羊传染性脓疱病毒抗干扰素基因(VIR)研究进展

羊传染性脓疱病毒(ORFV)是痘病毒科副痘病毒属的成员之一,引起严重的人兽共患传染病。该病毒基因组全长约134~139 kb,编码130多个蛋白,抗干扰素基因是ORFV编码的具有拮抗宿主干扰素功能的蛋白,在ORFV突破宿主免疫屏障过程中有重要作用。本文就抗干扰素基因的研究进展作一综述。     

羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达

目的 为构建羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒,同时验证其在MDBK细胞中的表达。方法 本试验以pVAX1为真核表达载体,在前期构建的克隆质粒pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L基础上,构建真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L,对其分别进行双酶切和测序鉴定,将鉴定正确的真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L转染至MDBK细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测目的基因表达。结果 双酶切鉴定和序列测定表明真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L构建成功,RT-PCR和IFA同时验证目的基因在MDBK细胞浆中能瞬时表达。结论 本试验构建成功的真核表达质粒为下一步羊口疮病毒核酸疫苗研究奠定基础。     

羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达北大核心CSCD

目的为构建羊口疮病毒F1L和B2L基因真核表达质粒,同时验证其在MDBK细胞中的表达。方法本试验以pVAX1为真核表达载体,在前期构建的克隆质粒pMD18-T-B2L和pMD18-T-F1L基础上,构建真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L,对其分别进行双酶切和测序鉴定,将鉴定正确的真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L转染至MDBK细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)检测目的基因表达。结果双酶切鉴定和序列测定表明真核表达质粒pVAX1-F1L和pVAX1-B2L构建成功,RT-PCR和IFA同时验证目的基因在MDBK细胞浆中能瞬时表达。结论本试验构建成功的真核表达质粒为下一步羊口疮病毒核酸疫苗研究奠定基础。     

犬库布病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的建立可检测狐狸物种中犬库布病毒(CaKoV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法。方法利用PCR方法扩增狐狸CaKoV的3D基因504bp,将其克隆到pEASY-Blunt载体,构建重组质粒作为阳性质粒,以其为模板建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,验证其灵敏度、特异性和重复性。结果建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法检测目的基因在6.12×10^(1)~6.12×10^(8)拷贝/μl时呈良好的线性关系,相关系数为0.994,斜率为-4.369,灵敏度6.12×10^(1)拷贝/μl。该方法对于CPV、CDV和CCV未出现特异性扩增。所有标准曲线在溶解温度为86.49℃时出现单一的特异峰。使用本方法检测2021年辽宁、山东地区的253份狐狸临床标本,总阳性率为7.91%。结论建立的CaKoV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异,用于狐狸CaKoV感染的快速检测。     

羊口疮病毒B2L基因DNA疫苗载体的构建及其在BHK-21细胞中的表达

目的 为构建羊传染性脓疱病毒(ORFV)B2L基因真核表达质粒并验证B2L基因在BHK-21细胞中的表达及表达的稳定性。方法 以ORFV主要免疫原性基因B2L为目标,以pVAX1为表达载体,构建重组真核表达质粒pVAX1-B2L,鉴定正确后转染仓鼠肾细胞(BHK-21),通过间接免疫荧光试验(IFA)验证B2L基因表达。结果 扩增出目的片段经序列测定和分析证明为ORFV B2L基因,经双酶切鉴定和序列测定分析证明了pVAX1-B2L质粒的正确性,IFA证实目的基因在BHK-21细胞中能够瞬时表达。结论 为进一步研制基于羊口疮病毒B2L基因的DNA疫苗奠定了基础。     

猪逆转录病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立及应用北大核心CSCD

目的开发一种能够准确、灵敏、特异检测猪逆转录病毒(PERV)的荧光定量PCR方法。方法根据GenBank数据库中PERV Gag基因的高度保守序列,设计1对特异性引物,建立用于检测PERV的SYBR GreenⅠqPCR检测方法,并验证其灵敏性、重复性和特异性。结果建立的标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数R^(2)=0.998。该方法检测PERV下限为2.04×10^(2)copies/μl,批内批间变异程度较低,变异系数小于2%,且与PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和SVA等均无交叉反应。利用该qPCR方法对采集的49份猪组织样品进行检测,阳性率为81.63%,高于普通PCR阳性检出率的73.47%。结论建立的快速、定量检测PERV的SYBR Green I qPCR方法敏感、特异,具有一定的应用前景。     

SYBR Green I荧光定量PCR检测HIV-1前病毒方法的建立及应用

目的 建立SYBR Green I荧光定量PCR技术测定HIV-1前病毒载量方法,并以其观察相关病毒进入抑制剂对HIV-1前病毒的作用.方法 选择HIV-1的gag和env保守区域设计引物,建立SYBR Green I荧光定量PCR测定HIV-1前病毒载量的体系,并以其观察6 μg/ml～6 ng/ml的重组病毒巨噬细胞炎症蛋白（rvMIP）、逆转录酶抑制剂（AZT）、膜融合抑制剂（T-20）、rvMIP＋AZT、rvMIP＋T-20对HIV-1前病毒载量的影响.结果 所建立的荧光定量PCR体系的检测下限为101 Copies,其标准曲线的相关系数为0.998 9,斜率为-4.925,截距为35.70;除6 ng/ml的 rvMIP、AZT、T-20外,三种药物处理后HIV-1前病毒载量均显著减小（P〈0.05）,并呈质量浓度依赖性;联合用药者前病毒载量显著低于单用rvMIP者（P〈0.05）,HIV-1前病毒载量rvMIP＋T-20 〈rvMIP＋AZT〈rvMIP〈T-20〈AZT.结论 本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法具有灵敏、快速、准确及成本低廉等优点;与T-20或AZT联用可增强rvMIP对HIV-1前病毒的抑制作用.     

SYBR Green荧光PCR检测美洲钩虫方法的建立

目的建立荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法。方法提取虫体基因组DNA、根据GenBank中美洲钩虫ITS 2序列设计特异引物,PCR扩增ITS 2序列、克隆、测序和比对。常规PCR检验引物特异性。将ITS 2序列扩增产物回收、纯化后经T克隆转入大肠埃希菌DH5α,提取重组质粒,鉴定后作为标准品模板建立荧光定量PCR标准曲线,并做灵敏性和重复性试验。结果构建的荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线的吸收峰单一,实验重复性良好。结论成功构建了SYBR Green I荧光定量PCR检测美洲钩虫的方法,可用于快速、准确、定量检测美洲钩虫。     

羊口疮病毒E3L蛋白亚细胞定位及生物信息学分析北大核心CSCD

目的 克隆羊口疮病毒020基因,构建其重组真核表达质粒并转染HeLa细胞,分析020基因编码E3L蛋白的亚细胞定位,分析该蛋白生物信息学特征。方法 提取羊口疮病毒基因组,PCR扩增020基因并构建重组真核表达质粒,转染HeLa细胞,采用Western blot检测其在该细胞中的表达,免疫荧光法检测该蛋白的亚细胞定位。利用DNAstar软件分析不同毒株ORFV E3L氨基酸序列特点及其遗传演化关系;利用SOMPA软件分析其二级结构;利用SignalP4.0软件预测信号肽;利用TMHMM2.0软件预测跨膜结构;利用NetPhos 3.1预测磷酸化位点;利用NetNGlyc-1.0预测糖基化位点;应用IDEB和SYFPEITHI预测ORFV E3L蛋白的抗原表位。结果 成功克隆得到ORFV 020基因,全长549 bp,编码183个氨基酸;亚细胞定位显示该蛋白定位于细胞核和细胞质。生物信息学分析ORFV E3L蛋白α螺旋约占40.44%、β折叠约占5.46%、延伸链约占16.94%、无规则卷曲约占37.16%;该蛋白无信号肽和跨膜结构,可能存在15个磷酸化位点,7个N-糖基化位点,5个B细胞线性表位,2个CTL表位,3个Th细胞表位,3个B细胞和CTL联合表位,3个B细胞和Th细胞联合表位。结论 ORFV E3L蛋白定位于细胞核和细胞质,含有多个抗原表位,可能具有免疫原性。该蛋白高度保守,具有成为优势保护性抗原的潜力。为进一步揭示ORFV E3L蛋白的功能奠定基础,为ORFV诊断方法的建立及疫苗的研制提供了理论依据。     

人POT1基因实时荧光PCR相对定量法的建立

目的：建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人POT1基因的方法。方法：依据人POT1基因及参照基因TBP基因序列设计引物,以人类乳腺癌细胞系MCF-7总RNA逆转录合成的cDNA为模版,以TBP基因为参照基因,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测POT1基因的表达。结果：POT1和TBP基因熔解曲线为单峰,无杂峰及二聚体。POT1基因及参照基因TBP基因扩增效率相同（直线斜率0．0171〈0．1）。POT1基因批内变异与批间变异分别为1.3％和2.1％;TBP基因批内变异与批间变异分别为1．2％和2．6％。结论：建立了SYBR Green Ⅰ实时定量检测人类POT1基因的方法,该方法简单快速,经济,灵敏度高,特异性和重复性好,可用于人类POT1基因的定量分析。     

SYBR GreenⅠ实时PCR检测甲型H1N1与季节性流感病毒方法的建立

目的：建立一种检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法。方法：设计针对甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒HA基因的引物,分别进行SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应,同时进行熔解曲线和Tm值分析,并作灵敏度和重复性试验。 结果：结果表明该方法与H5、H7、H9亚型流感病毒及副流感病毒1、2、3型均无交叉反应。构建的荧光定量标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为：95.588%,检测灵敏度为101copies/反应体系,结果重现性好。成功地验证性检验了32份盲样标本。结论：本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法敏感、不需荧光标记探针、成本低及高通量,能用于人类流感病毒的分型检测。     

基于SYBR Green检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立一种方便快捷的检测微小隐孢子虫的实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法。方法根据GenBank公布的微小隐孢子虫18s rRNA基因序列设计1对引物,通过质粒DNA和卵囊检测标准曲线的绘制及特异性和重复性的研究,建立检测微小隐孢子虫的基于SYBR Green的Real-time PCR方法,进而对奶牛粪便进行检测。结果建立的Real-time PCR法对检测微小隐孢子虫具有很高的特异性,质粒DNA和卵囊的检测阈值分别达到1个拷贝和10个卵囊,奶牛粪便阳性率为25.93%（21/81）,高于普通PCR检测率20.99%（17/80）。结论建立的Real-timePCR方法简便、快速,特异性强,敏感度高,可用于微小隐孢子虫的快速定量检测。     

基因1型狂犬病病毒一步法荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的在我国狂犬病均由基因1型狂犬病病毒（rabies virus,RV）引起。本研究针对RV N基因保守序列设计并合成了一套简并引物和Taqman探针,在优化反应条件的基础上,建立了检测RV核酸的一步法荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）检测方法。方法与结果该方法能特异检测基因1型,不能检测基因2-7型和犬瘟热病毒（CDV）、犬细小病毒（CPV）、犬腺病病毒（CAV）、水泡性口炎病毒（VSV）、日本乙型脑炎病毒（JEV）等5种非狂犬病病原体,其检测灵敏度可达到4.68个TCID50的病毒含量。用该方法对29份新鲜和5份腐败的临床犬脑组织样品进行检测,并与国际金标准确诊方法狂犬病荧光抗体染色法（FAT）和乳鼠脑内接种试验（MIT）及本实验室建立的套式RT-PCR方法进行比较。结果表明所建立的qRT-PCR与套式RT-PCR的符合率为100%,二者均检测出12份阳性的新鲜样品和5份阳性的腐败样品,而FAT只检测出12份阳性的新鲜样品和1份阳性的腐败样品,MIT只检测出12份阳性,未检测出阳性腐败样品。检测中FAT和MIT确诊的所有阳性样品在qRT-PCR检测均是阳性,而在FAT检测为阴性的4份腐败样品在qRT-PCR为阳性,说明所建立的qRT-PCR方法准确性达到了FAT和MIT的水平,而且灵敏度更高,更适合于腐败样品的检测。结论研究结果表明该qRT-PCR方法特异性好、灵敏度高、污染率低、操作简单,在我国动物狂犬病临床诊断上具有巨大的应用价值。     

实时荧光定量PCR检测GI型诺瓦克样病毒方法的建立

目的建立临床粪便中GI型诺瓦克样病毒的实时荧光定量PCR检测方法。方法针对诺瓦克样病毒GI型保守序列,用序列比对软件设计特异性引物与探针,建立诺瓦克样病毒实时荧光定量PCR检测方法。并用常规RT-PCR和本文建立的实时荧光定量PCR对137份临床腹泻标本进行检测。结果该方法对诺瓦克样病毒检测准确,重复性好,标准曲线的线性范围为102～107拷贝,相关系数为0.9991。并且对临床标本的检出率显著高于普通RT-PCR。结论本研究建立的实时荧光定量PCR方法可用于检测临床腹泻粪便标本中的GI型诺瓦克样病毒,从而有效预防和控制该病毒的传染。     

新疆羊狂犬病病毒的鉴定及N基因序列分析

目的 诊断疑似羊狂犬病病例并分析其病原分子N基因遗传进化关系.方法 采集新疆阿勒泰地区疑似狂犬病羊脑组织,以狂犬病病毒特异性目的基因（N基因）RT-PCR扩增和序列测定进行病毒鉴定;以DNAStar-Lasergene.v7.1软件拼接测定序列,应用BLAST软件分析N基因的遗传进化关系.结果 显示本研究鉴定的狂犬病毒阳性并获得了病毒全基因序列,建立了其N基因的遗传进化关系树,确定疑似的羊狂犬病病毒与狂犬病病毒基因I型俄罗斯C群的遗传关系较近.结论 应用RT-PCR方法对羊源狂犬病进行实验室诊断,获得该病原全基因序列,明确了新疆狂犬病病原和流行地域分布,为羊狂犬病毒分子流行病学研究奠定基础.     

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法.方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性.结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101～108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%.熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃.结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法.     

荧光定量聚合酶链反应检测输血传播病毒方法的建立及应用

[目的]建立输血传播病毒(transfusion transmitted virus,TTV)荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测方法,为快速、准确地定量检测TTV奠定基础.[方法]根据TTV ORF2区基因序列,设计并合成引物和荧光标记探针.将PCR扩增的TTV的ORF2区基因片段克隆入载体,重组质粒经筛选、鉴定后,作为阳性模板,用于标准曲线的制定和样品检测.[结果]应用重组质粒制作的定量曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系.与定量对照曲线比较计算,10例TTV标本中TTV拷贝数为3.8×105～8.9×1O8拷贝/μl.[结论]检测TTV的FQ-PCR方法较常规PCR技术更为简便、快速、准确,有很好的应用前景和研究价值.     

猪嵴病毒 SYBRⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究根据GenBank中登录猪嵴病毒（porcine kobuvirus,PKV）株的3D蛋白序列基因特征,设计特异性引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测PKV的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法检测PKV 3D蛋白在6.42×102 ~ 6.42×108拷贝/反应范围内有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为100%,扩增产物的融解曲线分析只出现1个单特异峰,融解温度为（84.94±0.24）℃,对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,特异性强。所建立实时荧光定量RT-PCR方法组内变异系数为0.26%~1.14%,组间变异系数0.63%~1.79%,重复性好。本方法的建立为PKV的早期诊断及定量分析PKV感染程度和靶器官提供新的检测方法。     

异基因造血干细胞移植后巨细胞病毒感染的发病情况及疗效分析

目的：探讨异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后,巨细胞病毒（CMV）感染的发病情况及抗病毒治疗的疗效。方法：对在我所接受allo-HSCT的患者23例进行回顾性分析,均应用荧光定量PCR法（FQ-PCR法）检测外周血CMV-DNA含量。CMV感染应用更昔洛韦（GCV）10mg.kg-1.d-1进行治疗。结果：23例患者中7例移植后发生CMV感染,占30.43%。GCV治疗的总有效率约为85.71%。6例在GCV治疗过程中出现白细胞和血小板减少。结论：FQ-PCR法可以应用于allo-HSCT后早期准确诊断CMV感染。GCV对allo-HSCT后CMV感染的预防及治疗效果可靠。     

PCR-反向点杂交基因分型与实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒的研究

目的评价PCR-反向点杂交基因分型与实时荧光定量PCR在检测人乳头瘤病毒(HPV)的意义。方法同时采用PCR-反向点杂交基因分型和实时荧光定量PCR对121例女性宫颈脱离细胞标本进行HPV检测。其中PCR-反向点杂交基因分型能检测23种HPV亚型,实时荧光定量PCR定量检测常见的13种高危HPV亚型。结果 PCR-反向点杂交基因分型检测HPV的阳性率为28.10%(34/121),实时荧光定量PCR检测HPV的阳性率为16.53%(20/121),差异有统计学意义(P<0.05);二者检测的符合率为93.39%(113/121)。结论 PCR-反向杂交基因分型适用于HPV感染的筛查,而实时荧光定量PCR适用于HPV感染相关疾病的疗效与预后的判断。PCR-反向杂交基因分型与实时荧光定量PCR联合检测可提高HPV检测的特异性和敏感度,对于生殖道HPV感染以及子宫颈癌的早期发现、预防和治疗具有重要意义。