抗重组志贺毒素ⅡB亚基单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

目的 制备出高效价的抗重组志贺毒素ⅡB亚基(rStx2B)单克隆抗体.方法 以融合蛋白EspA-Stx2B作为抗原,免疫Balb/c小鼠,以未免疫的Balb/c小鼠脾细胞为饲养细胞;运用细胞杂交瘤技术制备,运用间接ELISA法筛选产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株;体内诱生法产生腹水,饱和硫酸铵沉淀法初步纯化,再采用HiTrap rProtein A柱进一步纯化,快速定性试纸鉴定McAb的Ig亚型,采用间接ELISA法相加实验鉴定抗原识别表位.结果 获得3株产生针对rStx2B的单克隆抗体细胞株Stx2B-1H9、Stx2B-1H10、Stx2B-3E5,Ig亚型分别为IgG1κ型,IgG2aκ型,IgG2bκ型,亲和力常数分别为7.36×108、6.94×108、5.85×108.结论 成功制备3株稳定分泌抗rStx2B的杂交瘤细胞株,产生的McAb特异性好,亲和力高,为应用这些单克隆抗体建立免疫亲和层析法纯化天然志贺毒素Ⅱ,鉴定Stx2B的表位,研究针对EHEC O157:H7感染的治疗性抗体奠定了基础.     

抗艰难梭菌A毒素单克隆抗体的制备及特性分析

目的 :制备抗艰难梭菌A毒素的单克隆抗体 (mAb)并鉴定其特性。方法 :用纯化的艰难梭菌A毒素免疫BALB/c小鼠 ,将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2 / 0融合 ,采用间接ELISA筛选杂交瘤细胞。用ELISA检测mAb腹水的效价、相对亲和力和进行表位分析 ;用Westernblot检测mAb的特异性。结果 :得到 6株杂交瘤细胞株 ,5C10株细胞分泌的mAb为IgG2a ,4B5和 8A1株细胞分泌的mAb为IgG1,其他 3株细胞mAb (2H7、3E9和 6G8)均分泌IgM。中和试验表明 ,所有的mAb均无中和活性。腹水mAb的效价均在 10 -4以上 ,其中mAb 2H7、6G8、5C10、4B5和 8A1具有共同的表位 ,而mAb 3E9识别的位点与其他 5株不同。mAb 8A1和 4B5的相对亲和力>10 5,其他 4株mAb的相对亲和力 >10 4。在非变性条件下 ,PAGE后Westernblot的结果显示 ,6株mAb均可与相对分子质量 (Mr)为 5 5× 10 4的A毒素产生反应 ;而在变性条件下 ,还原与非还原SDS PAGE后Westernblot均显示 ,6株mAb均可与Mr 为 5× 10 4～ 2 4× 10 4的A毒素产生反应。结论 :6株杂交瘤细胞株均能分泌抗艰难梭菌A毒素的特异性mAb ,为艰难梭菌A毒素的研究提供了有利的工具     

百日咳毒素S1亚单位缺失分子的构建及其在重组杆状病毒中的 …

目的：为探明羧基端疏水区对百日咳毒素Ｓ１亚单位分泌性的影响,试图构建缺失羧基端疏水区的Ｓ１亚单位。方法：应用ＰＣＲ技术构建了６种不同信号序列修饰的缺失羧基端疏水区的Ｓ１亚单位编码基因,并使用重组杆状病毒技术实现了这些缺失Ｓ１亚单位在昆虫细胞中的高水平表达。结果：这些缺失Ｓ１亚单位的表达量为每万个昆虫细胞１．０１－２．２５μｇ。     

抗人IgD单克隆抗体的制备及其特性鉴定

本文采用Ultrogel AcA34凝胶过滤,DEAE离子交换及亲和层析法,从骨髓瘤病人血清中分离高纯度的IgG,以此为抗原免疫小鼠,利用常规杂交瘤技术制备了3株分泌抗人IgD单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为ZD2、ZD61和ZD94,此3株杂交瘤细胞分泌的抗体与IgD有特异性反应,而与人其它类别的免疫球蛋白重、轻链无交叉反应,均属IgG1亚类。免疫转印结果显示,均能识别分子量为67kD的IgD重链条带。用ELISA法测定3株抗体分别识别两种不同的抗原决定簇。     

鼠抗人c-Kit单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:鼠抗人c-Kit单克隆抗体(mAb)的研制及其生物学特性的鉴定.方法:利用PCR技术获得人c-Kit的胞外免疫球蛋白区编码序列, 并将其亚克隆至原核表达载体pQE30, 构建出重组表达质粒pQE30-hKitD4-5.测序鉴定正确后转化M15, 经IPTG37℃诱导4 h后, SDS-PAGE显示融合蛋白(表达产物)以包涵体形式存在.用镍柱对融合蛋白进行纯化, 将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合, 经流式细胞术(FCM)分析和多次克隆化培养, 筛选出特异分泌鼠抗人c-Kit分子mAb的杂交瘤细胞株.采用Western blot、 Ig亚型快速定性试纸法、 FCM等对mAb的生物学特性进行鉴定.结果:成功表达及纯化了人c-Kit重组蛋白, 并获得1株持续、稳定分泌鼠抗人c-Kit mAb的杂交瘤细胞株, 命名为SRJ1.ELISA和Western blot、 FCM结果显示了该株mAb 能够识别Kasumi白血病细胞株表面表达的天然的c-Kit分子, 并与人正常外周血细胞无交叉反应.值得注意的是, Kasumi细胞含有一个不被SRJ1识别的亚群, 虽然其表达c-Kit(Ab81 mAb的结合正常).结论:成功构建了原核表达载体pQE30-Kit4-5, 并获得高纯度的人pQE30-Kit4-5重组蛋白;成功制备了1株特异性的鼠抗人c-Kit mAb杂交瘤.其所分泌的抗体能特异地识别人c-Kit分子, 并且可能成为区分细胞表面表达不同c-Kit分子的潜在检测工具.     

抗人肺鳞癌单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备和鉴定抗人肺鳞癌单克隆抗体(mAb),为肺癌的早期诊断和靶向治疗提供候选抗体药物及为肺癌抗原的筛选提供工具。方法:用肺癌细胞株YTMLC-90做抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,间接ELISA和有限稀释法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞获得mAb。染色体计数法鉴定杂交瘤细胞,并进行mAb同种型鉴定;对细胞培养上清液和腹水中的mAb采用间接ELISA法进行初步特异性检测及效价测定;采用Western blot法鉴定其与不同组织抗原结合活性;采用免疫组化染色法鉴定其在肺癌组织中的分布。结果:筛选出5株可稳定分泌抗肺鳞癌mAb的杂交瘤细胞株E2、F9、E11、D5和C6,分泌的抗体均为IgG1亚类,κ亚型。C6染色体数目为89～112条,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶1 004和1∶104,ELSA和Western blot结果显示其能特异性与肺癌细胞结合,未见与其他高发癌组织和正常组织结合。结论:成功地制备了能够特异识别肺癌组织的mAb。     

百日咳毒素S1亚单位的分子修饰及在重组杆状病毒中的表达

目的：百日咳毒素既是百日咳杆菌的主要毒性因子,又是重要的保护性抗原,其Ｓ１亚单位具有ＡＤＰ－核糖转移酶活性和免疫保护性决定簇。为高效表达前构建的一个丧失酶活性但仍保持保护决定簇的Ｓ１变异子,开展了本研究。方法：通过添加人流感病毒血凝素基因信号序列或嵌膜序列的方法,对天然和变异Ｓ１亚单位基因片段作了遗传学修饰。然后使用重组杆状病毒技术使这些Ｓ１亚单位在昆虫细胞和昆虫幼虫中实现了高水平表达。结果：这些     

抗G－CSF单克隆抗体的制备及其特性鉴定

抗Ｇ－ＣＳＦ单克隆抗体的制备及其特性鉴定上海第二医科大学附属瑞金医院，上海血液学研究所细胞生物学研究室（上海２０００２５）吴文，姜国胜，周荣富，邬维礼，曹伟丽，孙关林粒系集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）是一种能在祖细胞和成熟细胞不同水平上促进中性粒细胞生成...     

百日咳毒素S1亚单位缺失分子的构建及其在重组杆状病毒中的表达

目的：为探明校基端疏水区对百日咳毒素Ｓ１亚单位分泌性的影响,试图构建缺失羧基端疏水区的Ｓ１亚单位。方法：应用ＰＣＲ技术构建了６种不同信号序列修饰的缺失羧基端疏水区的Ｓ１亚单位编码基因,并使用重组杆状病毒（ｒＢＶ）技术实现了这些缺失Ｓ１亚单位（ｔＳ１）在昆虫细胞中的高水平表达。结果：这些缺失Ｓ１亚单位的表达量为每万个昆虫细胞１．０１～２．２５ｕｇ。细菌信号肽和流感病毒ＨＡ信号肽均能完整表达和正确剪切,但ＨＡ信号肽在昆虫细胞中的处理效率更高。结论：ｔＳ１亚单位缺失羧基端疏水区后在昆虫细胞中的表达量明显提高,这些ｔＳ１亚单位的异源性表达是由于信号肽剪切不全所导致,ｔＳ１分子表观分子量的漂移并不意味着信号肽剪切不正确。     

抗OmpW单克隆抗体的制备与特性鉴定

目的:制备抗副溶血弧菌OmpW的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法:利用生物信息学方法分析多种病原弧菌的OmpW氨基酸序列,原核表达并纯化制备r-OmpW.以r-OmpW作为免疫抗原制备鼠mAb,以五种病原弧菌为筛选抗原.采用Western blot、流式细胞术(FCM)、间接ELISA法鉴定mAb的特性.结果:生物信息学分析表明OmpW是弧菌内高度保守的外膜蛋白.成功筛选到3株杂交瘤细胞株,其中,杂交瘤细胞株S5C10分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG3,腹水mAb效价达4.6×104.该mAb同时识别副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌,而与荧光假单胞菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌及大肠杆菌无明显的交叉反应.结论:制备的mAb可特异性识别上述5种病原弧菌,为进一步建立广谱弧菌的免疫学检测方法提供了工具.     

抗百日咳毒素单克隆抗体对小白鼠的保护活性

在瑞典用百日咳类毒素现场调查和实验室小白鼠保护试验均证明作为百日咳疫苗保护性抗原之一的百日咳毒素(PT)的重要性。PT具有许多不同的生物学活性和毒性,这是由其复杂的六聚体结构所造成的。PT由5种依次命名为S1至S5的亚单位组成。其毒性被认为是由具有ADP-核糖基转移酶活性的A始基,即S1,与具有结合活性的B寡基协同产生的。B寡基由一个S5和两个二聚体S2/S4及S3/S4组成。     

CD24分子调节百日咳毒素诱导小鼠急性肝损伤的实验研究

目的:探讨CD24分子对百日咳毒素诱导急性肝损伤的影响及其可能的分子机制。方法:建立百日咳毒素诱导小鼠急性肝损伤的实验模型,观察anti-CD24中和抗体(200μg/mouse)和百日咳毒素(200 ng/mouse)联合注射组小鼠的生存率,H&E染色观察小鼠肝组织损伤,血清化学方法检测小鼠谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)等肝功能的生化指标,ELISA方法检测小鼠血清中TNFα-的含量,流式细胞仪分析anti-CD24中和抗体对百日咳毒素诱导小鼠kupffer细胞(存在于肝脏中的巨噬细胞,KC)凋亡率的影响。结果:一定剂量的anti-CD24中和抗体和百日咳毒素联合注射组(实验组)生存率显著低于对照组;H&E染色观察实验组小鼠肝出血程度明显高于对照组,实验组小鼠ALT、AST等肝功能生化指标显著高于对照组(P<0.05);ELISA检测实验组小鼠血清中TNFα-明显升高(P<0.05);流式细胞术分析表明:anti-CD24中和抗体导致小鼠kupffer细胞坏死百分数增加。结论:CD24分子抑制百日咳毒素诱导的小鼠急性肝损伤。     

抗志贺样毒素Ⅱ型变异体单克隆抗体的制备及特性鉴定

志贺样毒素Ⅱ变异体(SLT-Ⅱe)是猪水肿病的主要致病因子之一,为了制备SLT-Ⅱe单克隆抗体(mAb),我们从TB1菌中用多粘菌素诱导提取了SLT-Ⅱe蛋白,并且用硫酸铵盐析沉淀法对该蛋白进行了提纯,以提纯蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞技术制备mAb。细胞融合后,培养上清经间接ELISA检测,共得到3株阳性杂交瘤细胞2E11、2H9和4F3,ELISA效价分别为1∶213、1∶213和1∶28,3株杂交瘤细胞培养上清分泌的mAb在Westernblot试验中均与提纯的毒素蛋白反应,在Vero细胞中和试验中均能够中和毒素对Vero细胞的毒性作用,从而为临床分离株SLT-Ⅱe产生的免疫学检测方法奠定了一定的基础。     

抗呕吐毒素多克隆抗体的制备、纯化及鉴定

目的:制备呕吐毒素(DON)的多克隆抗体,并对抗体效价、特异性和抑制率进行鉴定。方法:采用EDC法合成了呕吐毒素的完全抗原DON-BSA,并通过免疫新西兰大白兔,得到呕吐毒素的多克隆抗体。结果:ELISA检测出多抗中含有呕吐毒素的特异性抗体,其效价最高为12800,其抑制率为50%时,DON的浓度为10mg/L,DON的最低检测浓度为0.1mg/L。与结构类似物T-2毒素和NIV的交叉率分别为9.1%和4.9%。结论:呕吐毒素经过衍生化后制备出完全抗原,经免疫新西兰大白兔后得到的多克隆抗体可以完全满足ELISA检测的需要。     

抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及鉴定

α毒素是A型产气荚膜梭菌所致严重创伤性气性坏疽的主要致死因素,至今尚无有效的防治方法,使用抗生素和多价抗毒素效果不明显t‘J。为此,我们采用细胞融合技术,制备了抗a毒素的单克隆抗体（InAb）,为治疗气性坏疽患者的a毒素中毒提供可能性。互材料和方法1．l抗原和细胞a毒素抗原系重组菌株BLZI（DE3）（PXlryAI）的表达产物,按照表达系统十ET－28b（＋）的操作手册进行提取。SpZ／0骨ff＄细胞,由本室保存。且．2实验动物6周一百周龄＊alb／C小鼠,由卫生部长春生物制品研究所提供。互．3抗a霉素mAb的制备动物免疫、细胞融合…