负载hTERT调控相关miR-138复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

目的 包装负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138前体全长cDNA(pre-miR-138)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR138).方法 pre-miR-138全基因合成后插入腺病毒穿梭质粒(pDC315-miR138),与腺病毒包装质粒pBHGloxDeltaE1、3Cre共转染人胚肾293细胞...     

重组LacZ复制缺陷型腺病毒的构建和鉴定

目的:构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。方法:用AdEasy-1TM系统,在大肠杆菌中同源重组,构建表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-LacZ)。重组腺病毒在HEK293细胞内包装并扩增,测定病毒滴度、电镜鉴定病毒存在、斑点杂交检测其复制缺陷性,然后感染HeLa细胞X-gal染色检测LacZ的表达情况。结果:成功构建了重组LacZ腺病毒表达载体,包装获得的重组腺病毒的滴度为1.58×109PFU/m l。在转染的细胞和感染的靶细胞内均可检测到LacZ的表达。电镜下可见感染的HEK293细胞核内含晶格状结构的腺病毒包函体。斑点杂交提示重组病毒为复制缺陷型,其基因转移百分率和感染强度和感染时间有一定的相关性。结论:成功构建了表达LacZ基因的复制缺陷型腺病毒。     

负载hTERT基因片段的慢病毒的包装及表达

目的构建编码人端粒酶逆转录酶（hTERT）的慢病毒载体，并测定其滴度，观察hTERT 基因在体外的表达情况。方法采用RT-PCR获得hTERT基因片段，插入转移载体L166，用CaCl2法L166-hTERT、L205、L311共转染293T细胞包装慢病毒，测定病毒滴度，免疫细胞化学法检测慢病毒感染的293T细胞中hTERT的表达。结果测序结果显示成功构建了重组质粒L166-hTERT，测定未经浓缩的病毒滴度为5.25×106IU/mL，免疫细胞化学法检测到慢病毒感染的293T细胞中hTERT呈阳性表达。结论成功构建了负载hTERT基因片段的慢病毒，hTERT能在感染的293T细胞中高效表达，表达持续2个月以上。     

携带hTERT I540-PTD表达框重组复制缺陷型腺病毒的构建与鉴定

目的：构建携带人端粒酶逆转录酶亚基（hTERT）I540-PTD,I540-PTD4融合基因表达框的重组复制缺陷型腺病毒.方法：将pDC315-I540-PTD,pDC315-I540-PTD4与腺病毒基因组质粒pBHGloxdeltaE13Cre共转染HEK293细胞,出现典型的细胞病变反应后收获细胞,反复冻融法制备病毒粗提液,经扩增和纯化获得重组复制缺陷型腺病毒Ad-I540-PTD和Ad-I540-PTD4.使用终点稀释实验和空斑形成实验测定纯化后病毒滴度.采用聚合酶链式反应（PCR）对Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4进行鉴定.使用病毒感染人骨肉瘤U2OS细胞后,进行免疫组化定性并观察I540-PTD,I540-PTD4的表达情况.结果：共转染10d后,HEK293细胞出现典型的细胞病变反应.经扩增、纯化后,终点稀释法和孔板形成法测定Ad-I540-PTD滴度分别为（8.9×10^12）,（6.3×10^12）pfu/L;Ad-I540-PTD4滴度分别为（5.8×10^12）,（5.4×10^12）pfu/L.以纯化的病毒为模板,使用自行设计的鉴定引物进行PCR均获得167bp目标片段.抗组胺酸标签抗体对病毒感染后的U2OS细胞免疫组化分析发现Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4转染的U2OS细胞均呈强染,表明Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4中携带的I540-PTD,I540-PTD4真核表达读框可在人类细胞内高效表达.结论：成功构建可高效表达I540-PTD,hTERTI540-PTD4的重组复制缺陷型重组腺病毒Ad-I540-PTD,Ad-I540-PTD4,为其作为基因疫苗诱发针对hTERT I540表位的抗瘤免疫奠定了基础.     

负载miR-138复制缺陷型腺病毒对hTERT表达的影响

目的探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达。方法 将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测BGC-823细胞内miR-138和hTERT mRNA的表达丰度;Western Blot检测hTERT蛋白表达。结果 与阴性对照腺病毒相比,负载miR-138的腺病毒感染BGC-823细胞后,可显著提高miR-138表达丰度(P<0.05);而未感染腺病毒的空白对照组与阴性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。与感染阴性对照腺病毒的BGC-823细胞相比,感染负载人miR-138腺病毒(Ad-miR138)的BGC-823细胞内hTERT蛋白表达有所下调。结论 以复制缺陷型腺病毒为载体,可有效上调hTERT调控相关miR-138的表达丰度,进而可有效抑制miR-138靶基因hTERT的表达水平。     

hTERT启动子调控腺病毒介导的CD基因治疗卵巢癌的实验研究

目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的复制缺陷型腺病毒载体,使CD基因只能在端粒酶阳性的细胞表达.方法:采用细胞内同源重组法构建出hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD,经PCR鉴定正确后进行扩增、纯化和滴度测定.分别将腺病毒感染人卵巢癌细胞株SKOV3及人胚肺成纤维细胞,MTT法检测受染细胞的存活率.结果:构建的重组腺病毒中带有hTERT启动子及CD基因.用不同滴度的重组腺病毒以及不同浓度的5-FC作用于SKOV3细胞后,MTT法检测到细胞的存活率随着病毒滴度和5-FC浓度的增加而不断降低;而同样的处理对人胚肺成纤维细胞的也有部分杀伤作用,但远较SKOV3细胞弱,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本实验构建的由hTERT启动子调控的携带CD基因的复制缺陷型腺病毒Ad-hTERTp-CD对SKOV3细胞具有靶向杀伤的能力.     

hTERT启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒载体的构建和制备

目的构建人端粒酶逆转录酶启动子驱动的HSV-TK基因重组腺病毒的真核表达载体,为进一步研究其在体内外实验提供依据。方法PDC312-TP质粒和PSUCMV-TK质粒经EcoR I,Sal I酶切连接构建PDC312-TP-TK,将质粒PDC312-TP-TK与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbhge3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经同源重组产生重组腺病毒PSG-TP-TK,PSG-TP-TK在293细胞中大量扩增并通过氯化铯密度梯度离心法纯化,测其滴度。结果质粒PDC312-TP-TK经酶切鉴定正确,扩增得到的PSG-TP-TK经PCR扩增证实为hTERT启动子驱动的HSV-TK重组腺病毒,腺病毒滴度为1.9×1010pfu/ml。结论该实验为重组腺病毒PSG-TP-TK用于肿瘤的基因治疗打下了基础。     

人端粒酶催化亚单位基因正反义腺病毒表达载体的构建及鉴定

目的: 构建hTERT正义和反义腺病毒表达载体. 方法: 用EcoRⅠ从pGRN145质粒上切下约3.5 kb的人端粒酶全长cDNA片段,然后连入pDC315质粒的EcoRⅠ酶切位点上,经BamHⅠ酶切鉴定出正义和反义表达载体,并对正反义重组质粒进一步测序鉴定其方向. 结果: 经BamHⅠ酶切后,正义质粒形成1.0 6.4 kb两条带. 反义重组质粒为1.0 2.5 3.9 kb三条带,与理论计算值完全一致,测序结果进一步确认了方向的正确性. 结论: 成功构建了hTERT的正、反义腺病毒表达载体.     

构建hTERT真核表达载体并转染人骨髓间充质干细胞

目的构建含人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的真核表达质粒并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法①目的基因的获得：用RT-PCR法从人食管癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段;②将hTERT基因片段插入pcDNA3.1后转化到大肠杆菌DH5α,阳性克隆酶切鉴定后测序分析;③大量提取质粒,非脂质体法转染hM-SC,并用G418筛选出阳性克隆。结果与结论pcDNA3.1/hTERT重组质粒构建成功,并能在hMSC中整合。     

携带hTERT基因的重组慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建携带人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的重组慢病毒载体,并鉴定其在HeLa细胞中的表达.方法 采用Gateway技术使克隆载体pENTR221-hTERT与慢病毒表达载体pLenti6.3/V5-DEST进行重组反应,构建重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT;将重组慢病毒载体与病毒包装质粒混合物pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染人胚肾293FT细胞,制备重组慢病毒颗粒;将重组慢病毒感染HeLa细胞,利用杀稻瘟菌素筛选阳性细胞克隆,PCR法检测外源hTERT基因在阳性细胞中的染色体整合状况,RT-PCR检测重组慢病毒感染对细胞hTERT基因mRNA表达的影响.结果 经鉴定,重组慢病毒载体pLenti6.3/V5-hTERT携带hTERT基因,hTERT基因包装至病毒颗粒.重组慢病毒感染HeLa细胞后,得到具有杀稻瘟菌素抗性的细胞克隆,其染色体DNA整合有外源hTERT基因,细胞内hTERT基因mRNA的表达水平高于未感染慢病毒的对照细胞.结论 成功构建了携带hTERT基因的重组慢病毒载体,能够提高HeLa细胞hTERT基因mRNA的表达量.     

人端粒酶逆转录酶与热休克蛋白70融合表达载体的构建及原核表达

目的:构建热休克蛋白70(HSP70)与人端粒酶逆转录酶融合表达载体,在大肠杆菌进行表达.方法:利用PCR方法扩增hTERT基因片段(532aa～637aa),双酶切后插入原核表达载体pET32a的Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ位点之间,形成pET32a-hTERT质粒.通过PCR方法扩增人HSP70全长cDNA.双酶切后插入pET32a-hTERT的EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ位点之间,构建hTERT与HSP70的N端融合基因原核表达质粒pET32a-hTERT-HSP70.含有该质粒的大肠杆菌BL21经异丙醛-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.结果:成功的扩增了HSP70基因与hTERT基因片段;测序结果表明成功的构建了pET32a-hTERT-HSP70原核表达载体.含有该质粒的大肠杆菌BL21经诱导后表达约110 kD的蛋白.结论:HSP70与人端粒酶逆转录酶融合表达质粒构建成功,并成功获得了融合蛋白hTERT-HSP70.     

HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒表达系统的构建与鉴定

目的：构建靶向结肠癌细胞的人端粒酶逆转录酶HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒并对该表达体系进行鉴定。方法：根据GenBank中的HTERT启动子（HTERTp）序列设计引物,以人胚肾293细胞提取基因组DNA为模板,PCR扩增HTERTp,并将HTERTp序列克隆入pDC312质粒中,构建成HTERTp调控的腺病毒质粒pSG—HTERTp;NK4 cDNA酶切并回收克隆至pSG—HTERTp载体中,构建成pSG—HTERTp／pA—NK4穿梭质粒,脂质体法在293细胞中包装重组腺病毒;噬斑分析法筛选单克隆重组腺病毒;RT-PCR检测NK4基因的转录;Western Blot检测NK4蛋白的表达。结果：成功构建出成功构建出HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒,滴度为4．5×10^9空斑形成单位（pfu）／mL,且PCR扩增及western bolt电泳均呈阳性表达。结论：成功构建出HTERT启动子调控的NK4基因重组腺病毒,为进一步研究NK4基因的作用机制打下实验基础。     

hTERT-逆转录病毒载体构建及其在脐血间质干细胞中的表达

目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(UCBMSCs)中导入hTERT基因,观察该基因的表达。方法:PCR法扩增出hTERT全部片断,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞,检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达。结论:hTERT-逆转录病毒载体构建成功,在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达。     

人端粒酶逆转录酶原核表达载体的构建

目的：构建人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT,并观察融合蛋白的表达。方法：用RT-PCR方法从人肝癌组织中扩增出带有EcoRⅠ酶切位点的hTERT基因片段,与pGEM-T Easy连接,转化感受态大肠杆菌JM109,经蓝-白筛选、PCR扩增等筛选阳性菌落,用EcoRⅠ酶切获取目的片段,并与EcoRⅠ酶切过的pGEX-4T-1质粒连接,重组子转化BL21感受态大肠杆菌,PCR扩增筛选出阳性菌落。基因测序并用Omega 2．0软件比较分析重组质粒中hTERT基因片段与GenBank中的已知序列的同源性。通过诱导pGEX-4T-1融合蛋白表达,用抗hTERT多抗对融合蛋白进行Western blot鉴定,薄层凝胶光密度扫描测定融合蛋白表达量。结果：PCR扩增等方法证实,人端粒酶逆转录酶原核表达载体pGEX-4T-1-hTERT构建成功,其中hTERT基因片段与GenBank中相应基因同源性为98．73％,氨基酸序列同源性为99．68％。Western blot检出GST-hTERT融合蛋白,其表达量达28．4％。结论：成功构建了pGEX-4T-1-hTERT原核重组质粒并获得高度表达。     

人IL-10基因重组复制缺陷型腺病毒DNA的构建

目的 构建人IL-10基因的重组腺病毒并进行体外表达和检测。方法从质粒pcDNA3IL-10的CMV启动子下游完整切下IL-10 cDNA的片段,将其定向插入Gateway载体,在克隆酶的作用下将阳性克隆质粒转入目的腺病毒载体。PacI酶线性化IL-10腺病毒DNA后阳离子质脂体转染293A细胞,获得人IL-10的复制缺陷型重组腺病毒。体外感染人胰腺癌细胞株Bxpc-3和大鼠胰腺细胞株AR-42J;Western blot检测人IL-10的表达。结果 成功地构建人IL-10重组腺病毒,病毒滴度达2×109PFU/mL。体外感染的细胞株均检测到IL-10的表达。结论 构建复制缺陷型重组腺病毒能够介导IL-10的基因表达,为细胞因子的抗炎冶疗奠定实验基础。     

p53重组腺病毒载体的构建

目的　构建 p5 3重组腺病毒载体以研究 p5 3过度表达与腺病毒感染对细胞生长的影响 .方法　将 p5 3c DNA克隆到转移载体 p Ad CMV/ p5 3重组质粒 ,用该重组质粒及p JM1 7质粒共转染 2 93细胞获得重组腺病毒 ,PCR法筛选含p5 3c DNA的重组病毒 .结果　在挑选的 5个空斑中 ,有 4个含 p5 3c DNA阳性重组腺病毒 .p5 3重组腺病毒可感染 2 93细胞并在 2 93细胞内进行有效的复制 .结论　成功构建了 p5 3重组腺病毒 ,为进一步研究 p5 3重组腺病毒的功能提供了条件     

人胎胃成纤维细胞hTERT和端粒酶的表达

目的：检测人胎胃成纤维细胞人端粒酶逆转录酶（hT ERT ）和端粒酶表达。方法分离培养人胎胃成纤维细胞,细胞角蛋白（CK）‐18免疫染色排除上皮细胞;免疫细胞化学方法检测hTERT表达;端粒重复序列扩增法（TRAP）检测端粒酶活性,成人胃成纤维细胞作阳性对照。结果分离的人胎胃成纤维细胞CK‐18免疫染色阴性;原位监测其胞质和胞核中均可见细颗粒状免疫荧光;端粒酶延伸片断长度约为170 bp ,稍长于成人胃成纤维细胞。结论人胎胃成纤维细胞表达hT ERT和端粒酶。