大黄酸及大黄素诱导高糖大鼠肾小球系膜细胞的凋亡

背景：课题组前期实验证实中药复方消可宁能有效防治早期糖尿病肾病。目的：比较大黄酸与大黄素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响程度。方法：分别用不同浓度20,40,80μmol/L的大黄酸和大黄素刺激高糖培养的肾小球系膜细胞,苏木精-伊红染色观察凋亡细胞形态,DAPI荧光染色观察细胞核凋亡情况,流式细胞仪观察细胞凋亡率。结果与结论：苏木精-伊红染色及 DAPI 染色结果显示大黄酸对髙糖培养的肾小球系膜细胞凋亡的影响程度强于大黄素的影响程度。细胞凋亡率的对比显示大黄酸对髙糖培养的肾小球系膜细胞的早期凋亡率与晚期凋亡率均强于大黄素。说明低中高浓度的大黄酸、大黄素均可诱导肾小球系膜细胞凋亡,但大黄酸的药效强于大黄素。     

大黄素干预高糖培养大鼠肾小球系膜细胞的凋亡

背景:前期工作已经证实中药复方消可宁(制大黄、制附子、生黄芪)能有效防治早期糖尿病肾病并获得国家专利(专利号:200410064899X)。目的:观察大黄主要活性成分大黄素对高糖培养的SD大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响。方法:用20,40,80μmol/L大黄素刺激高糖培养的SD大鼠肾小球系膜细胞,苏木精-伊红染色观察凋亡细胞形态,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚荧光染色观察细胞核凋亡情况,流式细胞仪观察细胞凋亡率。结果与结论:苏木精-伊红染色及4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色结果显示大黄素对高糖培养的肾小球系膜细胞的凋亡有影响,且与浓度与时间成正相关,细胞凋亡率组间差异有显著性意义(P<0.05)。提示大黄素可诱导肾小球系膜细胞凋亡,且与药物浓度及时间成正相关。     

青蒿琥酯对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡的影响

目的:观察青蒿琥酯对脂多糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMC)凋亡的影响。方法:用不同浓度的青蒿琥酯刺激脂多糖诱导增殖的大鼠肾小球系膜细胞,HE染色观察凋亡细胞形态,DAPI荧光染色观察细胞核凋亡情况,用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:青蒿琥酯对系膜细胞凋亡有明显诱导作用,呈一定剂量依赖性。结论:青蒿琥酯能够剂量依赖性地诱导大鼠系膜细胞凋亡。     

青藤碱对大鼠肾小球系膜细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨青藤碱(sinomenine,SIN)对大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)增殖和凋亡的影响。方法体外培养的大鼠MC,分为SIN分为高、中、低剂量组和空白对照组。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖情况,碘化丙啶染色后流式细胞术检测凋亡率,吖啶橙/溴乙锭染色后采用荧光显微镜观察细胞凋亡水平。结果MTT实验和流式细胞检测结果显示,与空白对照组比较,SIN高(P<0.01)、中(P<0.05)、低(P<0.05)剂量组MC增殖降低,凋亡增加,吖啶橙/溴乙锭染色结果显示SIN干预的MC出现凋亡的百分率增加。结论青藤碱可抑制大鼠肾小球系膜细胞增殖并促进其凋亡,可能会使肾脏病理性损害减轻。     

改良的肾小球系膜细胞体外培养方法

对大鼠肾小球系膜细胞进行体外培养,利用单克隆抗体进行间接免疫荧光染以,结果抗Ｖｉｍｅｎｔｉｎ和抗Ｄｅｓｍｉｎ抗体均为阳性,而抗Ｋｅｒａｔｉｎ抗体为阴性,证实培养的细胞单纯的ＧＭＣ;并探索了ＧＭＣ培养的最佳条件,且对肾小球的收集方法作了改进,结果显示,该方法收集的肾小球数多,肾小球脱落彻底,且肾小球贴壁率高,使得ＧＭＣ生长既多又好。     

高糖条件对大鼠肾小球系膜细胞外基质表达的影响

目的 观察高糖环境对大鼠肾小球系膜细胞分泌细胞外基质成分中透明质酸、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原表达的影响，为临床治疗糖尿病肾病提供一定的实验依据。方法 (1)采用酶联免疫吸附试验测定经体外不同浓度高糖条件下培养的大鼠肾小球系膜细胞HA、LN、Ⅳ型胶原的表达；(2)利用四甲基偶氮唑蓝比色法动态观察不同葡萄糖浓度对GMC增殖的作用。结果 高糖浓度抑制GMC增殖，此抑制作用和糖浓度成正相关。在高糖环境下48～72h GMC分泌HA、LN、Ⅳ型胶原活性明显增加，其分泌表现为逐渐升高的趋势，并在1W内维持较高水平，各组间差异显著。证实ECM的增加不依赖于细胞增殖状态，对照组则处于一个较稳定的状态，说明高糖对GMC分泌ECM有明显的促进作用。结论 细胞外高葡萄糖环境抑制GMC增殖，且呈浓度依赖性，高糖环境中GMC产生ECM的含量明显增加，所以ECM过度积聚可能参与肾小球硬化的发生。     

脂联素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞表达VEGF及PEDF的影响

目的观察脂联素对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)的影响,探讨脂联素对糖尿病肾病的保护作用机制。方法体外培养大鼠肾小球系膜细胞,随机分为7组:常糖组、高糖A组、B组(培养液葡萄糖浓度分别为5.6 mmol/L、15 mmol/L、30 mmol/L,其中以高糖B组作为脂联素干预的对照组);脂联素A、B、C、D组(各组培养液葡萄糖浓度均为30 mmol/L+脂联素,脂联素浓度依次分别为2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml),作用24 h,逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR法)测定各组细胞VEGF mRNA、PEDFmRNA表达水平;ELISA法测定各组上清液中VEGF、PEDF蛋白的含量。结果与常糖组相比,高糖各组大鼠肾小球系膜细胞VEGF mRNA及其蛋白表达升高(P﹤0.05),PEDF mRNA及PEDF蛋白表达降低(P﹤0.05);与高糖B组相比,脂联素各组大鼠肾小球系膜细胞VEGF mRNA及其蛋白表达降低(P﹤0.05),PEDF mRNA及PEDF蛋白表达升高(P﹤0.01)。结论高糖可上调大鼠肾系膜细胞VEGF表达,抑制PEDF的表达;脂联素可抑制高糖环境下系膜细胞对VEGF的表达并提高其对PEDF的表达。     

肝细胞生长素在体外对大鼠肾小球系膜细胞生物活性的影响

目的 观察低分子肝细胞生长素(HPN)对炎症因子刺激下的大鼠肾小球系膜细胞增殖及产生TGFβ的影响。方法 用^3H—TdR掺入法检测肾小球系膜细胞(GMC)增殖变化，用ELISA法检测肾小球系膜细胞培养上清中TGFβ的水平。结果 在无IL-1β存在时，浓度为400u/孔的低分子肝细胞生长素对常规培养的系膜细胞增殖有明显抑制作用(P＜0．01)，而对TGFβ的产生无影响；但它对IL-β刺激下的大鼠系膜细胞增殖和TGFβ产生均有明显抑制作用(均P＜0．01)。低分子肝细胞生长素在100u/孔浓度时无上述作用。结论 高剂量HPN可抑制体外培养的大鼠系膜细胞增殖，降低IL-β刺激系膜细胞产生TGFβ。低分子肝细胞生长素无种属特异性和组织特异性。     

miR-146b在高糖环境下对肾小球系膜细胞的作用研究

目的探讨miR-146b在高糖环境下对肾小球系膜细胞的作用。方法构建高糖培养环境,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-146b在大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)、足细胞(podocyte)及肾小球系膜细胞(HBZY-1)中的表达水平;western blot分析过表达/敲减miR-146b前后,HBZY-1细胞中YAP及磷酸化YAP(p-YAP)蛋白的表达水平;细胞免疫荧光法检测YAP蛋白的表达情况。结果体外经高糖刺激后,HBZY-1细胞中miR-146b的表达水平(2.197±0.166)明显升高(t=7.215,P0.01)。western blot结果显示,高糖组YAP蛋白(0.753±0.008)的表达水平升高(t=32.17,P0.001),p-YAP蛋白(0.372±0.005)的表达水平降低(t=39.56,P0.001);免疫荧光结果显示,高糖组YAP蛋白荧光强度(53.620±4.229)明显升高(t=5.410,P0.01)。过表达miR-146b后,western blot结果显示,YAP蛋白(0.883±0.005)表达上调(t=10.71,P0.001),而p-YAP蛋白(0.606±0.006)表达下调(t=44.16,P0.001);免疫荧光结果显示,YAP荧光强度(25.70±1.589)增强(t=10.45,P0.001)。敲减miR-146b后,western blot结果显示,YAP蛋白(0.706±0.002)表达下调(t=22.15,P0.001),p-YAP蛋白(0.774±0.003)表达上调(t=25.61,P0.001);免疫荧光结果显示,YAP荧光强度(8.900±1.022)减弱(t=11.56,P0.001)。结论 miR-146b在高糖刺激的HBZY-1细胞中表达上调,可能通过调控YAP信号参与肾细胞损伤。     

C肽对高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的:探讨C肽对体外高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞系HBZY-1生长的影响。方法:对照组仅含低糖MEM培养液;实验组:高糖MEM培养液含不同浓度的C肽,分别培养24h,48h,72h,用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)检测细胞系HBZY-1的增殖情况。结果:高糖诱导大鼠系膜细胞系HBZY-1的增殖;不同浓度的C肽对高糖诱导的细胞系HBZY-1增殖影响程度不同。10,50,300nmol/LC肽作用24h可明显抑制细胞增殖(P<0.05),而0.5,900nmol/L作用不显著。结论:C肽可抑制高糖诱导的大鼠系膜细胞系HBZY-1的增殖;呈时间、剂量依赖效应。C肽可能对糖尿病肾病的防治起到有益的作用。     

Rhein effects on apoptosis of glomerular mesangial cells cultured with high glucose in Sprague Dawley rats

BACKGROUND:Our previous study has already manifested that Chinese medicine Xiaokening containing Rhein can effectively control the development of early diabetic nephropathy. OBJECTIVE:To investigate the effect of Rhein on apoptosis of glomerular mesangial cel s (GMCs) of Sprague Dawley rats cultured with high glucose. METHODS:The GMCs cultured with high glucose were stimulated by different concentrations of Rhein (20,40,80μmol/L). Morphology of GMCs was discriminated by hematoxylin-eosin staining. Karyon apoptosis was examined by fluorescence staining of 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Cel apoptosis rate was detected by flow cytometry. RESULTS AND CONCLUSION:The outcome of hematoxylin-eosin staining and 4’,6-diamidino-2-phenylindole staining indicated that Rhein could obviously induce apoptosis of GMCs in a dose-and time-dependent manner. The apoptosis rate had significant difference among different groups (P<0.05). This result shows that Rhein can obviously induce apoptosis of GMCs cultured with high glucose and in a dose-and time-dependent manner.     

高糖条件对大鼠肾小球系膜细胞外基质表达的影响

目的　观察高糖环境对大鼠肾小球系膜细胞分泌细胞外基质成分中透明质酸、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原表达的影响 ,为临床治疗糖尿病肾病提供一定的实验依据。方法　 (1 )采用酶联免疫吸附试验测定经体外不同浓度高糖条件下培养的大鼠肾小球系膜细胞HA、LN、Ⅳ型胶原的表达 ;(2 )利用四甲基偶氮唑蓝比色法动态观察不同葡萄糖浓度对GMC增殖的作用。结果　高糖浓度抑制GMC增殖 ,此抑制作用和糖浓度成正相关。在高糖环境下 4 8～ 72hGMC分泌HA、LN、Ⅳ型胶原活性明显增加 ,其分泌表现为逐渐升高的趋势 ,并在 1W内维持较高水平 ,各组间差异显著。证实ECM的增加不依赖于细胞增殖状态 ,对照组则处于一个较稳定的状态 ,说明高糖对GMC分泌ECM有明显的促进作用。结论　细胞外高葡萄糖环境抑制GMC增殖 ,且呈浓度依赖性 ,高糖环境中GMC产生ECM的含量明显增加 ,所以ECM过度积聚可能参与肾小球硬化的发生     

普伐他汀对高糖培养的肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质积聚的影响

目的:探讨普伐他汀对高糖培养的肾小球系膜细胞(MC)增殖和细胞外基质(ECM)积聚的影响。方法:大鼠MC分别培养在低糖组、高糖组及普伐他汀组。CCK-8测定MC增殖,ELISA法检测细胞培养上清液Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)、纤维连接蛋白(FN)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的分泌情况,明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的活性,RT-PCR法检测结缔组织生长因子(CTGF)mRNA的表达。结果:与低糖组相比,高糖能促进Col-Ⅳ、FN合成,抑制MMP-2、MMP-9活性,增加TIMP-1、TGF-β1、CTGF的分泌,而普伐他汀能一定程度上逆转上述现象。结论:普伐他汀能抑制高糖环境下的MC增殖,并通过抑制ECM的合成、促进ECM的降解减少ECM积聚,机制可能与抑制TGF-β1、CTGF有关。     

Morin inhibits cell proliferation and fibronectin accumulation in rat glomerular mesangial cells cultured under high glucose condition

Morin, is a natural bioflavonoid isolated from Chinese herbs of the Moraceae family, has been reported to possess antidiabetic activity. However, the role of morin on glomerular mesangial cells (MCs) proliferation and extracellular matrix (ECM) accumulation in diabetic condition is still unclear. Therefore, in this study, we investigated the role of morin on cell proliferation and ECM accumulation in rat glomerular MCs cultured under high glucose (HG) condition. Our results showed that morin inhibited HG-induced MC proliferation, arrested HG-induced cell-cycle progression, reversed HG-inhibited expression of p21^Waf1/Cip1 and p27^Kip1. It also inhibited HG-induced ECM expression, ROS generation and NOX4 expression in MCs. Furthermore, morin suppressed HG-induced phosphorylation of p38 MAPK and JNK1/2 in MCs. These data suggest that morin inhibits HG-induced MC proliferation and ECM expression through suppressing the activation of p38 MAPK and JNK signaling pathways. Thus, morin may be useful for the prevention or treatment of diabetic nephropathy.     

高糖对大鼠肾系膜细胞Smad2/3及Smad7表达的影响

目的:观察不同浓度高糖刺激后大鼠肾小球系膜细胞内Smad2/3和Smad7蛋白的表达,探讨糖尿病时肾脏Smad信号通路的改变。方法:将体外培养的大鼠肾系膜细胞分别设正常对照组(葡萄糖浓度5.6mmol/L)、20mmol/L高糖组、30mmol/L高糖组、甘露醇组。用细胞免疫荧光染色法及激光共聚焦显微镜检测各组细胞Smad2/3及Smad7蛋白的表达。结果:正常对照组系膜细胞Smad2/3蛋白表达较弱,Smad7蛋白表达较强。两高糖组Smad2/3表达较正常对照组强(P﹤0.05),呈浓度依赖性;Smad7表达较正常对照组弱(P﹤0.05),呈浓度依赖性。甘露醇组与正常对照组无明显差异(P﹥0.05)。结论:高糖可诱导肾系膜细胞Smad2/3蛋白表达增强,Smad7蛋白表达减弱。提示Smad信号通路参与了糖尿病肾病的发病机制。