）%。与脂质体转染相比（转染效率为0）,腺病毒感染效率高,为（70.31±1.39）%,荧光显微镜下细胞发出红色荧光。在腺病毒转染第4天后,可有效表达目标蛋白缺氧诱导因子1a。以上结果表明分段式酶消化法是成熟心肌细胞的快速分离方式,并明确重组腺病毒载体是转染心肌细胞的最佳基因载体。     

法舒地尔和RhoA沉默对神经干细胞增殖的影响

背景：Rho及其相关分子在神经轴突生长、分化、延伸及突触形成中起重要作用,阻断和抑制RhoA/ROCK通路可促进神经干细胞的增殖与生长。目的：观察Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默对大鼠神经干细胞增殖的影响。方法：体外培养Wistar胎鼠神经干细胞,分6组干预：空白对照组,5,10,15,20μmol/L法舒地尔组,siRNA沉默RhoA基因组。干预后第3天,采用RT-PCR,Westernblot检测各组神经干细胞RhoA基因及蛋白的表达。应用MTT比色法观察神经干细胞增殖情况;采用流式细胞术测定神经干细胞周期分布的变化。结果与结论：15,20μmol/L法舒地尔组、siRNA沉默RhoA基因组神经干细胞RhoA基因及蛋白表达量较5,10μmol/L法舒地尔组、空白对照组明显降低（P〈0.05）,细胞的生长速度较5,10μmol/L法舒地尔组、空白对照组明显增快（P〈0.05）,细胞周期G0/G1期减少（P〈0.05）,S期细胞数增多（P〈0.05）。当法舒地尔浓度增加到20μmol/L时对细胞的作用并非随浓度的增加而增强,与15μmol/L组的差异无显著性意义（P〉0.05）。15,20μmol/L法舒地尔组与siRNA沉默RhoA基因组相比差异无显著性意义（P〉0.05）。说明Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默在体外均能促进神经干细胞增殖,法舒地尔最佳作用浓度为15μmol/L。     

低氧增强骨髓间充质干细胞对缺氧诱导心肌细胞凋亡的可能性

背景：骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后存活率低,而低氧有可能增强骨髓间充质干细胞的增殖,促进其存活。目的：体外模拟心肌细胞缺血微环境,探索低氧预处理后,骨髓间充质干细胞对持续缺氧诱导的心肌细胞凋亡的保护作用。方法：取第4代SD大鼠骨髓间充质干细胞用于制备条件培养液。取胚胎大鼠心肌细胞株,随机分成4组：对照组：心肌细胞正常培养组;模型组：心肌细胞单纯缺氧;骨髓间充质干细胞组：心肌细胞与骨髓间充质干细胞条件培养液共缺氧;低氧组：心肌细胞与骨髓间充质干细胞低氧条件培养液共缺氧。MTT检测各组细胞活力变化,AnnexinV-FITC双染标记心肌细胞凋亡,免疫组化检测各组Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果与结论：免疫组化显示,低氧组的Bcl-2表达较其他各组增强,而Bax的表达比模型组和骨髓间充质干细胞组减弱,Bcl-2/Bax比值最大。与对照组和骨髓间充质干细胞组相比,低氧组的细胞活力高（P〈0.05）,凋亡率降低（P〈0.05）。提示低氧可能是通过增强旁分泌机制,从而对Bax和Bcl-2进行调节,对心肌细胞凋亡有保护效应。     

Kruppel样因子6基因对巨噬细胞中胆固醇蓄积的影响

背景：研究表明,Kruppel样因子6与巨噬细胞极化密切相关。但是,关于Kruppel样因子6在巨噬泡沫细胞形成中的作用尚不清楚。目的：观察Kruppel样因子6过表达对氧化低密度脂蛋白刺激下的小鼠巨噬细胞（RAW264.7）胆固醇蓄积及对ATP结合盒转运蛋白A1表达的影响。方法：取Raw264.7巨噬细胞株分别转染慢病毒空载体和重组载体p CDH-KLF6,作为对照组和Kruppel样因子6组,另取稳定感染慢病毒空载体的Raw264.7巨噬细胞株和稳定感染重组载体p CDH-KLF6的Raw264.7巨噬细胞株均加入50 mg/L氧化低密度脂蛋白共孵育48 h后,得到氧化低密度脂蛋白组和Kruppel样因子6＋氧化低密度脂蛋白组。结果与结论：与对照组相比,氧化低密度脂蛋白组巨噬细胞内总胆固醇和胆固醇酯表达水平显著增加（P〈0.05）。与氧化低密度脂蛋白组巨噬细胞相比,Kruppel样因子6＋氧化低密度脂蛋白组细胞内总胆固醇和胆固醇酯表达水平明显下降,胆固醇酯/总胆固醇明显降低（P〈0.05）。而未加入氧化低密度脂蛋白处理的2组细胞内脂质表达水平少,且对照组与Kruppel样因子6组相比,细胞内脂质表达水平差异无显著性意义。提示Kruppel样因子6可能通过促进ATP结合盒转运蛋白A1的表达,抑制氧化低密度脂蛋白诱导的RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积。     

腺病毒介导hRAMP1基因转染血管平滑肌细胞的增殖和凋亡

背景：外源性受体活性修饰蛋白1基因转染可能对血管平滑肌细胞增殖调控具有重要的作用。目的：探讨腺病毒载体介导人受体活性修饰蛋白1基因对体外培养的兔血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法：分离培养获得兔主动脉血管平滑肌细胞,分别以携带人受体活性修饰蛋白1基因的腺病毒和空腺病毒转染后,分成人受体活性修饰蛋白1组、空病毒组和对照组。结果与结论：腺病毒转染细胞后随时间延长,报告基因绿色荧光蛋白表达逐渐增加,72h表达最强,感染率达80%,96h时仍有绿色荧光蛋白表达。人受体活性修饰蛋白1组的受体活性修饰蛋白1蛋白表达增加,血管平滑肌细胞凋亡率增加,细胞增殖明显抑制,与空病毒组和对照组比较差异有显著性意义（P〈0.05）。提示人受体活性修饰蛋白1基因感染血管平滑肌细胞后明显抑制血管平滑肌细胞增殖,促进细胞凋亡。     

外源性子宫珠蛋白基因对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响

目的探讨人子宫珠蛋白（UG）基因对宫颈癌Hela细胞系细胞增殖及凋亡的影响。方法构建真核细胞表达载体pcDNA3．1-UG（＋），以脂质体介导法稳定转染体外培养的人宫颈癌Hela细胞，同时转染空载体pcDNA3．1质粒，以未转染细胞为对照，转染成功后分别命名为pcDNA3．1-UG（＋）／Hela组、pcDNA3．1／Hela组、Hela组。应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、Western blot方法分析目的基因表达，并采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞凋亡。结果pcDNA3，1-UG（＋）／Hela组UGmRNA及UG蛋白出现明显的高表达，与对照组细胞相比差异有统计学意义（P〈0．05）；pcDNA3．1UG（＋）／Hela组细胞生长速度明显慢于未转染Hela细胞，其细胞凋亡率与未转染Hela细胞相比差异也有统计学意义；然而pcDNA3．1／Hela组细胞生长速度和凋亡率均无明显变化。结论转染UG基因能诱导Hela细胞凋亡及抑制Hela细胞生长。     

内源性缓激肽对血管紧张素Ⅰ诱导乳鼠心肌细胞肥大的影响

目的探讨内源性缓激肽对血管紧张素Ⅰ(AngⅠ)诱导乳鼠心肌细胞肥大的作用。方法体外原代培养新生Wistar大鼠的心肌细胞,随机分为对照组、AngⅠ组(10-9～10-5mol/L)、AngⅠ(10-6mol/L)+氯沙坦(losartan,Los)组、AngⅠ+卡托普利(captopril,Capt)组、AngⅠ+Capt+缓激肽B2受体拮抗剂(Hoe-140)组和AngⅠ+Capt+左旋硝基精氨酸(L-NNA)组,测量心肌细胞3H-亮氨酸掺入量、蛋白含量、细胞体积和搏动频率。结果 (1)AngⅠ可使培养的心肌细胞肥大,其作用有剂量依赖性。AngⅠ(10-6mol/L)引起心肌细胞肥大的作用与AngⅡ(10-7mol/L)相似;(2)Los可抑制AngⅠ的促肥大作用,与AngⅠ组相比,Los能使诱导3H-亮氨酸掺入量、总蛋白、细胞体积和搏动频率分别减少18.83%、18.66%、27.18%和26.37%(P<0.05);(3)Capt可抑制AngⅠ引起的心肌细胞肥大,其作用可被Hoe-140和L-NNA完全抑制。结论培养的心肌细胞可以将AngⅠ转化成AngⅡ,后者可使心肌细胞蛋白质合成增加、细胞体积增大,Capt通过减少AngⅡ生成和减少缓激肽降解抑制心肌细胞肥大。     

低强度脉冲超声波对SD大鼠前软骨干细胞增殖及细胞外基质mRNA表达的影响

背景：研究证明低强度脉冲超声波不仅可以促进骨折愈合,而且还对软骨细胞增殖和细胞外基质分泌具有一定的调节作用。目的：进一步验证低强度脉冲超声波对大鼠前软骨干细胞增殖及细胞外基质分泌的影响。方法：分离新生大鼠乳鼠的前软骨干细胞,鉴定后第3代细胞培养,分为空白对照组、5,12,20min/d组4组。以低强度脉冲超声波刺激后继续培养细胞24h。分别于刺激后第1,3,5天用CCK-8法检测细胞增殖。另以低强度脉冲超声波刺激后间隔30min提取总RNA,用RT-PCR法检测Ⅱ型胶原、Aggrecan、转化生长因子β1及Sox9基因的表达。结果与结论：低强度脉冲超声波对大鼠前软骨干细胞的增殖有促进作用,与对照组相比第1天时20min/d组增殖明显（P〈0.05）。大鼠前软骨干细胞Ⅱ型胶原、Aggrecan、转化生长因子β1及Sox9基因mRAN的表达均有明显增加,刺激天数越多mRAN的表达量越多,以20min/d组增高最为明显。提示低强度脉冲超声波可以促进SD大鼠前软骨干细胞的增殖能力,并可以促进细胞外基质mRAN的表达,这一效应可能是通过转化生长因子β1及Sox9基因所介导的。