IFN-γ促进红系终末分化

目的探索IFN-γ对体外红系终末分化的调节作用。方法用real-time PCR法检测IFN-γR1/R2在血红素(hemin)诱导K562细胞红系分化过程中的表达变化。以IFN-γ处理hemin诱导的K562细胞和人脐血CD34+细胞来源的红系细胞,用real-time PCR检测红系分化标志物CD235a和CD71表达。用联苯胺染色展现IFN-γ处理的K562细胞中血红蛋白含量,通过Western blot和real-time PCR检测红系相关转录因子GATA1和NFE2的表达。结果 Hemin诱导下分化的K562细胞中IFN-γR1/R2 mRNA先减少后增高,IFN-γ促进K562及造血干祖细胞红系分化晚期CD71及CD235a的表达,增加联苯胺阳性染色率。IFN-γ对红系分化的促进作用具有时间依赖性。机制研究表明IFN-γ可促进红系关键转录因子NFE2的表达。结论 IFN-γ促进K562细胞及人脐血造血干祖细胞的红系终末分化。     

转录因子Sp1抑制K562细胞红系分化

 目的 研究转录因子Sp1在K562细胞诱导向红系分化过程中的表达变化,并确定其对于红系分化及珠蛋白表达的影响。方法 用定量PCR及Western blot的方法确定Sp1在红系分化过程中的表达情况。通过RNAi的方法抑制Sp1的表达,并通过联苯胺染色确定K562细胞中血红蛋白的表达情况,同时定量PCR的方法分析红系分化相关基因的表达,流式细胞技术检测红系分化过程中表面标志蛋白的表达情况。结果 在hemin诱导的K562细胞以及促红细胞生成素EPO诱导的造血干细胞向红系分化过程中,Sp1的mRNA及蛋白水平均呈明显下降,提示其可能负调节红系分化过程。在K562细胞中抑制Sp1的表达则可明显提高K562细胞中的血红蛋白含量,促进γ-,ε-珠蛋白,CD71,CD235a基因的表达,同时CD71,CD235a阳性细胞比例明显增加。结论 以上结果说明转录因子Sp1负调节红系分化过程,抑制Sp1的表达可提高K562细胞中珠蛋白的表达,并促进K562细胞向红系分化。     

MicroRNA-144调控红系分化

目的研究microRNA-144(miR-144)通过调节视网膜母细胞瘤蛋白(RB)对红系分化的影响。方法用氯化高铁血红素(hemin)诱导人慢性髓系白血病细胞系K562可实现在体外模拟红系分化过程,使用Real-time PCR检测miR-144表达;利用体外合成的寡核苷酸(mimic-144)转染K562细胞,检测过量表达miR-144对红系分化的影响;结合生物信息学分析、双荧光素酶报告系统和Western blot寻找并确定miR-144的靶基因。结果 miR-144在hemin诱导的K562红系分化过程中表达显著升高(P<0.05),在K562细胞中过表达miR-144可以促进血红蛋白(γ-globin)和红细胞表面标志CD235a的表达和积累;RB为miR-144的靶基因之一;在K562红系分化中,RB呈先略升后降的趋势,以0 h为参照,12 h RB/GAPDH灰度值最低为:0.092±0.007(P<0.05)。结论 miR-144通过负调控RB的表达促进hemin诱导的K562红系分化。     

低氧下K562细胞向红系分化进程中GATA-1与miR-451a表达的相关性研究

目的:探讨低氧下人慢性髓细胞性白血病K562细胞向红系分化进程中GATA结合蛋白1(GATA binding protein-1,GATA-1)与微小RNA-451a(microRNA-451a,miR-451a)表达的相关性。方法:将K562细胞分为常氧组和低氧(1%O2)组,经40μmol/L氯化血红素分别诱导分化至48和72 h。RT-qPCR检测γ-珠蛋白(γ-globin)的mRNA表达,联苯胺染色观察细胞血红蛋白生成情况,流式细胞术检测CD235a的表达水平,验证K562细胞红系分化模型是否复制成功。在K562细胞向红系分化的不同时点,采用Western blot检测两组细胞GATA-1的蛋白表达情况;采用RT-qPCR检测两组细胞GATA-1 mRNA和miR-451a的表达水平并进行相关性分析。检测GATA-1过表达组、干扰组和阴性对照组K562细胞的红系分化指标,同时采用瑞氏-吉姆萨染色法分析上述组别细胞形态学的变化,明确GATA-1过表达和抑制后K562细胞的红系分化情况。RT-qPCR检测GATA-1过表达和抑制后miR-451a的表达变化。结果:两组细胞分化48 h和72 h后,γ-globin表达量、联苯胺染色阳性率和CD235a表达量均显著高于0h(P<0.05),且低氧组72 h的γ-globin表达量、联苯胺染色阳性率和CD235a表达量均显著高于常氧组(P<0.05)。低氧组GATA-1 mRNA和miR-451a的表达水平随红系分化过程均呈现上升趋势(P<0.05),并在72 h均显著高于常氧组(P<0.05)。相关性分析结果显示,低氧下GATA-1 mRNA与miR-451a的表达呈正相关(P<0.01)。GATA-1慢病毒感染K562细胞72 h后,低氧下过表达组γ-globin表达量、联苯胺染色阳性率、CD235a表达量及体积增大、核偏移和核缩小的细胞数均显著高于阴性对照组(P<0.05);72 h干扰组γ-globin表达量、联苯胺染色阳性率、CD235a表达量及体积增大、核偏移和核缩小的细胞数均显著低于阴性对照组(P<0.05)。与阴性对照组相比,低氧下过表达GATA-1后,72 h时miR-451a的表达显著增高(P<0.05);干扰GATA-1后,72 h时miR-451a的表达显著降低(P<0.05)。结论:低氧通过诱导GATA-1表达增高而上调miR-451a,从而促进K562细胞向红系分化。     

SLC30A3促进人髓性白血病细胞K562向早期红系分化

 目的 研究SLC30A3在红系分化中的作用。 方法 在人髓性白血病K562细胞系中用质粒载体过表达SLC30A3后，检测细胞红系分化指标CD235、ε-、γ-和β-珠蛋白的表达量及细胞增殖速度。流式细胞术检测CD235的表达，荧光实时定量PCR检测珠蛋白mRNA水平，Western blot法检测转录因子GATA-2蛋白水平，MTS法检测细胞增殖速度。结果 过表达SLC30A3使K562细胞的红系分化特异标志CD235的表达升高，CD235阳性细胞率由对照组的34.25%±16.89%增加至95.7%±0.14%，ε-、γ-和β-珠蛋白的表达明显升高，红系分化相关转录因子GATA-2的表达降低，细胞增殖速度加快。结论 SLC30A3促进人髓性白血病K562细胞系向早期红系分化。     

CDK2促进K562细胞早期红系分化

目的 探讨细胞周期调节蛋白CDK2对K562细胞红系分化的影响.方法 分别用CDK2表达质粒和干扰RNA分子转染K562细胞,用Western blot法检测过表达或干扰效率,使用real-time PCR和联苯胺染色法检测K562细胞分化.结果 CDK2在K562细胞红系分化早期呈现表达上升趋势;在K562细胞中过表达CDK2可促进hemin诱导的红系分化;反之,干扰K562内源的CDK2表达会对K562红系分化产生抑制作用.结论 CDK2在K562细胞早期红系分化过程中发挥促进作用.     

低氧通过上调内皮含PAS结构域蛋白1(EPAS1)表达促进人K562细胞向红系分化

目的 探讨低氧条件下编码缺氧诱导因子2α(HIF-2α)的内皮含PAS结构域蛋白1(EPAS1)基因在K562人红白血病细胞向红系分化中的作用。方法 将K562细胞分为常氧对照组、常氧诱导组(40μmol/L氯化血红素和0.1 ng/mL阿糖胞苷诱导)、低氧对照组(50 mL/L O₂)、低氧诱导组。培养5 d后收集细胞,流式细胞术分析CD235a⁺CD71⁺细胞比例,联苯胺染色检测血红蛋白合成,CCK-8法检测细胞增殖,实时定量PCR检测EPAS1、胰岛素受体底物2(IRS2)、γ珠蛋白(γ-globin)mRNA表达,Wester blot法检测上述基因蛋白表达,分析低氧对K562细胞红系分化的影响;使用短发夹RNA(shRNA)敲低EPAS1,分析常氧及低氧下实验组(sh-EPAS1组)和对照组(sh-Control)红系分化的差异,明确EPAS1对K562细胞红系分化的作用。结果与常氧诱导组相比,低氧诱导组CD235a⁺CD71⁺阳性细胞显著增加,合成血红蛋白增多,EP...     

microRNA-144～451基因簇促进红系分化

目的 探索microRNA-144～451基因簇在红系分化过程中的功能及调控机制.方法 用real-time PCR法检测microRNA-144和microRNA-451的表达;用ChIP结合real-time PCR的方法检测GATA-1和EKLF在microRNA-144～451基因簇上游的结合及调控;使用microRNA-144和microRNA-451模拟物转染K562细胞,并用联苯胺染色和real-time PCR方法检测K562细胞向红系分化;用Western blot方法检测红系分化抑制因子GATA-2表达.结果 microRNA-144和microRNA-451在K562细胞红系分化过程中呈现表达逐渐上升趋势;转录因子GATA-I和EKLF可以结合在microRNA-144 ～ 451基因簇并激活microRNA-144或microRNA-451的表达;在K562细胞中过表达microRNA-144或microRNA-451均可促进hemin诱导的红系分化;另一方面,microRNA-144和microRNA-451可以通过抑制GATA-2的表达促进细胞向红系分化.结论 microRNA-144～ 451基因簇在红系分化过程中受到GATA-1和EKLF的激活调控,同时通过抑制GATA-2的表达促进红系发育成熟.     

微小RNA miR-181a促进慢性粒细胞白血病K562细胞分化

目的探讨微小RNA miR-181a对慢性粒细胞白血病(CML)K562细胞的作用。方法构建了miR-181a过表达的慢病毒载体,采用实时定量PCR方法检测CD235a和γ球蛋白的表达,评价K562细胞向红系分化的程度,检测CD61和CD41的表达,评价K562细胞向巨核系分化的程度,采用CCK实验检测细胞增殖情况。结果氯高铁血红素佛及波酯诱导后,miR-181a在K562细胞中过表达能够增强CD235a、γ球蛋白、CD61和CD41的表达水平(P0.05);miR-181a过表达能够明显抑制K562细胞的增殖(P0.05)。结论 miR-181a过表达促进K562细胞的分化并抑制其细胞的增殖。     

miR-34a-5p抑制K562细胞红系分化

目的探索miR-34a-5p对K562细胞红系分化的影响。方法分别用miR-34a-5p模拟物和反义抑制寡核苷酸转染K562细胞,用real-time PCR法检测过表达或干扰效率,并进一步用流式细胞术和联苯胺染色法检测K562细胞向红系的分化情况;通过Western blot方法检测miR-34a-5p的靶基因。结果 miR-34a-5p在K562细胞红系分化过程中呈现表达下降趋势;在K562细胞中过表达miR-34a-5p可抑制hemin诱导的红系分化(P0.05);反之,干扰K562内源的miR-34a-5p表达会对K562红系分化产生促进作用(P0.01);另一方面,miR-34a-5p通过靶向抑制c-MYB的表达抑制细胞向红系分化。结论 miR-34a-5p通过抑制c-MYB在K562细胞早期红系分化过程中发挥促进作用。     

白血病细胞系K562分化模型的建立及不同分化时解偶联蛋白2表达的变化

解偶联蛋白2(uncoupling protein2,UCP2)属于解偶联蛋白家族成员,参与机体的多种病理生理过程。白血病特征之一是细胞分化受阻,机制不清。应用氯化血红素(hemin)诱导白血病细胞系K562,联苯胺(Benzide)染色表明,细胞向红系分化;应用佛波酯(PMA)诱导白血病细胞系K562,CD41、CD51和CD61mRNA表达明显增高,表明细胞向巨核系分化。应用RT-Q-PCR及Westernblot检测,K562向红系分化时UCP2表达增高,向巨核系分化时UCP2表达降低,提示UCP2可能在白血病细胞分化过程中发挥作用。     

Wnt-10a在氯高铁血红素诱导K562细胞分化过程中的作用

目的 探讨Wnt-10a在氯高铁血红素（hemin）诱导K562细胞分化过程中的变化及功能。 方法 通过联苯胺染色检测K562细胞被hemin诱导的阳性率,利用Western blotting和免疫细胞化学分析K562细胞诱导分化过程中Wnt-10a表达水平和细胞定位的变化情况,通过半定量PCR与Real-time PCR检测K562细胞诱导分化过程中Wnt信号途径关键因子的表达水平及其变化,通过Wnt信号途径激活剂与构建Wnt-10a高表达K562细胞株的方法探讨Wnt途径改变后对K562细胞诱导分化的影响。 结果 在hemin诱导K562细胞分化过程中,细胞中的Wnt-10a蛋白表达量和mRNA量都出现了短暂下降后回复的趋势,同时Wnt-10a向胞膜迁移,Wnt蛋白所参与的3条信号途径中关键因子的表达水平均有着不同程度的变化。使用Wnt信号通路抑制剂后,诱导分化过程中的细胞增殖活力加强,Wnt-10a高表达的K562细胞被hemin诱导分化的能力开始提高,并且Wnt经典信号途径的关键因子表达水平也有上升。 结论 Wnt-10a与hemin诱导K562细胞红系分化的过程密切相关。     

蛇六谷提取物抑制K562细胞增殖并诱导分化的作用

目的:探讨蛇六谷提取物(TuAKe)抑制人慢性髓系白血病K562细胞增殖和诱导分化的作用机制。方法:不同浓度的TuAKe处理K562细胞,MTT比色法和半固体集落形成实验检测K562细胞的增殖能力;瑞氏-姬姆萨染色观察细胞形态;流式细胞术检测分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b的阳性表达率;Western blot法检测细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1)和红系分化核转录因子GATA-1的蛋白表达水平。结果:TuAKe能够抑制K562细胞增殖,改变细胞形态,抑制K562细胞进入S期,并阻滞在G_2/M期,提高分化相关抗原CD11b、CD14和CD42b阳性表达率,上调GATA-1蛋白表达,同时下调CDK2和cyclin E1蛋白表达(P0.05)。结论:TuAKe可能通过调控细胞周期抑制K562细胞增殖,同时诱导K562细胞多向分化。     

地西他滨抑制K562白血病细胞增殖和诱导分化的作用

目的:观察地西他滨(DAC)抑制白血病K562细胞生长和诱导分化的作用。方法:不同浓度的DAC处理K562细胞。MTT法和半固体集落生成实验检测K562细胞增殖能力;瑞氏染色观察细胞形态;流式细胞术检测分化相关抗原CD11b和CD42b阳性表达率;Western blot检测细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白E1(cyclin E1)、细胞周期负调控因子P27、红系分化核转录因子GATA-1及粒系分化核转录因子PU.1蛋白的表达水平。结果:DAC能够减少K562细胞集落形成的数量,降低细胞活力,减少核质比,抑制K562细胞进入S期,并阻滞在G_2/M期,提高分化相关抗原CD11b和CD42b阳性表达率,上调P27、GATA-1和PU.1蛋白表达,同时下调CDK2和cyclin E1蛋白表达。结论:DAC可能通过调控细胞周期抑制K562细胞增殖,同时诱导多向分化。     

模拟微重力影响EPO诱导K562细胞向红系分化的机制研究

目的:航天飞行性贫血现象的机制尚不清楚。本实验利用第4代细胞旋转培养系统(RCCS-4)模拟微重力,研究其对促红细胞生成素(EPO)诱导培养K562细胞向红系分化的影响及其机制。方法:实验分为地面培养组(Control组)、EPO诱导组(EPO组)、模拟微重力组(MG组)和模拟微重力+EPO组(MG+EPO组),利用RCCS-4模拟微重力,分别在地面和模拟微重力环境下,采用EPO诱导培养K562细胞。采用联苯胺染色法观察各组K562细胞向红系分化情况;流式细胞术检测K562细胞CD71抗原表达水平,Western-blotting方法检测K562细胞丝氨酸/苏氨酸蛋白(AKT)及红系特异核蛋白转录因子-1(GATA-1)表达水平,流式细胞术检测K562细胞凋亡情况。结果:联苯胺染色阳性率比较,MG组和MG+EPO组明显低于EPO组(P<0.01);CD71抗原表达水平为MG+EPO组明显低于EPO组(P<0.01);AKT/GATA-1蛋白表达量MG组低于Control组,MG+EPO组低于EPO组(P<0.01);各组K562细胞凋亡率检测发现MG组和MG+EPO组(70.25±0.17%)较Control组和EPO组明显增加(P<0.01)。结论:模拟微重力可以通过下调红系分化相关蛋白AKT及GATA-1表达和诱导细胞凋亡来抑制EPO诱导K562细胞向红系分化。     

miR-330-3p调控ALAS2在红细胞分化中的作用

目的 探讨miR-330-3p在红细胞分化中的作用和机制.方法 胚胎干细胞诱导分化为红系细胞,分别测定0d、7 d、14d、21dmiR-330-3p和ALAS2表达水平.比较红系细胞(K562细胞)和非红系细胞(HELA细胞)miR-330-3p和ALAS2表达差异.K562分转染miR-330-3p抑制物组、miR...     

miR-424负向调节人脂肪源间充质干细胞向成脂细胞分化

目的研究miR-424对人脂肪源间充质干细胞(hAMSCs)向成脂分化的影响。方法用real-time PCR检测hAMSCs成脂分化前后细胞内miR-424水平的变化。在脂质体介导下,用人工合成的miR-424模拟物转染hAMSCs提高细胞内miR-424的含量,随后对其进行成脂诱导。用油红O染色法观察细胞内脂滴形成情况,用real-time PCR和Western blot检测成脂关键转录因子PPARγ及相关标记物mRNA的表达。结果 hAMSCs成脂分化后,miR-424表达下调。与对照组细胞相比,转染miR-424模拟物的实验组细胞中miR-424含量明显升高。成脂诱导第8天油红O染色结果显示,实验组脂滴形成显著少于对照组。PPARγ和成脂相关标记物的表达量也出现下调。结论 miR-424可负向调节hAMSCs向脂肪细胞分化。     

miR-424 negatively regulates adipogenic differentiation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells

目的 研究miR-424对人脂肪源间充质干细胞(hAMSCs)向成脂分化的影响.方法 用real-time PCR检测hAMSCs成脂分化前后细胞内miR-424水平的变化.在脂质体介导下,用人工合成的miR-424模拟物转染hAMSCs提高细胞内miR-424的含量,随后对其进行成脂诱导.用油红O染色法观察细胞内脂滴形成情况,用real-time PCR和Western blot检测成脂关键转录因子PPARγ及相关标记物mRNA的表达.结果 hAMSCs成脂分化后,miR-424表达下调.与对照组细胞相比,转染miR-424模拟物的实验组细胞中miR-424含量明显升高.成脂诱导第8天油红O染色结果显示,实验组脂滴形成显著少于对照组.PPARγ和成脂相关标记物的表达量也出现下调.结论 miR-424可负向调节hAMSCs向脂肪细胞分化.     

EKLF转录激活miR-96在红系分化过程中表达

 摘要：目的 研究红系分化过程中,红系分化特异转录因子EKLF对miR-96的表达调控。方法：氯化高铁血红素（Hemin）诱导人K562细胞（人红白血病细胞系）向红系分化,Real-time PCR检测miR-96表达。生物信息学分析miR-96转录起始点上游可能的EKLF结合位点。并经染色质免疫共沉淀(ChIP)与双荧光报告基因实验验证EKLF与这些位点结合的生物学意义。结果 Hemin诱导K562细胞向红系分化过程中,miR-96表达显著升高,且在48h表达最高(3.94156±0.63995, p<0.05)。生物信息学分析显示miR-96转录起始位点上游2.0kb内含有多个EKLF结合位点。经ChIP验证这些位点有EKLF的结合,且EKLF与这些位点结合能募集RNA聚合酶II（Pol II）结合,起始转录。进一步的双荧光报告基因实验也证明EKLF对miR-96转录起始点上游序列具有转录激活作用。结论EKLF转录激活miR-96在红系分化过程中的表达。     

RNAi介导的pirin低表达降低了K562细胞的红系分化能力

目的 研究pirin低表达对人红白血病细胞系K562红系分化和细胞活力的影响.方法 通过短发卡RNA(shRNA)干扰技术,构建pirin低表达细胞稳定株,用Western blot方法对干扰效果进行检测,并用联苯胺染色和MTT法分别检测下扰pirin后对K562细胞的红系分化和增殖的影响.结果 转染了pirin-shRNA的细胞其pirin的表达量明显低于对照组(随机干扰组),pirin低表达与对照组相比对细胞增殖无影响,但在诱导剂诱导分化过程中,血红蛋白的合成出现了显著性的降低(P＜0.05).结论 Pirin低表达不影响K562细胞的增殖能力,但能降低其红系分化能力.