斑马鱼TNNT2a相对荧光定量PCR双标准曲线的建立

正斑马鱼是一种新型的模式脊椎动物,其生长周期短,饲养成本低,幼体透明,近年来被广泛应用于心血管疾病的实验研究中[1]。肌钙蛋白作为临床上一种重要的心衰标志物,对心血管疾病的临床诊断、治疗和预后评估有重要意义。本实验旨在建立斑马鱼心肌肌钙蛋白(zebrafish troponin T type2a,TNNT2a)基因的相对定量PCR双标准曲线,探究TNNT2a的表达水平。     

斑马鱼器官石蜡组织切片制作与观察

为观察斑马鱼(Danio rerio)器官的组织结构,丰富斑马鱼基础形态学资料。本实验以斑马鱼心脏和肝脏为材料,优化斑马鱼石蜡组织切片制作方法,并制作斑马鱼器官组织切片,用苏木精-伊红(HE)染色并采集图像分析。斑马鱼心肌纤维呈梭形,细胞间质少;肝细胞呈多边形,细胞核呈圆形,居中。     

斑马鱼igfbp1基因突变体的构建及其功能研究

目的：缺氧能够导致胎儿生长发育异常。研究表明胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein 1, IGFBP1)与缺氧胚胎发育迟缓密切相关。本研究利用模式动物斑马鱼，研究igfbp1基因敲除对胚胎发育的影响。方法：运用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼同源基因igfbp1a和igfbp1b缺失突变体。分别在胚胎受精24、48和72 h后进行缺氧处理，检测野生型(wide-type, WT)和突变体斑马鱼的体长及生存率。结果：成功得到12种不同基因型igfbp1a^-/-和6种igfbp1b^-/-突变体。表型分析未见异常。选用igfbp1a (-13 bp)^-/-与igfbp1b(-14 bp)^-/-的突变体进行缺氧实验。受精24 h的WT斑马鱼在缺氧24 h后体长明显缩短(P<0.01)，但是igfbp1a^-/-和igfbp1b^-/-的斑马鱼缺氧处理后，与常氧组相比体长均未见显著差异，...     

PCR-荧光探针法检测庆阳地区丙型肝炎病毒基因型

目的:应用PCR-荧光探针法分析庆阳地区丙型肝炎患者基因型,并对PCR-荧光探针法的各种性能进行评价。方法:收集庆阳地区289 例各种丙型肝炎患者的临床资料和外周静脉血,采用PCR-荧光探针法检测其基因型,并和PCR-反向点杂交法、测序法进行比较。结果:289 份HCV RNA 阳性血清标本中,PCR-荧光探针法基因型及亚型检出率为99.3%(287/289),其中1b 型139 例(48.1%),2a 型136 例(47.1%),3a 型7 例(2.4%),3b 型5 例(1.7%),未分出型2 例(0.7%)。PCR-荧光探针法的特异度和准确度为100%,重复性良好,并与PCR-反向点杂交法、巢式PCR 测序法分型结果均一致,三种方法的一致率为98.2%(56/57),差异无统计学意义(P>0.05)。1b 基因型患者ALT、AST、PLT 和HCVRNA(lg)水平均高于2a基因型患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:庆阳地区HCV 基因型呈现多基因型分布特点,主要为1b 型和2a 型,且2a 型和1b 型的比例相当,呈现出2a 型比例升高,1b 型下降的趋势;PCR-荧光探针法HCV 基因分型敏感度和特异度高,方法简单,适合临床实验中应用。     

斑马鱼cetp基因敲除模型的建立及其肝脏转录组学分析

目的建立斑马鱼cetp基因敲除模型,探讨cetp基因敲除后在动脉粥样硬化中的转录组学变化。方法采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除斑马鱼cetp基因,构建cetp~(-/-)斑马鱼模型。采用转录组测序观察cetp基因敲除后基因表达谱变化,通过京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对差异表达基因进行功能富集分析。结果采用CRISPR/Cas9技术敲除斑马鱼cetp基因,斑马鱼产生增加5个碱基的移码突变。转录组测序发现,cetp~(-/-)斑马鱼肝脏基因表达谱发生显著变化,共筛选到3 808个发生显著变化的基因(P0.05),其中显著上调基因有1 918个,显著下调基因1 890个。脂质代谢相关基因如abca1、abcg2a基因显著上调,lipg显著下调;与自噬相关信号通路基因如atg13显著上调;下调基因富集到DNA及RNA合成、三羧酸循环等相关通路。结论建立了斑马鱼cetp~(-/-)模型,可用于胆固醇酯转运蛋白(CETP)在动脉粥样硬化疾病中作用机制的研究。尽管抑制CETP可使高密度脂蛋白胆固醇升高而抑制动脉粥样硬化,但是斑马鱼cetp敲除后激活机体炎性反应而促进动脉粥样硬化,提示CETP在动脉粥样硬化发生发展的过程中具有双重调节作用。     

长春碱增加班马鱼肿瘤耐药基因abcb4的表达

目的通过研究长春碱(VBL)对斑马鱼早期发育过程中abcb4肿瘤耐药基因表达的影响,为进一步建立抗肿瘤药物多药耐药筛选的斑马鱼模型奠定重要的实验基础。方法将长春碱稀释成不同浓度梯度的药液,在受精后0.5~1.5 h的斑马鱼胚胎上完成药物暴露实验,计算出长春碱IC_(50)的数值。设置长春碱为实验组,胚胎培养液为空白对照组,分别作用于受精后0.5~1.5 h的斑马鱼胚胎,观察受精后24~120 h的斑马鱼胚胎发育情况,记录死亡、孵化及畸形的胚胎数目;收集不同组别的斑马鱼胚胎,通过实时荧光定量PCR和胚胎整体原位杂交的方法,检测斑马鱼胚胎中abcb4基因的表达量。结果计算出长春碱在斑马鱼胚胎中的IC_(50)为3.08μmol/L;与对照组比较,实验组的斑马鱼胚胎abcb4基因的mRNA水平明显升高(P0.05);通过胚胎整体原位杂交的方法,在受精后120 h斑马鱼胚胎的小肠部位发现有abcb4基因阳性杂交信号,且实验组斑马鱼胚胎在脑和心脏部位发现abcb4基因阳性杂交信号。结论长春碱能明显增加斑马鱼早期胚胎中abcb4肿瘤耐药基因的表达水平,提示使用斑马鱼可以复制肿瘤耐药模型。     

斑马鱼胚胎发育过程成纤维细胞生长因子受体基因时序性表达

目的探讨斑马鱼胚胎发育过程成纤维细胞生长因子(FGF)受体基因时序性表达规律。方法分别提取发育至4、6、10、12、18、24、48及72hpf斑马鱼胚胎总RNA并反转录为cDNA,用实时定量PCR方法检测FGF受体基因(fgfrs)mRNA的相对表达量。结果斑马鱼胚胎发育过程fgfrs mRNA动态表达水平有明显峰谷变化(P0.01),胚胎fgfrs开始表达阶段依次为fgfr1a与fgfr1b(囊胚期)、fgfr4(原肠胚初期)、fgfr2(原肠胚期)及fgfr3(原肠胚后期),其表达高峰期分别在原肠胚期、原肠胚后期、体节期及胚胎发育中后期。旁系同源基因fgfr1a与fgfr1b动态表达趋势相似(r=0.830,P0.05)。fgfr1a与fgfr3、fgfr1b与fgfr4、fgfr2与fgfr3 mRNA表达量之间相关分析也有意义(r值分别为-0.726,0.821及0.772,P0.05)。结论斑马鱼胚胎发育过程fgfrs时序性表达有一定规律性,fgfr1、fgfr4主要参与胚胎早期发育调控,fgfr2、fgfr3主要参与胚胎中、后期发育调控。fgfr1a与fgfr1b共表达使其调控作用具有冗余能力。fgfr1和fgfr3之间在表达上可能存在相互制约关系。     

Wnt/β-catenin信号通路参与化疗药物诱导的转基因斑马鱼abcb4基因的表达和耐药

目的探讨斑马鱼耐药基因ATP结合盒亚家族B成员4(ABCB4)与Wnt/β联蛋白(β-catenin)信号通路的关系。方法取野生型斑马鱼和转基因斑马鱼均设置空白对照组、阿霉素处理组、长春碱处理组、吉非替尼处理组、阿霉素联合吉非替尼处理组、长春碱联合吉非替尼处理组。每组100枚胚胎分别进行药物处理至第5天,每组取第5天斑马鱼幼鱼50枚进行实验。采用罗丹明123实验检测野生型斑马鱼耐药程度,酶标仪检测转基因的斑马鱼荧光强度,活细胞工作站检测荧光分布位置。Western blot法检测转基因的斑马鱼β-catenin、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、 ATP结合盒亚家族B成员4(ABCB4)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的蛋白水平。结果罗丹明123实验证实经阿霉素和长春碱药物暴露后的斑马鱼体内产生耐药, EGFP荧光强度检测结果表明经阿霉素和长春碱药物暴露后的转基因斑马鱼荧光强度高,经阿霉素和长春碱药物暴露后的转基因斑马鱼体内β-catenin的累积升高伴随着EGFP和ABCB4蛋白的增加。结论斑马鱼体内Wnt/β-catenin信号通路参与斑马鱼abcb4基因的激活与耐药。     

地高辛标记的斑马鱼酪氨酸羟化酶TH2基因RNA探针的制备与鉴定

<正>斑马鱼(zebrafish)在脊椎动物基因功能的研究中得到广泛应用,并且越来越多地应用到人类遗传疾病的研究中。基因测序发现在直系同源基因中,47%的人类基因与斑马鱼直向同源物具有一对一的关系[1]。此外,斑马鱼体形小、繁殖周期短,可在实验室中进行空间高效维护。在硬骨鱼进化上的基因组重复导致两个旁系同源的斑马鱼酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)编码基因TH1和TH2,其中TH1主要分布在脑内,TH2则主要分布     

长链非编码RNA uc.299在心脏发育中的作用

目的:研究长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)uc.299在P19细胞分化及斑马鱼心脏发育中的作用,探讨其与心脏发育之间的关系.方法:体外实验中,通过shRNA沉默uc.299后,检测对P19分化的影响;在体实验中,对斑马鱼受精卵显微注射uc.299反义寡核苷酸,观察对斑马鱼心脏发育的影响.结果:与对照组相比,沉默uc.299对P19细胞分化有明显的抑制作用,心肌细胞跳动频率降低,各心肌标志物表达水平有明显下调.斑马鱼实验表明,沉默uc.299可造成斑马鱼心脏明显水肿.结论:沉默uc.299可影响P19分化和斑马鱼心脏发育,表明uc.299对维持心脏正常发育具有一定作用.     

鱼藤素可影响斑马鱼胚胎Wnt信号通路相关基因的表达

背景：前期研究发现,在斑马鱼早期发育的不同时期,经过一定浓度鱼藤素处理的胚胎表现出不同程度的发育延缓和表型异常。 目的：观察斑马鱼早期胚胎发育过程中鱼藤素对wnt信号通路相关基因表达的影响。 方法：收集孵育至shield期的斑马鱼胚胎于6孔板中,加入0.6 μmol/L浓度的鱼藤素溶液,避光处理,28 ℃培养箱中孵养。用0.1%二甲基亚砜溶液作为对照组,相同条件培养。在受精后6,8,10,12,14,24 h时用正置荧光显微镜拍照观察鱼藤素处理后斑马鱼胚胎发育表型。实时荧光定量核酸扩增检测鱼藤素作用前后目的基因表达水平的变化。 结果与结论：shield期处理的斑马鱼胚胎在bud期停止生长;wnt信号通路上的wnt9a,wnt10b和axin2以及与wnt信号具有密切联系的snail1b,Jnk2表达发生显著变化,其中wnt9a,wnt10b,axin2,snail1b表达下调,Jnk2表达上调。结果提示鱼藤素对斑马鱼体内wnt信号具有负调节作用。     

药源性眼损伤快速评价的斑马鱼模型

目的 苯扎溴铵和羟苯乙酯是广泛应用于眼用制剂的防腐剂,其在眼表的积累是引起眼用制剂药物毒性的重要因素.目前还没有一种简单、快速的方法来检测防腐剂的体内毒性.本研究以苯扎溴铵和羟苯乙酯为探针药物建立一种快速筛选和评价化合物眼毒性的斑马鱼模型和方法.方法 体式显微镜下活体观察斑马鱼幼鱼给药后眼部形态的变化;采用斑马鱼行为学...     

小鼠Brd2基因探针的制备及其在荧光原位杂交实验中的应用

目的:为观察溴结构域包含蛋白2(bromodomain containing protein 2,Brd2)基因在小鼠中枢神经系统的表达与分布,本研究制备了两条地高辛标记的Brd2 cRNA探针。方法:提取小鼠脑组织总RNA,设计两对Brd2引物,通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增得到两个Brd2的DNA片段,并将它们分别克隆到pCRⅡ-TOPO载体中。利用体外转录方法合成地高辛标记的cRNA探针,最后通过荧光原位杂交实验分析所标记探针的特异性及杂交效果。结果:本实验成功构建了两个Brd2/pCRⅡ-TOPO质粒,获得了特异性的地高辛标记的Brd2cRNA探针,在荧光原位杂交实验中应用两条探针得到了较好的杂交信号。结论:本实验制备的地高辛标记的cRNA探针可特异地检测Brd2 mRNA,为进一步观察Brd2 mRNA在中枢神经系统的分布及功能研究提供了工具。     

卵巢癌特异性MR分子探针的制备

目的 制备针对卵巢癌的特异性磁共振(magnetic resonance,MR)分子探针,并评价其体外转染SKOV3细胞的可行性.方法 琼脂糖凝胶阻滞实验确定探针中的多聚赖氨酸修饰的超顺磁性氧化铁(SPIO-PLL)及质粒pGenesil1-shRNA的最佳质量比,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达以检测探针是否进入细胞;透射电子显微镜观察探针中铁在细胞中的部位;CCK-8法检测探针的细胞毒性;MR扫描检测探针转染后细胞的T2*信号强度改变.结果 当SPIO-PLL和质粒的质量比达6∶1时,二者有效结合;探针体外转染细胞后,可观察到绿色荧光蛋白表达,检测到铁颗粒存在于胞质内;在探针浓度低于50 mg/L的范围内,细胞存活率高于80％;探针转染后细胞的T2*信号强度明显降低(P＜0.01).结论 成功制备卵巢癌特异分子探针,在体外成功转染卵巢癌SKOV3细胞,对细胞毒性小,可被MR扫描敏感检测.     

高精度原子力显微镜显示磁性反义探针与SK-Br-3肿瘤细胞mRNA核苷酸连接

为了将高精度原子力显微镜(AFM)用于显示超顺磁性氧化铁标记的c-erbB2癌基因反义寡脱氧核苷酸探针(磁性反义探针)与SK-Br-3肿瘤细胞mRNA核苷酸的连接,我们在磁性反义探针转染SK-Br-3肿瘤细胞基础上,用AFM对转染后的肿瘤细胞进行观察,并同时对转染后的肿瘤细胞进行蛋白表达检测及MRI成像,以进一步证实AFM的观察结果。从AFM显示的磁性反义探针转染SK-Br-3肿瘤细胞后单个细胞的全貌图及局部放大图发现,探针中反义寡脱氧核苷酸中的脱氧胞嘧啶核苷酸闭环与肿瘤细胞mRNA嘌呤核苷酸环相连接;此外,磁性反义探针能特异性抑制SK-Br3细胞c-erbB2的蛋白表达,MRI显示磁性反义探针转染SK-Br-3肿瘤细胞的信号强度最低(P<0.05)。实验表明,AFM可以清楚显示磁性反义探针与SK-Br-3肿瘤细胞核mRNA核苷酸的连接。     

阿魏酸钠拮抗氧化型脂蛋白(a)对人动脉平滑肌细胞的作用

目的:研究脂蛋白(a)氧化前后致人动脉平滑肌细胞(SMC)增殖及细胞内游离钙浓度([Ca²⁺]_i)的变化,观察阿魏酸钠(SF)对其的影响。方法:Lp(a)经体外Cu²⁺氧化法氧化,硫代巴比妥酸(TBARS)比色法检测氧化程度,培养的人动脉SMC中分别加入不同浓度SF,作用12h后再与天然和氧化型Lp(a)共同孵育,以MTT比色法、流式细胞仪检测细胞增殖状况,采用荧光探针Fura-2/AM检测细胞[Ca²⁺]_i。结果:氧化型Lp(a)促人动脉SMC增殖的同时亦明显增加了[Ca²⁺]_i水平,作用较天然Lp(a)明显,SF(40,80mg/L)可显著抑制氧化型Lp(a)所致的细胞增殖和[Ca²⁺]_i增加,并呈剂量效应关系,而对天然Lp(a)所致的细胞增殖和[Ca²⁺]_i增加无明显影响。结论:氧化型Lp(a)通过升高[Ca²⁺]_i而显著促动脉SMC增殖可能是其致动脉粥样硬化的机制之一,SF拮抗这种作用可能与其抗氧化能力有关。     

miR-99a通过下调RRM2抑制人子宫颈癌HeLa细胞系增殖、迁移和侵袭

目的 探讨miR-99a与核糖核苷酸还原酶小亚基M2(RRM2)的靶向关系,并分析二者对人子宫颈癌(CC)HeLa细胞系增殖、侵袭及迁移的影响。方法 将HeLa细胞,分为对照组(control)、阴性对照组(inhibitor-NC)、抑制miR-99a表达组(miR-99a-inhibitor)、共转染组(RRM2-siRNA+miR-99a-inhibitor)。MTT法、平板集落实验检测细胞增殖;划痕实验、Transwell小室法检测细胞迁移、侵袭;Western blot检测RRM2、细胞增殖核抗原(PCNA)、E-钙黏附蛋白(E-cadherin)、N-钙黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)蛋白表达;免疫荧光法检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin定位及表达;生物信息学及双荧光素酶报告基因实验验证miR-99a与RRM2靶向关系;RT-qPCR检测细胞中miR-99a、RRM2 mRNA水平。结果 下调miR-99a表达,可增高HeLa细胞增殖率(100.00比128.86±4.25,P<0.05);上调集落形成率、划...     

非肌性肌球蛋白Ⅱ-B调节斑马鱼咽弓的发育

目的探讨非肌性肌球蛋白Ⅱ(NMⅡ)家族基因在斑马鱼胚胎期咽弓的表达及其对咽弓发育的影响。方法通过斑马鱼胚胎整体原位杂交及冷冻切片技术(n=10),观察NMⅡ家族基因在斑马鱼胚胎期咽弓的表达情况。利用软骨的阿辛蓝染色方法,将野生型对照组(n=10)和blebbistatin处理组(每个浓度n=10)的斑马鱼胚胎进行比较,分析NMⅡ对斑马鱼胚胎期咽弓发育和形成的影响。结果受精后72 h(72hpf),NMⅡ-B在斑马鱼发育着的咽弓部位有特异性表达;120 hpf,NMⅡ-B在咽弓表达增加。Blebbistatin特异性抑制NMⅡ-B功能后,斑马鱼咽弓发生明显发育缺陷,部分软骨细胞出现显著形态改变;抑制咽弓形成的作用与blebbistatin浓度呈现剂量依赖效应。结论 NMⅡ-B通过影响咽弓软骨细胞从而调节斑马鱼胚胎期咽弓的发育。     

zdhhc17对斑马鱼集中延伸运动的调节及其机制 

目的 通过抑制zdhhc17基因的表达,探讨其在斑马鱼胚胎发育过程中的作用及机制。方法 通过显微注射zdhhc17吗啉反义寡聚核苷酸(MO)抑制zdhhc17翻译,观察斑马鱼胚胎发育过程中相关表型的变化。利用斑马鱼整封原位杂交技术,检测集中延伸运动相关标记基因（dlx3b、ntl、myod1、 tbx6等）的表达变化。利用RT-PCR技术,检测集中延伸运动相关调控因子mRNA表达水平的变化。 结果 敲除zdhhc17基因后,斑马鱼胚胎集中延伸运动出现严重缺陷,主要表现为尾部弯曲变短（82/118）,且集中延伸运动相关标记基因表达异常,钙黏附蛋白家族cdh1、padh18a mRNA水平降低。结论 zdhhc17通过调节钙黏附蛋白家族cdh1、padh18a基因的表达,进而影响细胞黏附运动,最终参与调控斑马鱼胚胎集中延伸运动。     

sox19b在斑马鱼胚胎眼睛发育中的作用

目的 通过抑制sox19b基因的表达,探讨sox19b基因在斑马鱼胚胎眼睛发育和形成中的作用。方法 通过显微注射sox19b 吗啉寡聚核苷酸（MO）抑制sox19b 基因的表达,观察胚胎发育过程中表型的变化;采用石蜡包埋组织切片及HE染色、RT-PCR和整封原位杂交等方法探讨敲除sox19b 后对斑马鱼胚胎眼睛发育的调控机制。 结果 敲除sox19b 基因后,斑马鱼胚胎眼睛发育受到影响,表现为眼睛变小或缺失,视网膜及晶状体结构发育异常(n =57/93);眼睛发育过程中重要调控基因 rx3、pax2a及 vsx2 等表达明显降低,进而影响眼睛的发育和形成。 结论 sox19b 基因作为转录调控因子,可以通过调节眼区转录因子的表达进而影响斑马鱼胚胎早期眼睛的发育和形成。