螺旋体传染病

莱姆病关节炎的循证治疗；西部大开发中环境改变对莱姆病传播的影响；肺钩端螺旋体病的X线分析；赖型钩端螺旋体OmpA膜蛋白Loa22基因的克隆分析及蛋白表达；一新型钩端螺旋体的毒力研究；[编按]     

贝氏柯克斯体感染小鼠血清与其毒力相关蛋白的免疫印迹反应

目的筛选与贝氏柯克斯体感染血清反应的贝氏柯克斯体毒力相关蛋白。方法以贝氏柯克斯体标准株九里株为模板,采用PCR扩增包括IV型分泌系统、分泌性蛋白和膜蛋白在内的毒力及毒力相关的基因,将扩得目的基因片段与原核表达质粒pET32a重组,将重组质粒转化大肠杆菌,用贝氏柯克斯体实验感染小鼠血清与转化大肠杆菌作免疫印迹。结果设计173对引物共扩增出170个目的基因,经PCR及酶切鉴定,有155个基因与pET32a质粒重组成功,SDS-PAGE电泳分析发现,共有104个转化菌表达目的蛋白,在104个重组蛋白中,筛选到32个与贝氏柯克斯体感染小鼠血清反应的重组蛋白。结论这些与贝氏柯克斯体感染血清反应的毒力相关蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

弓形虫ROP2基因的克隆与鉴定

目的 体外扩增弓形虫棒状体分泌抗原2（ROP2）靶基因，构建真核表达载体pc-DNA3-ROP2。 方法 收集、纯化RH株弓形虫速殖子，提取基因组DNA；根据基因库ROP2基因序列设计合成1对引物，应用PCR扩增ROP2基因片段，回收纯化后克隆入TA载体质粒pUCm-T；用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ双酶切该重组子，将切下的ROP2基因在T4DNA连接酶作用下插入真核细胞表达载体质粒pc-DNA3，并进一步作双酶切、PCR及测序鉴定。 结果 以弓形虫基因组DNA为模板，PCR扩增出1.7 kb ROP2基因片段，克隆于pUCm-T载体中，再将ROP2基因亚克隆于真核表达载体质粒pc-DNA3，经筛选鉴定，构建pc-DNA3-ROP2重组质粒；测序结果显示，重组质粒包含了ROP2蛋白基因读码框内的完整序列，能完整表达ROP2的抗原蛋白。 结论 弓形虫ROP2基因片段，经TA克隆及亚克隆，构建弓形虫pc-DNA3-ROP2重组质粒。     

Sonic hedgehog蛋白N端基因片段毕赤酵母表达载体的构建

目的 构建含Sonic hedgehog(SHH)蛋白N端基因片段的毕赤酵母表达载体.方法 通过BamH 1、Xho 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N基因片段插入pET22b原核表达载体,构建pET22b-SHH-N质粒;经PCR扩增,产物再与pTA2载体连接,构建pTA2-SHH-N重组质粒;经EcoR 1及Not 1双酶切、T4连接酶连接,将SHH-N端基因片段插入pPIC9K质粒,构建pPIC9K-SHH-N重组质粒;通过线性化、脱磷酸化,将线性化pPIC9 K-SHH-N DNA转染毕赤酵母菌株GS115,最后经PCR扩增和测序鉴定.结果 转染的毕赤酵母经PCR扩增和测序证实含有SHH-N基因片段,与原始的基因片段序列完全一致.结论 成功地构建含SHH-N蛋白基因片段的毕赤酵母表达载体.     

弓形虫棒状体蛋白ROP2基因的克隆与表达

目的从弓形虫RH株总DNA中克隆棒状体蛋白ROP2基因片段，克隆至表达载体pET22b中，导入大肠杆菌中表达。方法采用半巢式PCR扩增法从基因组DNA中扩增编码ROP2基因片段，克隆至质粒pUC119中，经PCR和酶切鉴定后，进行DNA序列测定，并以SacⅠ／HindⅢ双酶切克隆至表达载体pET22b上，重组质粒pET22b—ROP2转化大肠杆菌BL21，CodonPlus（DE3）-RIL菌株中，经IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株总DNA中扩增到1．0kb的ROP2基因片段．构建成功重组质粒pUC119，ROP2，经DNA序列分析与已报道序列基本一致，重组质粒pET22b，ROP2在大肠杆菌中表达，产生一分子量约为45kDa的预期重组蛋白。结论克隆到的弓形虫棒状体蛋白ROP2在大肠杆菌中得到表达，构建成功的重组盾粒pUC119-ROP2可用千下一步多基因融合的市隆操作。     

编码弓形虫表面抗原P30、P22复合基因真核表达载体的构建

目的　构建编码弓形虫RH株表面抗原P30、P22复合基因的真核表达重组质粒, 为进一步表达融合蛋白及研制核酸疫苗做准备。　方法　用弓形虫RH株腹腔接种小鼠,收集腹水,酚/氯仿法抽提弓形虫基因组 DNA;用 PCR技术从基因组DNA中扩增编码表面抗原 P30、P22 的基因片段,分别重组入 pMD18 T载体中。将 pMD18 T载体中的P30、P22基因片段分别酶切,定向克隆入 pUC18克隆载体中, pUC18 P30 P22 中的 P30 P22 片段经酶切、纯化后,亚克隆入 pcDNA3.1( )真核表达载体,用酶切、PCR及测序的方法对重组子进行鉴定。　结果　从弓形虫 RH株基因组DNA中扩增出特异的P30及P22片段;大小均与预测值相符;克隆 pUC18 P30 P22 重组质粒的酶切片段分别与 P30、P22基因大小一致;经亚克隆、筛选鉴定获得了 pcDNA3.1 P30 P22重组质粒,所测P30、P22基因序列与文献报道一致。结论　成功构建弓形虫 pUC18 P30 P22重组质粒和 pcDNA3.1 P30 P22 重组质粒,为研制弓形虫 DNA疫苗奠定了基础。     

赖型钩端螺旋体外膜蛋白真核表达载体构建及表达的初步研究

目的　测定所克隆的强毒力赖型钩端螺旋体OmpL1基因的序列 ,构建能够在哺乳动物细胞中表达赖型钩体OmpL1外膜蛋白的重组质粒。 方法　首先对自行构建的含有赖型钩端螺旋体OmpL1基因的重粗质粒 pAC -OmpL1进行插入片段的序列分析 ,然后将该质粒略作修改 ,使更适于在真核细胞中表达目的蛋白 ,同时将OmpL1基因亚克隆入另一个质粒pcDNA3中 ,采用限制性内切酶分析所得质粒的正确性。最后以脂质体转染法将两个重组质粒转入COS7细胞 ,以RT -PCR分析导入质粒的表达。结果　pAC -OmpL1中插入的赖型钩体OmpL1基因全长 96 0bp ,具有完整的阅读框架 ,与流感伤寒型钩体OmpL1基因同源性达 88%。限制性内切酶分析显示 ,质粒pAC -OmpL1的修改已达目的 ,OmpL1基因也按正向插入到pcDNA3中。RT -PCR结果显示 ,重组质粒转染组在约 1kb处出现特异的扩增带 ,而空白质粒载体组无此条带。 结论　赖型钩端螺旋体OmpL1基因与流感伤寒型的高度同源 ,该基因已成功地插入到两个真核表达质粒载体中 ,而且这两个重组质粒均能在哺乳动物细胞中表达OmpL1基因的mRNA     

弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫RH株致密颗粒蛋白GRA4基因。方法 根据GRA4基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应(PCR)方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增GRA4基因片段,插入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌JM109,经PCR、双酶切、测序验证后,将GRA4基因片段定向亚克隆到载体pGEX-4T-2中构建原核表达重组质粒pGEX-4T-2.GRA4,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE及Westem blot分析。结果 从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出GRA4基因片段并诱导表达出能被兔抗弓形虫血清识别的重组GRA4蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pGEX-4T-2-GRA4重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70复合基因真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒。方法根据HSP70基因序列,设计合成HSP70基因的引物,PCR扩增HSP70基因片段,克隆入pMD18-T载体,再经酶切、连接等,亚克隆至pcDNA3-ROP2-p30表达重组质粒中,并进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 PCR扩增出长度为916bp的HSP70基因片段,将其克隆到pMD18-T中,成功亚克隆获得pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒。测序结果显示,pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒包含了HSP70蛋白基因完整序列。结论成功构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒,为下一步核酸疫苗的研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒，分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段，克隆至pMD18-T载体，PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后，目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌．JM109，PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT—PCR扩增出S2特异片段，经测序与GenBank比对存在1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒，并在JM109中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。     

问号钩端螺旋体赖株基因组中一个新溶血基因的表达及功能鉴定

目的对问号钩端螺旋体赖株基因组中LA0202基因进行克隆表达并对重组蛋白的溶血活性进行初步鉴定。方法以问号钩端螺旋体赖株基因组DNA为模板,PCR扩增LA0202基因并重组到原核表达载体pET28b(+),重组质粒经限制性核酸内切酶酶切并经测序鉴定后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达重组蛋白。制备绵羊血平板对表达的重组蛋白进行溶血活性鉴定。RT-PCR检测钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因的转录。结果在大肠埃希菌中成功表达LA0202基因,表达的重组蛋白具有溶血活性。RT-PCR结果显示钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录。结论问号钩端螺旋体赖株体外培养时LA0202基因发生了转录,LA0202可能为一个新的溶血素基因。     

问号钩端螺旋体fliN基因原核表达及其产物的鉴定

目的克隆问号钩端螺旋体(简称钩体)黄疸出血群赖型赖株鞭毛相关基因fliN并构建其原核表达系统,鉴定表达产物的免疫性。方法提取钩体株基因组DNA,高保真PCR扩增全长fliN基因片断,T-A克隆后测序。按常规方法构建fliN基因原核表达系统,并用IPTG诱导目的重组蛋白rFliN表达。采用SDS-PAGE结合Bio-Rad凝胶图象分析系统检测rFliN表达量,Ni-NTA亲和层析法提纯rFliN。采用兔抗问号钩体黄疸出血群赖株全菌抗血清的Western blot鉴定rFliN及其免疫反应性。结果与报道的相应序列比较,所克隆的fliN基因核苷酸和氨基酸序列相似性均为100%。IPTG诱导原核表达系统pET32a-fliN-E.coliBL21DE3的rFliN表达量约占细菌总蛋白的30%,rFliN提纯后仅见单一的蛋白条带。rF-liN能与抗血清发生免疫结合反应。结论本研究成功地构建了高效表达目的重组蛋白的问号钩体fliN基因原核表达系统,RFliN有良好的免疫反应性,为深入研究FliN致病及免疫保护作用奠定了基础。     

问号钩端螺旋体胶原酶在钩体病豚鼠模型的肺组织中的表达

目的通过克隆、表达问号钩端螺旋体赖型赖株的胶原酶基因colA(LA0872),以及制备抗胶原酶的多克隆抗体,观察胶原酶在钩体病豚鼠模型的组织中的表达,为研究其致病机制奠定基础。方法以问号钩端螺旋体赖型赖株基因组DNA为模板,用PCR扩增colA,产物克隆到表达载体pET-28b(+)中,构建含colA的重组质粒;将重组质粒转入E.coli Rosetta(DE3)菌株内,IPTG诱导表达后用Ni-NTA His-Bind亲和层析柱纯化重组蛋白;用纯化的重组蛋白免疫家兔制备抗胶原酶的多克隆抗体;Max Vision二步法染色检测胶原酶在感染钩端螺旋体的豚鼠肺组织中的分布。结果克隆表达目的基因,并成功制备了抗胶原酶的多克隆抗体。免疫组化显示在出血的肺组织中存在胶原酶。结论钩体病豚鼠模型的肺组织中有胶原酶的表达,并且存在于有钩端螺旋体分布的部位。本研究为进一步探讨胶原酶在钩端螺旋体侵袭和宿主组织出血中所起的作用奠定了基础。     

钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒的构建及其在HeLa细胞中的表达

目的构建钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL21基因片段的真核表达重组质粒．利用脂质体体外转染HeLa细胞，探讨其在体外真核细胞中的表达情况，为寻找新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子提供实验依据。方法应用PCR技术从钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株基因组模板中扩增lipL21基因，纯化回收后克隆入pUCM-T载体，再亚克隆入真核表达载体poD-NA3．1（＋），运用脂质体2000将重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21转染入HeLa细胞，细胞免疫组化法观察目的基因的表达。结果双酶切及测序鉴定证明成功构建了lipL21真核表达重组体pcDNA3．1（＋）-lipL21，DNA测序显示重组质粒含有561bp的目的基因片段，读码框架正确，无碱基错配及移码突变。重组质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21体外在HeLa细胞中能有效表达目的蛋白LipL21。结论成功构建了钩端螺旋体lipL21基因真核表达质粒pcDNA3．1（＋）-lipL21，且能够在体外真核细胞中表达；为进一步筛选新的预防钩端螺旋体病的候选疫苗分子奠定了一定的实验基础。     

Dna probes for identification of leptospires and disease diagnosis

A newly identified 1 kb DNA fragment amplified by PCR using (AG)8T inter-simple sequence repeats (ISSR) primer and a 631 bp segment of 16S rRNA ribosomal gene amplified by PCR using reported primers were labeled with a alpha32P dCTP for use as DNA probes. These probes were hybridized with DNA extracted from 19 standard pathogenic serovars, 3 standard saprophytic serovars, 33 pathogenic isolates (12 from patients, 1 from a tapwater source, and 20 from rodents), and 22 saprophytic isolates from environmental sources. The pathogen-specific 16S rRNA DNA probe specifically hybridized all 33 standard pathogenic serovars, to 13 pathogenic isolates. Similarly, the saprophyte specific 1 kb ISSR DNA probe specifically hybridized the 3 standard saprophytic serovars and the 22 saprophytic Leptospira isolates. The sensitivity of the 1 kb labeled saprophytic Leptospira specific DNA probe was 1.95 ng, and for the 16S rRNA pathogen specific probe 3.90 ng. The 16S rRNA gene segment DNA probe could also identify the leptospiremic stage in mice or guinea pigs infected experimentally with the pathogenic serovars australis, autumnalis or icterohaemorrhagiae. DNA probes therefore, owing to their high specificity and sensitivity, appear useful for easy, rapid, and reliable differentiation of pathogenic Leptospira strains and also hold promise for direct identification of organisms in blood samples to diagnose leptopsirosis.     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列1的克隆与表达

目的　构建SARS冠状病毒S蛋白部分序列 1(S1)的原核重组表达质粒 ,并分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法　采用逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)技术从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码S1蛋白的基因片段 ,并克隆至pMD18-T载体上 ;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序列分析 ;将阳性克隆的插入片段亚克隆至表达载体pGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌JM10 9,PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析截短型S蛋白的表达。结果　RTPCR扩增出S1蛋白的特异片段 ,其阳性克隆的序列存在 2处碱基突变第 36位G变为A ;第 333位由C变为T) ,其中第 36位为有义突变 ,第 333位为同义突变 ;阳性克隆中截短型S1蛋白的基因片段被亚克隆到表达载体pGEX - 4T - 2而构建成重组表达质粒 ,并在JM 10 9中表达了S1蛋白的融合蛋白 ,表达的蛋白能与GST免疫血清和SARS病人血清反应。结论　成功构建了SARS冠状病毒S1蛋白的重组表达质粒 ,该质粒在大肠杆菌中表达了截短型S蛋白的融合蛋白。     

人乳头瘤病毒16型(新疆株)E6基因的原核表达

根据人乳头瘤病毒16（新疆株）E6基因编码序列设计引物，从含有HPV16 E6基因的质粒中扩增出含HPV16 E6基因的CNA片段，该片段全长450bp，将所得片段与pMD18-T载体连接，转化到JM109大肠杆菌中，筛选的阳性克隆扩增后，提取质粒DNA，用BamH I和Sal I酶切，回收450bp的目的片段，定向克隆到pET28a中，转化JM109受体菌，从JM109受体菌中提出质粒，再转化到BL21（DE3）中，筛选出转化体，用IPTG诱导表达，在PAGE上见到所表达的18kD的特异性的HPV16（新疆株）E6蛋白条带。     

钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL32的克隆、表达及应用于致病性钩体免疫血清的检测

目的选取钩端螺旋体黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于致病性钩体检测的纯化重组蛋白。方法用PCR法扩增黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32基因,与表达载体pET-30a连接并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,免疫印迹(WB)鉴定活性后用电洗脱法进行纯化。将纯化的重组蛋白用间接和夹心ELISA法应用于22株兔免疫血清的检测,检测结果与钩体显微镜凝集试验(MAT)进行比较。结果重组表达质粒在大肠杆菌中表达高产量的重组蛋白,WB结果显示重组蛋白具有免疫活性。纯化的重组蛋白对15株钩体标准致病株兔免疫血清全部检出,对7株腐生性钩体株兔免疫血清全部未检出,与MAT检测结果相符。结论黄疸出血群(56601株)外膜脂蛋白LipL32基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白可应用于致病性钩体血清抗体的检测,为研制致病性钩体抗体检测试剂奠定了基础。     

铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的高效表创

目的 提取具有弹性蛋白酶活性的铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)临床分离株的染色体DNA，PCR扩增弹性蛋白酶基因成熟蛋白编码区，A—T克隆于质粒pMD 18-T载体中，阳性重组子经酶切后连接至相应线性化的表达型载体pQE一31中，转化大肠杆菌JM109感受态，筛选高效表达株，表达产物经SDS—PAGE初步鉴定。所克隆的基因在大肠杆菌中获得高效表达，表达产物经重组质粒测序初步确定为铜绿假单胞菌弹性蛋白酶。本研究为该表达蛋白的纯化、复性和酶动力学研究奠定了基础。