血管内皮生长因子165真核基因转染载体转染的骨骼肌细胞☆

背景:血管内皮生长因子基因转染治疗组织损伤的研究倍受关注,构建稳定可靠的人血管内皮生长因子真核表达载体有重要意义.目的:克隆人血管内皮生长因子基因血管内皮生长因子165片段,构建 pcDNA4-HisMax-C/VEGF165真核表达质粒,并验证其转染大鼠骨骼肌细胞的可靠性.方法:采用反转录-聚合酶链反应技术,从人卵巢癌患者外周血中提取并扩增出血管内皮生长因子165基因片段,通过DNA重组技术将该基因片段重组于pcDNA4-HisMax-C真核表达载体上,构建成pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒,聚合酶链反应扩增,分别用酶切电泳分析和 DNA 测序的方法对提取和重组 DNA 进行鉴定.pcDNA4-HisMax-C/VEGF165重组质粒转染骨骼肌细胞1周后反转录-聚合酶链反应提取血管内皮生长因子基因并酶切电泳鉴定.结果与结论:构建的重组质粒目的基因片段为人血管内皮生长因子165 cDNA,对大鼠骨骼肌细胞转染后检测到血管内皮生长因子165基因片段.提示成功地克隆了血管内皮生长因子165基因并构建了其真核表达质粒,能以此为载体转染至骨骼肌细胞,并已整合到骨骼肌的基因组参与转录,证明了其转染的有效性.     

靶向人血管内皮生长因子-C基因的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建靶向人血管内皮生长因子-C(VEGF-C)基因的shRNA真核表达载体并检测其对靶基因的沉默效应.方法:根据靶基因VEGF-C序列,设计、合成编码其shRNA的互补寡核苷酸序列,克隆至线性化的pSIREN-RetroQ载体中并对重组质粒进行酶切分析及测序鉴定;脂质体介导重组质粒转染乳腺癌MCF-7细胞株,荧光定量PCR及Westen-blot检测其对靶基因VEGF-C表达的影响.结果:酶切及测序鉴定重组质粒pSIREN-VEGF-C的序列正确;转染重组质粒后乳腺癌MCF-7细胞中VEGF-C mRNA及蛋白表达均明显下调,抑制率分别为95%及100%(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人VEGF-C基因的shRNA真核表达载体,并在乳腺癌MCF-7细胞中高效、特异地发挥靶基因沉默作用.     

人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人向血病抑制因子（LIF）和血管内皮生长因子165（VEGF165）对脊髓损伤后神经元存活有重要作用.病毒载体临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法.目标：构建双基因共表达载体plRES2-LIF-VEGF165并对其进行鉴定.方法：是采用直接PCR的方法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人白血病抑制因子基因,然后将人白血病抑制因子的cDNA片段插入到plRES2-EGFP多克隆位点构建成为plRES2-LIF-EGFP.人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从plRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入plRES2-LIF-EGFP中,最后构建成为含有IRES（即内部核糖体进入位点）的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体.通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达.结果与结论：DNA测序显示,提取的人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,片段大小分别为609 bp和576 bp.构建的plRES2-LIF-VEGF165双基因共表达载体经EcoRI/BamHI切出LIF条带,经BamHI/Notl双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经EcoRI/ Notl双酶切后切出LIF-IRES-VEGF165片段.RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白.结果证实,实验成功构建了人白血病抑制因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体.     

转染血管内皮生长因子165基因的狗骨髓基质细胞超微结构变化及成骨能力

目的：探讨转染血管内皮生长因子165基因的狗骨髓基质细胞体外生物学特性。 方法：实验于2002—05／2005—06在华中科技大学同济医学院协和医院骨科完成。实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组。从3只成人杂交犬髂骨取骨髓进行骨髓基质细胞分离培养，将重组的血管内皮生长因子165基因用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞，用反转录聚合酶链反应方法检测血管内皮生长因子的表达；通过四唑盐、对硝基苯磷酸盐检测细胞增殖与碱性磷酸酶的活性；考马斯亮蓝法检测蛋白质含量；透射电镜观察细胞超微结构。 结果：（D重组质粒pcDNA3-人血管内皮生长因子165转染骨髓基质细胞后第7，14天，反转录聚合酶链反应方法检测有血管内皮生长因子mRNA表达。②骨髓基质细胞转染基因后，细胞的增殖能力无明显影响。③培养后第6，8，10，12天，转染血管内皮生长因子基因骨髓基质细胞与对照组细胞比较，碱性磷酸酶活性增高，蛋白质合成增多[转染组碱性磷酸酶为（428．09&;#177;96．67），（565．11&;#177;94．17），（562．94&;#177;39．17），（596．45&;#177;30．17）nkat，对照组碱性磷酸酶为（363.57&;#177;20.67），（536．44&;#177;11．42），（537．11&;#177;96．83），（548．10&;#177;92．34）nkat；转染组细胞蛋白合成为1．41&;#177;0．23，1．46&;#177;0．24，1．59&;#177;0．33，1．74&;#177;0．26；对照组细胞蛋白合成为0．82&;#177;0．11，0．83&;#177;0．09，0．85&;#177;0．06，0．91&;#177;0．091。④透射电镜可见转基因细胞内质网增多，线粒体致密，而糖原溶解与脂肪空泡则减少。 结论：血管内皮生长因子基因转染可促进骨髓基质细胞的成骨分化。     

人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165双基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：人胶质细胞源性神经营养因子（glialcell line-derived neurotrophic factor,GDNF）和血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）在细胞分化过程中有重要作用。目的：构建双基因共表达载体pIRES2-GDNF-VEGF165并对其进行鉴定。方法：采用PCR法从人外周血单个核细胞的基因组DNA中获取人胶质细胞源性神经营养因子基因,然后将人胶质细胞源性神经营养因子的cDNA片段插入到pIRES2-EGFP多克隆位点构建成为pIRES2-GDNF-EGFP。人血管内皮生长因子165 cDNA片段是通过双PCR的方法从pIRES2-VEGF165-EGFP质粒中获取,接着将血管内皮生长因子165 cDNA片段以替换EGFP的方式插入pIRES2-BDNF-EGFP中,最后构建成为含有内部核糖体进入位点（IRES）的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体。通过双酶切和DNA测序方法对其鉴定,将重组的双基因共表达载体感染HEK293细胞,利用RT-PCR与Western-blot方法检测双基因的表达。结果与结论：DNA测序显示,提取的人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165均与基因库报道序列一致,相对分子质量分别为636 bp和576 bp。构建的pIRES2-GDNF-VEGF165双基因共表达载体经Bgl II/Bam HI切出GDNF条带,经Bam HI/Not I双酶切后切出IRES-VEGF165片段,经Bgl II/Not I双酶切后切出GDNF-IRES-VEGF165片段。RT-PCR与Western-blot方法检测显示,此载体转染后,HEK293细胞均能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165 mRNA和蛋白。说明实验成功构建了能表达人胶质细胞源性神经营养因子和血管内皮生长因子165的双基因真核表达载体。     

血管内皮生长因子反义基因真核表达载体构建的研究

微血管的生成与肿瘤的生长、发展与转移密不可分,抑制血管生成已成为近年来抗肿瘤治疗研究的重要课题和热点问题.结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康,探索治疗结肠癌新技术、新方法具有重要的临床价值.本实验将血管内皮生长因子反义基因成功克隆构建了真核表达载体,为下一步结肠癌细胞体外培养干预实验和临床抗肿瘤应用试验做好了前期工作.     

血管内皮生长因子表达载体的构建及在内皮祖细胞中的表达

背景：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有很强的促进血管生成作用，但构建其真核表达质粒是否可转染缸管内皮祖细胞并完整表达还不清楚。目的：构建VEGF表达载体，并观察其在内皮祖细胞中的表达情况。设计、时间及地点：观察性试验，于2007-12／2008-03在上海交通大学医学院附属新华医院科研中心实验室完成。材料：质粒PDC315-VEGFl65自备，质粒pIRES2-EGFP由美国国立卫生研究院Stanko Stojilkovic教授惠赠。方法：运用DNA重组技术构建VEGF表达载体pIRES2-EGFP-VEGF，应用脂质体包裹的方法将载体转染猪外周血血管内皮祖细胞。主要观察指标：采用荧光显微镜观察VEGF在内皮祖细胞内的表达，反转录．聚合酶链反应法检测VEGFmRNA表达水平，ELISA检测VEGF165蛋白表达情况。结果：成功构建VEGF真核表达载体pIRES2-EGFP-VEGF。转染重组质粒pIRES2-EGFP-VEGF后，在内皮祖细胞内有VEGF的表达，VEGFmRNA和VEGF165蛋白表达水平均明显增加。结论：VEGF表达载体转染猪外周血血管内皮祖细胞后能有效增加VEGF基因的表达，能够获得较高水平的VEGF蛋白。     

转染血管内皮生长因子基因的人成骨细胞增殖及其生物学功能

背景:传统的自体或异体骨移植治疗骨缺损都存在难以克服的缺点,基因治疗可能是一种新途径.目的:观察转染外源性血管内皮生长因子基因的人成骨细胞体外生物学特性.设计、时间及地点:对比观察,细胞学实验,实验于2005-05/2006-05在辽宁医学院科学实验中心完成.材料:人髂骨骨块取自需髂骨植骨的颈椎病患者的植骨块修洁剩余部分的骨质,患者知情同意.质粒pCDINEGF_(121)为北京大学人类疾病治疗中心马大龙教授惠赠;感受态大肠杆菌DH5a为辽宁医学院刘丹平教授惠赠.方法:体外分离和培养人成骨细胞.实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组.利用阳离子脂质体将pCDI-VEGF_(121) 真核表达质粒导入体外培养的人成骨细胞.主要观察指标:传代后1,3,5,7 d观察血管内皮生长因子在人成骨细胞内的表达,及其对人成骨细胞增殖活力和细胞分泌骨钙素和碱性磷酸酶能力的影响.结果:pCDI-VEGF_(121)真核表达质粒转染人成骨细胞后第3,7天,以反转录聚合酶链反应方法检测到其中有血管内皮生长因子mRNA表达.转染组的细胞数在第1,3,5,7天均高于对照组(P<0.05或P<0.01).培养3 d时转染组成骨细胞的碱性磷酸酶阳性率大于对照组(P<0.01);转染组的骨钙素含量高于对照组(P<0.05或<0.01).结论:血管内皮生长因子基因转染可以促进体外培养人成骨细胞的增殖能力和相应的生物学功能.     

人表皮生长因子基因真核表达载体的构建及其基因转染

目的：构建人表皮生长因子基因真核表达载体，并将其导入细胞中表达表皮生长因子重组蛋白。 方法：经HindⅢ、BarnHI酶切PGEM-TEasy-hEGF，将人表皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体pcDNA3．1中。在脂质体的包裹下将pcDNA3．I-hEGF导入角膜组织细胞中，分别从DNA、RNA、蛋白质3个水平上检测人表皮生长因子基因表达情况。 结果：经T7／SP6和hEGF内套引物进行PCR扩增及酶切鉴定重组体，分别得到310bp和162bp两条基因片段，将162bp条带经纯化后用AVa皿限制性内切酶切鉴定，可分别得到89bp和72bp两条片段；将人表皮生长因子基因序列与Genbank上公布的序列相比，碱基同源性达98．2％，氨基酸完全相同；PCR，RT．PCR在转染后21d之内，在DNA、RNA水平上可检测到人表皮生长因子基因；免疫组织化学检恻法在转染后第3天可检测到人表皮生长因子蛋白表达，2周之后，人表皮生长因子蛋白表达结果转为阴性。 结论：pcDNA3．1-hEGF重组质粒与LipofectamineTM2000以适当比例混合形成的微囊可携带人表皮生长因子基因进入细胞内并表达功能蛋白。     

转染血管内皮生长因子165基因的狗骨髓基质细胞超微结构变化及成骨能力

目的:探讨转染血管内皮生长因子165基因的狗骨髓基质细胞体外生物学特性。方法:实验于2002-05/2005-06在华中科技大学同济医学院协和医院骨科完成。实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组。从3只成人杂交犬髂骨取骨髓进行骨髓基质细胞分离培养,将重组的血管内皮生长因子165基因用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞,用反转录聚合酶链反应方法检测血管内皮生长因子的表达;通过四唑盐、对硝基苯磷酸盐检测细胞增殖与碱性磷酸酶的活性;考马斯亮蓝法检测蛋白质含量;透射电镜观察细胞超微结构。结果:①重组质粒pcDNA3-人血管内皮生长因子165转染骨髓基质细胞后第7,14天,反转录聚合酶链反应方法检测有血管内皮生长因子mRNA表达。②骨髓基质细胞转染基因后,细胞的增殖能力无明显影响。③培养后第6,8,10,12天,转染血管内皮生长因子基因骨髓基质细胞与对照组细胞比较,碱性磷酸酶活性增高,蛋白质合成增多[转染组碱性磷酸酶为(428.09±26.67),(565.11±24.17),(562.94±39.17),(596.45±30.17)nkat,对照组碱性磷酸酶为(363.57±20.67),(536.44±11.42),(537.11±26.83),(548.10±22.34)nkat;转染组细胞蛋白合成为1.41±0.23,1.46±0.24,1.59±0.33,1.74±0.26;对照组细胞蛋白合成为0.82±0.11,0.83±0.09,0.85±0.06,0.91±0.09]。④透射电镜可见转基因细胞内质网增多,线粒体致密,而糖原溶解与脂肪空泡则减少。结论:血管内皮生长因子基因转染可促进骨髓基质细胞的成骨分化。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景：骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165（vascular endothelial growth factor 165,VEGF165）不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的：观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法：体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1：3比例的混合液转染,并分为3组：转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论：转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义（P〈0.05）,但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义（P〉0.05）,转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义（P〈0.05）,hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

人血管内皮生长因子165基因转染兔骨髓间充质干细胞的蛋白表达

背景:骨髓间充质干细胞是最好的组织工程种子细胞来源,含有血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)不仅对血管再生和启动成骨修复有重要意义,其持续稳定的释放还能够提高新生骨的矿化程度,增强修复组织的力学性能。目的:观察hVEG F165基因转染的兔骨髓间充质干细胞分泌血管内皮生长因子的蛋白功能。方法:体外分离、培养兔骨髓间充质干细胞,纯化并鉴定兔骨髓间充质干细胞;免疫荧光法检测细胞表面标志;传代培养后的骨髓间充质干细胞以pcDNA3.1-VEGF165质粒和脂质体1:3比例的混合液转染,并分为3组:转染组应用pcDNA3.1-VEGF165转染细胞,空载体转染组应用pcDNA3.1-空载体转染,未转染组不处理。通过ELISA和Western-blot检测转染后细胞中外源性血管内皮生长因子的表达。结果与结论:转染组与其他两组比较,VEGF165蛋白含量显著增高,差异有显著性意义(P<0.05),但空载体转染组与未转染组之间差异无显著性意义(P>0.05),转染组不同时间点之间VEGF165蛋白含量差异均有显著性意义(P<0.05),hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF165蛋白。提示采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF165。     

人血管生成素1和血管内皮生长因子165重组腺病毒载体构建及目的基因表达

目的:拟构建人血管生成素1和血管内皮生长因子165腺病毒载体,观察靶细胞转染后目的基因的表达水平。方法:通过RT-PCR方法克隆人Ang-1全长编码基因,PCR法以pcDNA3.0-VEGF165质粒为模板扩增VEGF165基因,分别将目的基因酶切连接到带有GFP标记的pTrack-CMV质粒上,构建重组质粒pTrack-CMV-Ang-1和pTrack-CMV-VEGF165,经PCR、酶切和测序鉴定后将其PmeI线性化与腺病毒质粒pAdeasy-1共转化BJ5183细菌,获得重组腺病毒载体pAdeasy-1-pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165,经PacI线性化后转染QBI-293A包装细胞,收获重组腺病毒Ad-Ang-1及Ad-VEGF165。结果:PCR﹑双酶切和测序鉴定结果证实成功构建pTrack-CMV-Ang-1/VEGF165重组转移质粒,PmeI线性化后重组腺病毒载体获得成功包装。脂质体转染QBI-293A细胞后光镜下可见由腺病毒引起的细胞圆缩、聚集呈菌落状的典型细胞病理性改变;荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,且荧光强度随培养时间延长而逐渐增强;经多轮感染、扩增后,病毒效价可达(2.0～5.0)×1010pfu/mL。转染48h后,293A细胞中的血管生成素1与血管内皮生长因子含量均明显提高(F=427.93,17.93,P<0.05)。结论:成功构建并获得了Ad-Ang-1及Ad-VEGF165重组腺病毒,血管生成素1与血管内皮生长因子165均能在靶细胞中有效表达。     

腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的：课题组以前的实验证实，人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞，使之大量表达人血管内皮生长因子165，促进局部新生血管生成，有利于组织修复。实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。 方法：实验于2005—03／2006—01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成。人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者，得到医院伦理道德委员会批准。将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组：①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组。②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组。③阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组：不给予特殊处理。各组细胞处理后12d，应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性；于处理后14d，应用VonKossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况。 结果：①经多次换液传代，人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态。处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少；β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化。②Yon Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成，明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组。③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组（F=165．18，P=0．00）。结论：人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质于细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨疾病的可行性。     

腺病毒介导入血管内皮生长因子_165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点

目的：课题组以前的实验证实，人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒可高效感染人骨髓间充质干细胞，使之大量表达人血管内皮生长因子165，促进局部新生血管生成，有利于组织修复。实验观察腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力的影响。 方法：实验于2005—03／2006—01在郧阳医学院附属人民医院临床研究所和创伤骨科完成。人骨髓间充质干细胞取自健康成年男性自愿者，得到医院伦理道德委员会批准。将人骨髓间充质干细胞体外扩增纯化后随机分为4组：①人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组。②β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组。③阳性对照组：培养液中添加地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠。④空白对照组：不给予特殊处理。各组细胞处理后12d，应用全自动生化分析仪检测各组培养上液碱性磷酸酶活性；于处理后14d，应用VonKossa染色法检测人骨髓间充质干细胞中骨胶原结节形成情况。 结果：①经多次换液传代，人骨髓间充质干细胞呈均一梭形形态。处理后人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组细胞形态逐渐趋于扁平，突起减少；β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组形态无明显变化。②Yon Kossa染色人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组可见大量红色骨胶原结节形成，明显多于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组。③人血管内皮生长因子基因重组腺病毒组与阳性对照组培养上清碱性磷酸酶活性显著高于β-半乳糖酐酶基因重组腺病毒组和空白对照组（F=165．18，P=0．00）。结论：人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质于细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨?     

hVEGF165基因转染后骨髓间充质干细胞蛋白分泌功能及成骨活性的检测

目的：血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管再生和骨组织再生过程中起着重要的调节作用。观察hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞分泌VEGF的功能及转染后细胞的成骨活性。 方法：实验于2004—07／2005—12在江苏省血液研究所国家重点实验室完成。①体外分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞，传代培养后以1μg PcDNA3．1-hVEGF165：3μL阳离子脂质体Lipofectamine的比例转染，通过免疫组织化学SP方法检测转染后细胞中外源性VEGF的表达。②体外分离、培养大鼠肾微血管内皮细胞，分别加入hVEGF165基因转染48h及1周后细胞上清、空载体转染及未转染组细胞上清，MTT法观察细胞增殖情况，以了解转染后细胞培养上清中VEGF的生物学活性。③测定在正常条件培养和成骨条件培养下，转染后细胞上清中碱性磷酸酶、骨钙素的水平。 结果：①hVEGF165基因转染的骨髓间充质干细胞能成功分泌VEGF蛋白。②hVEGF165基因转染48h组大鼠肾微血管内皮细胞A值高于空载体转染及未转染组（P〈0．05），但低于hVEGF165基因转染1周组。③成骨条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的分泌量明显高于未转染组（P〈0．05）；而在正常条件培养下，基因转染组细胞碱性磷酸酶和骨钙素的表达分泌量较低。 结论：①采用基因转染技术可将hVEGF165基因转染到骨髓间充质干细胞中并可有效表达具有生物活性的VEGF，且这种生物学活性呈剂量依赖性。②在成骨条件培养下，转染hVEGF165基因后骨髓间充质干细胞的成骨能力增强。     

重组人血管内皮生长因子165腺病毒载体的构建与鉴定

目的 探讨构建携带人血管内皮细胞生长因子(hVEGF)的重组腺病毒载体,为进一步的基因转染构建组织工程骨的血管化提供实验基础.方法 采用RT-PCR扩增的方法获得人源性的hVEGF165,并克隆入穿梭质粒pAdTraek CMV.构建的质粒pAdTrack CMV-VEGF165经酶切及测序鉴定正确后,通过pAdeasy 1质粒的介导与腺病毒包装质粒pAdTrack CMV.VEGF165共转染至人胚肾细胞HEK293,经同源重组后获得携带人VEGF的重组腺病毒pAdTrack CMV.VEGF165.应用PCR鉴定重组腺病毒,空斑传代纯化病毒并反复冻融扩增病毒,测定病毒滴度.结果 PCR鉴定证实重组腺病毒含有人VEGF,病毒滴度为0.5×10"pfu/ml.结论 成功构建的携带人VEGF的重组腺病毒载体能在HEK293细胞内扩增获得足够高的病毒滴度,为基因治疗构建组织工程骨血管化的研究奠定基础.     

携带人血管内皮生长因子165慢病毒表达载体的构建与表达

背景:已有研究证实血管内皮生长因子在正常肝脏肝部分切除后余肝的再生过程中发挥着重要的作用,但关于其对肝硬化肝脏是否也有相同作用国内外鲜有报道。目的:构建携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体,体外转染BLR3A大鼠肝细胞并观察该细胞中人血管内皮生长因子165基因的表达。方法:采用DNA重组技术将人血管内皮生长因子165基因克隆入pLenti6/V5-D-TOPO慢病毒表达载体中,筛选出阳性克隆与慢病毒包装系统ViraPowerTM Packaging Mix共转染293T细胞产生病毒颗粒,通过实时定量-聚合酶链反应法测定病毒滴度;携带人血管内皮生长因子165基因的慢病毒载体体外转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,利用反转录-聚合酶链反应及Western blot法检测细胞中人VEGF165mRNA及蛋白的表达。结果与结论:成功构建了表达人VEGF165基因的慢病毒载体pLenti6/V5-D-TOPO-VEGF165,测得病毒滴度为1.18×107VP/mL。重组慢病毒载体转染BLR3A大鼠肝细胞72h后,荧光蛋白表达率超过80%,反转录-聚合酶链反应及Western blot法测得转染组人血管内皮生长因子165mRNA及血管内皮生长因子165蛋白表达阳性。提示构建的携带人血管内皮生长因子165的慢病毒载体可有效转染BLR3A大鼠肝细胞,并促使该细胞表达人血管内皮生长因子165mRNA及蛋白。     

血管内皮细胞生长因子165基因重组腺病毒的构建及其鉴定

目的:基因重组腺病毒具有较高的转染率,且宿主范围广.实验拟构建携带人血管内皮细胞生长因子165基因的重组腺病毒载体(Ad.VEGF165),为后续基因转染、微囊化基因工程细胞及其动物模型研究提供实验基础.方法:实验于2007-01/05在解放军第二军医大学长海医院胸心外科研究所实验室完成(国家级重点实验室).①实验材料:pAxCAwt.VEGF165由长海医院胸心外科研究所惠赠.②实验方法:采用脂质体转染法,将pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC共转染人胚肾293细胞,扩增后获得载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷犁重组腺病毒.⑧实验评估:应用聚合酶链反应及酶切证实重组腺病毒中的目的基因.并根据50%组织培养感染剂量法计算病毒滴度.结果:①重组腺病毒Ad.VEGF165的构建:采用脂质体法可使pAxCAwt.VEGF165与DNA-TIC有效转染人胚肾293细胞,扩增出载人血管内皮细胞生长因子165基因的复制缺陷型重组腺病毒.②重组腺病毒Ad.VEGFl65的鉴定:聚合酶链反应的产物进行Nco I酶切鉴定,可得到597 bp、146 bp 2个片段,与GeneTool软件理论上计算的结果完全一致,计算病毒滴度为2.2×1015pfa/L.结论:采用pAxCAwt.VEGF165与DNA-TPC系统经脂质体转染法成功构建的复制缺陷的重组腺病毒Ad.VEGF165滴度高、毒性低、效率高、体外转染安全.     

携带人血管内皮生长因子165基因的复制缺陷型腺病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)165基因的重组腺病毒载体。方法:应用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切质粒PDC-VEGF和PDC315,连接DNA目的片段后转化大肠杆菌DH5α构建重组质粒PDC315-VEGF,对重组质粒进行酶切分析和测序鉴定。通过脂质体将质粒PDC315-VEGF与质粒pBHGE3共转染293细胞获取重组腺病毒,以重组腺病毒DNA为模板,PCR鉴定构建的重组腺病毒。扩增、浓缩纯化重组腺病毒,微量滴定法测定腺病毒滴度。结果:通过连接反应构建重组质粒PDC315-VEGF,酶切分析和测序证明构建正确。经细胞内同源重组构建携带人VEGF165基因的重组腺病毒,PCR扩增421bpVEGF165片段,证实VEGF165基因成功克隆到复制缺陷型腺病毒载体,腺病毒滴度为5.0×109pfu/mL。结论:通过双质粒细胞同源重组,生产携带人VEGF165基因的重组腺病毒,为动物试验奠定基础。