M1与7TD1细胞中IL-6激活核因子的比较

目的：探讨ＩＬ－６在不同靶细胞中引起不同生物学效应的分子基础。方法：检测ＩＬ－６对Ｍ１与７ＴＤ１细胞生长及分化的影响。通过凝胶阻滞电脉（ＥＭＳＡ）比较ＩＬ－６在Ｍ１与７ＴＤ１细胞中激活ＳＴＡＴ３代表ＪＡＫ－ＳＴＡＴｓ通路）和ＮＦ－ＩＬ０６（代表Ｐ２１ｒａｓ／ＭＡＰＫ／ＮＦＩＬ－６通路）的情况。结果：ＩＬ－６诱导Ｍ１细胞生长停止并向巨噬细胞方向分化,却促进７ＴＤ１细胞生长。在这两种细胞中,低剂量ＩＬ     

构建鼠IL—6反义RNA的逆转录病毒重组体

用限制性内切酶消化，提取鼠白细胞介素６ｃＤＮＡ全基因，并克隆至逆转录病毒穿梭质粒ｐＺＩＰ－ｎｅｏＳＶ（ｘ）ＢａｍＨＩ位点，经斑点杂交，限制性内切酶消化，电泳鉴定，证实成功地构建了表达鼠ＩＬ－６反义ＲＮＡ的逆转录病毒重组体，从而为研究白细胞介素６基因转移与治疗提代了物质基础。     

IL—6在诱导M1白血病细胞分化后凋亡中的应用

目的 探讨ＩＬ－６能否诱导Ｍ１小鼠急性髓样白血病细胞凋亡及其分子机制。方法 透射电镜观察细胞形态判断有无凋亡发生：ＲＴ－ＰＣＲ及狭缝杂交分析ｂｃｌ－２家族成员表达水平的改变。结果：ＩＬ－６诱导Ｍ１细胞向巨噬细胞方向分化后，Ｍ１细胞发生凋亡；ｂｃｌ－２，ｂｃｌ－ＸＬ在ＩＬ－６诱导下表达下调，ｂａｘ表达上调，结论ＩＬ－６诱导Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ比例改变，使Ｍ１细胞分化后凋亡。     

电转人IL6受体基因对急性白血病细胞生物学特性的影响

为了探索重组ＩＬ６－ＰＥ４０融合蛋白靶向杀伤白血病的效应，我们已成功地将编码人ＩＬ６Ｒ的全长ｃＤＮＡ转入ＢＮＭＬ大鼠急性早幼粒细胞白血病ＬＴ１２细胞中。本文研究了ＩＬ６Ｒ ｃＤＮＡ转入ＬＴ１２细胞后对该细胞原有生物学特性的影响。结果表明：①ＬＴ１２－ＩＬ６Ｒ＾＋细胞与原代细胞五种酶学组化无任何区别；②ＬＴ１２－ＩＬ６Ｒ＾＋细胞不仅高表达ＩＬ６Ｒ而且仍保持原的表面抗原性质，如与ＲＭ－１２４单抗结合；     

IL－6和TNF对白血病细胞的调控作用及意义

通过诱导急性白血病肿瘤细胞自分泌白细胞介素６和肿瘤坏死因子，利用急性白血病原代肿瘤细胞和肿瘤细胞系ＨＬ－６０和Ｋ５６２，分别观察了ＩＬ－６和ＴＮＦα对急性白血病细胞的调控作用。结果发现，急性白血病细胞存在着ＩＬ－６和ＴＮＦα的自分泌作用，而ＴＮＦα和ＩＬ－６对白血病细胞则有诱导分化作用；进一步研究发现，ＴＮＦα对急性白血病细胞株还可呈现生长抑制作用；而ＩＬ－６则可表现为生长促进作用。ＩＬ－６和ＴＮＦα对急性白血病细胞的这种凋控在白血病的发病和免疫调控治疗中将有意义。     

IL－6和TNF对白血病细胞的调控作用及意义

通过诱导急性白血病肿瘤细胞自分泌白细胞介素６和肿瘤坏死因子，利用急性白血病原代肿瘤细胞和肿瘤细胞系ＨＬ－６０和Ｋ５６２，分别观察了ＩＬ－６和ＴＮＦα对急性白血病细胞的调控作用。结果发现，急性白血病细胞存在着ＩＬ－６和ＴＮＦα的自分泌作用，而ＴＮＦα和ＩＬ－６对白血病细胞则有诱导分化作用；进一步研究发现，ＴＮＦα对急性白血病细胞株还可呈现生长抑制作用；而ＩＬ－６则可表现为生长促进作用。ＩＬ－６和ＴＮＦα对急性白血病细胞的这种凋控在白血病的发病和免疫调控治疗中将有意义。     

SHIP1调控STAT3信号通路对白血病Jurkat细胞活力和凋亡的影响

目的:探讨含SH2结构域的肌醇5-磷酸酶1(SHIP1)通过调控信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路对人白血病细胞活力和凋亡的影响。方法:以白血病Jurkat细胞为研究对象,将转染空载体和SHIP1过表达载体的细胞分别记为阴性对照(NC)组和SHIP1组,同时以不作处理的细胞为空白对照(control)组,用real-time PCR和Western blot检测转染效果,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中活化的caspase-3(cleaved caspase-3)、STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)的蛋白水平。同时,用STAT3信号通路抑制剂AG490作用于control组和SHIP1组细胞,分别记为control+AG490组和SHIP1+AG490组,再观测上述指标的变化。结果:分别与control组和NC组比较,SHIP1组SHIP1的mRNA表达水平和蛋白水平均显著升高(P0.05);细胞存活率显著降低(P0.05);细胞凋亡率显著升高(P0.05);cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P0.05);p-STAT3蛋白水平显著降低(P0.05)。分别与control组和control+AG490组比较,SHIP1+AG490组的细胞存活率显著降低(P0.05);cleaved caspase-3蛋白水平显著升高(P0.05);p-STAT3蛋白水平显著降低(P0.05);细胞凋亡率显著升高(P0.05)。结论:SHIP1能够通过抑制STAT3信号通路抑制人白血病细胞生长,促进白血病细胞凋亡。     

反义hTERT基因对白血病细胞端粒酶表达及活性的抑制作用

目的探讨反义hTERT基因体外对白血病细胞端粒酶基因表达及其活性的抑制作用。方法采用基因重组技术设计并构建了针对端粒酶活性蛋白催化亚单位mRNA的5’端序列的反义pcDNA-hTERT真核表达载体,通过SuperFect(QIAGEN)将其瞬时转染人早幼粒白血病细胞株Hk及人红白血病细胞株K562,并运用流式细胞术测定其细胞凋亡与细胞周期的变化,同时运用实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应方法对其端粒酶蛋白催化亚单位基因的表达水平进行了检测,端粒酶活性的检测则采用了非放射性TRAP-银染法。结果成功地构建了反义pcDNA-hTERT真核表达载体,并将其转染至K562和HL60白血病细胞株。结果与空载体组、空白组相比,反义pcDNA-hTERT组体外显示出明显有效地抑制端粒酶的基因表达及其活性的作用;在细胞凋亡与细胞周期方面,反义组能引起细胞周期左移,增殖分裂能力降低,同时伴有细胞凋亡数的增加。结论研究构建的反义hTERT基因体外确实能明显有效地下调白血病细胞端粒酶的基因表达及其活性,在抗肿瘤基因治疗中具有特异的靶向性和潜在应用的广谱性。     

急性期川崎病信号转导和转录激活因子3的表达及意义

目的:探讨急性期川崎病IL-6介导信号转导和转录激活因子3的表达及意义。方法:急性期川崎病(KD)患儿64例,感染发热患儿18例,正常同年龄对照42例。采用Western blot检测外周血单个核细胞(PBMCs)IL-6刺激前后总蛋白,核蛋白STAT3,pSTAT3的表达水平。荧光定量PCR检测PBMCs IL-6刺激前后及IL-6R抗体阻断后STAT3 mRNA的表达水平。结果:急性期KD患儿PBMCs用IL-6刺激前、后总蛋白STAT3,pSTAT3表达水平高于正常儿童;核蛋白则为IL-6刺激前KD患儿STAT3,pSTAT3表达与正常儿童无明显差异,IL-6刺激后KD患儿STAT3,pSTAT3表达明显高于正常儿童。IL-6刺激前、后KD患儿STAT3 mRNA水平(1.15±0.19,1.74±0.59)均高于感染发热患儿(1.07±0.21,1.45±0.32)及正常儿童(0.56±0.37,1.03±0.51);KD冠脉损伤组(1.19±0.21,1.81±0.47)STAT3 mRNA高于冠脉未损伤组(1.13±0.29,1.73±0.48)。经IL-6R抗体阻断后,KD患儿STAT3 mRNA水平低于IL-6刺激前、后KD患儿及感染发热组(0.99±0.15)。结论:急性期KD患儿体内存在刺激STAT3表达和活化的因素,体外IL-6刺激能增强STAT3的表达和活化并进入细胞核;阻断实验提示IL-6在KD患儿STAT3过度表达、活化中起主导作用,本研究为用IL-6R阻断剂治疗川崎病提供了实验证据。     

靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体的构建

目的:构建并鉴定靶向人转录因子STAT3基因的shRNA慢病毒载体.方法:设计合成针对人STAT3基因的shRNA序列,运用基因重组技术将其插入到含U6启动子及绿色荧光蛋白基因的慢病毒表达载体pSicoR中,构建shRNA重组质粒pSicoR-STAT3-shRNA.经双酶切及DNA测序鉴定后,利用转染试剂X-tremeGENE HP将第3代慢病毒载体共转染至HEK293细胞进行病毒包装.以阴性载体为对照,用RT-PCR和Western blot分别检测STAT3基因和蛋白表达水平.结果:双酶切及测序证实载体构建正确,在HEK293中成功包装出高滴度慢病毒颗粒,感染HEK293后STAT3基因表达和蛋白质表达水平均较对照组明显降低(P＜0.05).结论:成功构建了靶向人STAT3基因的shRNA慢病毒载体.     

preS2反义RNA肝癌特异性表达载体的构建及相关特性研究

目的 构建针对preS2基因的肝癌特异性反义RNA表达载体，并对其特异性和有效性进行研究。方法 PCR扩增preS2(3203—340)基因，克隆至含甲胎蛋白启动子的EB病毒表达载体pEBAF，构建反义RNA表达载体pEBAF-as—preS2。脂质体转染肝癌细胞和ECV304细胞，3d后Northern blot检测preS2 mRNA的表达，ELISA检测HBV抗原，荧光定量PCR检测HBV DNA。结果序列分析表明，pEBAF-as-preS2构建成功，Northern blot证实反义RNA仅在AFP阳性的肝癌细胞中表达，pEBAF-as-preS2转染3d后，可显著抑制HepG2．2．15细胞HBV复制和抗原表达，对HBsAg、HBeAg表达的抑制率分别为33．4％和41．5％；对HBV复制抑制率为86％。结论 反义RNA表达载体pEBAF-as-preS2仅在肝癌细胞中特异表达、并可有效抑制HBV，有良好的开发应用前景。     

STAT3短发夹RNA表达载体的构建及对SiHa细胞增殖和凋亡的作用

目的:探讨信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(shRNA)真核表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖和凋亡的作用.方法:根据siRNA设计原则, 结合pSilencer2.1-U6-neo质粒特点, 针对STAT3基因设计并合成两条寡聚DNA片段, 退火后克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒, 脂质体法将重组质粒转染人宫颈癌SiHa细胞.RT-PCR和Western blot检测SiHa细胞STAT3基因mRNA和蛋白表达水平;MTT法和流式细胞术(FCM)检测细胞的增殖和凋亡.结果:成功构建了STAT3基因shRNA真核表达载体, 转染人宫颈癌SiHa细胞.细胞STAT3蛋白及mRNA表达下降;同时SiHa细胞增殖能力下降, 细胞凋亡增加.结论:构建的STAT3基因shRNA真核表达载体能够通过下调STAT3基因表达, 抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖能力, 诱导细胞凋亡.     

Interleukin 22 protects colorectal cancer cells from chemotherapy by activating the STAT3 pathway and inducing autocrine expression of interleukin 8

Resistance to chemotherapy is the major cause of colorectal cancer (CRC) treatment failure. The cytokine IL-22, which is produced by T cells and NK cells, is associated with tumorigenesis and tumor progression in cancers. However, the role of IL-22 in chemoresistance has not been investigated. We found that IL-22 levels in tumor tissues and peripheral blood were associated with chemoresistance and indicate poor prognosis for patients who received FOLFOX chemotherapy. In CRC cells, IL-22 was able to attenuate the cytotoxic and apoptosis-inducing effects of 5-FU and OXA by activating the STAT3 pathway and subsequently increasing the expression of anti-apoptotic genes. In addition, IL-22 conferred resistance to 5-FU and OXA by inducing IL-8 autocrine expression through STAT3 activation. Our findings identify IL-22 as a novel chemoresistance cytokine and may be a useful prognostic biomarker for CRC patients receiving FOLFOX chemotherapy.     

晚期糖化终产物受体反义 RNA 腺相关病毒载体的构建及在肾脏系膜细胞中表达

目的 构建晚期糖化终产物受体(RAGE)反义RNA腺相关病毒载体,并在大鼠肾脏系膜细胞中表达. 方法 构建腺相关病毒介导的RAGE反义RNA载体,3个质粒共转染293细胞,获得病毒原液,感染大鼠肾脏系膜细胞,流式细胞术、RT-PCR、ELISA检测重组病毒感染的细胞RAGE的表达和分泌细胞外基质的情况.结果 经酶切鉴定、序列分析显示RAGE基因片段正确完整反向插入pAAV-MCS.利用293细胞包装获得病毒原液的滴度为8.7×107VP/mL.感染重组病毒的细胞与正常细胞比较RAGE表达被抑制(48.2±6.1)%,分泌Ⅳ型胶原(ColⅣ)水平明显下降(P＜0.05).结论 成功构建具有抑制功能的RAGE反义RNA腺相关病毒载体,为进一步研究RAGE的作用机制,以及基因治疗RAGE相关疾病提供一个重要工具.     

STAT3介导了血小板源性生长因子BB诱导的大鼠血管平滑肌细胞Pim-1表达

 目的： 观察血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)是否可以诱导大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs）表达Pim-1及Pim-1对VSMCs增殖的影响,探讨STAT3信号分子在这一过程中的作用,为血管重建性疾病（VRD）的研究提供实验依据。方法： 不同浓度PDGF-BB作用不同时间刺激体外培养的VSMCs,用细胞计数法检测增殖;用real-time RT-PCR 检测Pim-1 mRNA表达水平;Western blotting 检测STAT3 的活性变化;用放线菌素D（actinomycin D）、AG490（JAK特异性抑制剂）及siRNA沉默Pim-1和STAT3进行干预。结果： PDGF-BB（20 μg/L）作用VSMCs 24 h,可以诱导细胞增殖,Pim-1沉默抑制了这一过程;正常未经处理的VSMCs Pim-1 mRNA表达量较低,不同浓度PDGF-BB（10 μg/L~50 μg/L ）作用VSMCs 1 h,Pim-1 mRNA表达明显增加,其中以20 μg/L最显著;用PDGF-BB（20 μg/L）作用VSMCs 不同时间（0.5 h~4 h）,可显著上调Pim-1 mRNA表达,以0.5 h最显著。用actinomycin D及AG490预处理后Pim-1 mRNA表达随之降低。PDGF-BB可激活VSMCs中磷酸化STAT3水平,AG490和转染STAT3-siRNA可抑制 STAT3的磷酸化以及相应的Pim-1 mRNA表达。结论： PDGF-BB可通过Pim-1调节VSMCs增殖;STAT3可能参与了PDGF-BB诱导的VSMCs Pim-1表达。     

STAT3ER慢病毒表达载体的构建及体外对神经元再生作用的研究

目的构建携带信号转导和转录激活蛋白STAT3和基因突变的雌激素受体ER的慢病毒载体,并转染受损的大鼠背根神经节神经元,研究其对神经元突起再生的作用。方法运用基因重组技术,将STAT3、ER和核糖体介导的绿色荧光蛋白(IRES-GFP)片段插入慢病毒载体pRRL-MCS+的PmeI位点构建慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP,经RT-PCR、Western blotting和测序分析加以鉴定其正确性。将慢病毒载体3质粒细胞包装系统(主体质粒pRRL-STAT3ER-IRES-GFP、包装质粒pCMVdeltaR8.74和包膜质粒VSV-G)共转染293T细胞,包装慢病毒载体并测定滴度。切断大鼠左L5近神经节的神经根,摘取L5背根神经节做分离神经元培养,将pRRL-STAT3ER-IRES-GFP感染神经元细胞并观察神经元细胞核转运和突起的长度。结果构建的慢病毒载体pRRL-STAT3ER-IRES-GFP经RT-PCR和Western blotting鉴定正确,测序分析与Genbank报道的STAT3基因序列完全一致。3质粒共转染293T细胞后,测定慢病毒滴度为1010-11TU/ml。转染pRRL-STAT3ER-IRES-GFP的神经元经4-羟基三苯氧胺(4HT)激活,STAT3ER有明显的核转运,并增强突起的生长,经χ2检验与对照组有显著性差异。结论成功构建了表达小鼠STAT3ER基因的慢病毒载体并证实STAT3信号转导有利于轴突生长。     

RNA干扰对肝癌细胞株SMMC7721中STAT3基因表达的抑制作用

目的:研究小片段干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞系SMMC7721的化疗敏感性.方法:根据信号转录及转录活化因子3(STAT3)基因设计siRNA序列,通过经脂质体LipofectamineTM2000以siRNA转染SMMC7721细胞.用实时定量PCR检测SMMC7721细胞中STAT3基因表达的抑制.将细胞以10 μmol/L 5-氟脲嘧啶(5-Fu)作用后,用MTT比色法检测细胞生长的抑制率.结果:成功地构建针对STAT3基因的siRNA表达载体.实时定量PCR检测结果显示,SMMC7721细胞经特异性siRNA转染后,STAT3基因的表达受到抑制.RNA干扰(RNAi)能特异、有效地抑制SMMC7721细胞中STAT3基因的表达.MTT比色法检测结果显示,经siRNA作用后SMMC7721细胞抑制率明显增加.结论:设计合成的siRNA表达载体能有效抑制STAT3基因在肝癌细胞系SMMC7721中表达,增强其对化疗药物5-FU的敏感性,为肿瘤的生物学治疗提供了实验依据.     

ＩＬ—６在Ｕ９３７细胞中特异、持续激活ＳＴＡＴ３

目的 探讨ＩＬ－６在Ｕ９３７细胞中产生生物学效应的信号转导基础。方法 检测ＩＬ－６对Ｕ９３７细胞生长与分化的影响。并采用凝胶阻滞电泳法,检测ＩＬ－６在Ｕ９３７细胞中激活核因子的情况。结果 ＩＬ－６可诱导Ｕ９３７细胞向巨噬细胞方向分化。分化的细胞酸性醋酸酯酶（ＡＮＡＥ）活性、硝基蓝四唑（ＮＢＴ）还原能力及ＣＤ５４表达增强,ＳＴＡＴ３可被ＩＬ－６显著激活,其活性呈一定的剂量与时间依赖性;而ＮＦ－ＩＬ６、ＮＦ－kB、ＡＰ－１及其它ＳＴＡＴ家族成员则无明显激活。结论 Ｕ９３７细胞的终分化可能是ＪＡＫ－ＳＴＡＴ３通路介导的。     

靶向MR-1基因shRNA表达载体的构建及其对白血病K562细胞增殖的抑制作用

目的 构建一种靶向MR-1基因的shRNA稳定表达载体,并检验其对白血病K562细胞增殖能力的影响.方法 以带有H1启动子可稳定表达靶基因shRNA的pCD-shRNA为载体,采用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切pCD-shRNA并回收线性空载体,采用T4 DNA连接酶将MR-1shRNA模板DNA双链与酶切后线性化的载体连接,从而建立稳定表达MR-1-shRNA的载体.将构建的pCD-shRNA-MR-1载体转染人白血病K562细胞,建立稳定沉默MR-1的细胞系,采用细胞计数法和westem blot对MR-1沉默后细胞的增殖能力和信号通路进行检测分析.结果 成功构建了可稳定表达MR-1-shRNA的载体pCD-shRNA-MR-1,经酶切鉴定及基因测序测定,结果表明载体中的MR-1-shRNA与设计序列完全相符,目的基因序列准确无误.将pCD-shRNA-MR-1转染白血病K562细胞,建立了两株稳定沉默MR-1的K562/MR-1细胞株.细胞增殖实验表明,MR-1稳定沉默细胞的增殖能力显著降低;细胞信号通路结果表明,MR-1稳定沉默细胞Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平降低.结论 利用pCD-shRNA质粒构建了一个可表达MR-1-shRNA的表达载体,该载体转染K562细胞后引起细胞增殖能力降低.研究表明MR-1基因在肿瘤细胞增殖过程具有促增殖作用,其机制是降低Jak2和Bcr-Abl的磷酸化水平.