靶向Ku70重组腺病毒shRNA在C6胶质瘤细胞的表达

目的 研究重组腺病毒Ad—Ku70shRNA对C6胶质瘤细胞系Ku70蛋白表达的影响，探讨放射治疗过程中基因增敏的新途径。方法以穿梭质粒为基础，构建重组腺病毒Ad—Ku70shRNA载体，扩增并鉴定其病毒滴度。然后转染至C6鼠脑胶质瘤细胞中，应用WestemBlot及免疫荧光观察其Ku70蛋白的表达情况，研究重组腺病毒Ad—Ku70shRNA对C6细胞Ku70表达的抑制效果。结果成功构建并扩增Ad—Ku70shRNA重组腺病毒，感染C6胶质瘤细胞后Ku70的表达明显降低。结论Ad—Ku70shRNA重组腺病毒载体可以明显降低C6胶质瘤细胞Ku70的表达。该结果为放射治疗基因增敏研究提供了有利的工具。     

血红素加氧酶-1基因转染对神经元损伤的保护作用

目的观察腺病毒介导的血红素加氧酶-1（HO—1）基因转染大鼠后对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法雄性SD大鼠随机分为4组：假手术对照组（SH）、生理盐水组（V）、空载体组（Ad）和Ad—HO-1转染组（HO）。后三组在缺血前3d于右侧脑室部分别注射20μl生理盐水、含1μl空载体腺病毒（1．0×10^10plaque-forming unit／ml,PFU／ml）的生理盐水或含1μl重组HO-1腺病毒（1．0×10^10PFU／ml）的生理盐水,连续注射3d后,采用右侧大脑中动脉栓塞法（MCAO）建立脑缺血再灌注模型。每组大鼠测定神经功能后,处死大鼠并取全脑标本,测定右脑梗死体积及细胞凋亡指标,荧光显微镜下观察脑组织荧光蛋白的表达情况,Western blot检测脑组织HO-1的表达。结果HO组中HO-1表达量明显高于Ad组和V组,Ad组和HO组可见有荧光蛋白表达,转染率为34．5％±3．4％。HO组神经功能显著优于Ad组和V组（P〈0．001）。与SH组比较,V组、Ad组脑梗死体积、神经细胞凋亡明显升高。与V组及Ad组比较,HO组脑梗死体积显著减小（P〈0．01）、神经元凋亡显著减少（P〈0．01）。结论腺病毒携带的HO-1基因能有效的转染脑组织,并在脑内稳定表达;HO-1基因转染显著减轻脑缺血再灌注后神经细胞损伤。     

全反式维甲酸抑制大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖的实验研究

目的探讨全反式维甲酸对大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖的抑制作用及其机制。方法建立大鼠C6脑胶质瘤模型，腹腔注射全反式维甲酸后．MRI检测胶质瘤的体积变化、流式细胞仪检测细胞增殖时相变化及免疫组化检测p27Kip1蛋白的变化。结果治疗组较对照组肿瘤体积明显减小（P〈0．05）；G1期细胞比例明显增加（P〈0．05），S期细胞比例明显减少（P〈0．05）；p27Kip1蛋白的表达明显增加（P〈0．05）。结论全反式维甲酸通过上调p27Kip1蛋白的表达而抑制大鼠C6脑胶质瘤细胞增殖。     

RNAi抑制STAT3对胶质瘤干细胞的生长抑制作用

目的 建STAT3的RNAi载体干扰STAT3的表达,在体内外研究对胶质瘤干细胞的影响。方法 构建STAT3基因shRNA的腺病毒表达载体,感染人胶质瘤干细胞。采用RT -PCR、Western blot检测STAT3基因的干扰效果,用MTT和流式细胞仪检测干细胞的增殖、凋亡,并观察对荷瘤裸鼠的影响。结果转染重组腺病毒Ad - STAT3 siRNA后,胶质瘤干细胞的STAT3的mRNA表达率为(41.5±7.3)％,蛋白表达率为（31.2±6.4）％,细胞的增殖受到抑制,凋亡率为(23.8±6.1)％,同时荷瘤裸鼠的肿瘤生长受到抑制,生存期延长。结论重组腺病毒介导的STAT3 RNAi可显著抑制靶基因的表达与活化,显著抑制胶质瘤干细胞的生长功能,为基于胶质瘤干细胞的功能治疗提供了基础理论。     

重组腺病毒p27kip1诱导脑胶质瘤细胞凋亡的初步研究

目的研究重组腺病毒介导的p27kip1体外对U251人胶质瘤细胞凋亡的影响。方法构建p27kip1重组腺病毒载体转染U251人胶质瘤细胞为实验组,并设正常对照组、空载体组,采用Western blot法检测相关蛋白的表达;采用Real time PCR法检测相关基因的表达;采用流式细胞仪检测细胞增殖情况。结果 Western blot和Real time PCR结果均显示,实验组细胞经转染72h后,可见Bcl-2表达降低,同时Bax、Caspase3和Fas-L表达增强;流式细胞仪检测转染p27kip1腺病毒后能够抑制胶质瘤细胞的增殖。结论 p27kip1在体外能够抑制U251人胶质瘤细胞增殖,诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡。     

TIMP-2基因对人脑胶质瘤U87细胞周期与增殖的影响

目的探讨金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-2)对人脑胶质瘤细胞的抑制作用,主要是对细胞周期与细胞增殖的作用.方法用含TIMP-2基因的重组腺病毒载体,体外转染人胶质瘤细胞系U87,用Western blot检测目的蛋白的表达.通过细胞生长实验,流式细胞仪分析技术检测U87转染前后细胞增殖、周期与凋亡的变化.结果转染AdTIMP-2病毒后的U87细胞TIMP-2蛋白表达上调,转染后对U87细胞的生长有抑制作用,并出现明显的G0 -G1 期阻滞,但无明显的细胞凋亡峰出现.结论重组腺病毒载体介导的TIMP-2基因在体外对人脑胶质瘤细胞系U87 的生长有抑制作用,可作为胶质瘤治疗的有效工具.     

PEX基因修饰骨髓间质干细胞对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨PEX基因修饰的骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）对C6胶质瘤细胞的作用及机制。方法分子克隆技术构建PEX基因真核表达载体并转染MSC,G418筛选获取稳定表达PEX基因的MSC（MSC-PEX）,将不同数量的MSC-PEX细胞与C6胶质瘤细胞进行共培养试验,用水溶性四氮唑法（WST-1）观察MSC-PEX对C6胶质瘤细胞增殖的影响,用Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染荧光观察C6胶质瘤细胞凋亡的形态学变化,并用Annexin-Ⅴ-FITC/PI双标记法通过流式细胞仪检测胶质瘤细胞凋亡率。结果成功获得稳定表达PEX基因的MSC-PEX,MSC-PEX抑制C6胶质瘤细胞的生长作用较明显,Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染荧光发现C6胶质瘤细胞发生凋亡形态改变;流式细胞仪检测显示：MSC-PEX转染组和DMEM对照组的凋亡率分别为16.7%和1.3%,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论PEX基因修饰的骨髓间质干细胞抑制胶质瘤细胞增殖并诱导其凋亡,为胶质瘤的治疗奠定理论基础。     

腺病毒介导鼠内皮抑素基因对人血管内皮细胞系凋亡影响的实验研究

目的观察内皮抑素（End）基因表达对人血管内皮细胞（ECV304）凋亡的影响。方法实验分为空白对照组（PBS组）、携带绿色荧光蛋白基因的腺病毒对照组（Ad-GFP组）和腺病毒介导内皮抑素基因实验组（Ad-mEnd组），用流式细胞仪（FCM）测定EC304凋亡结果。结果ECV304细胞系在24h内即可出现明显的大批细胞凋亡，48-60h达到高峰，细胞周期分析图上可以见到明显的凋亡峰，G1期细胞比例增加。结论腺病毒携带的鼠内皮抑素基因可以明显增加ECV304细胞系的凋亡。     

PDGF-B链基因三链形成寡核苷酸对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的观察PDGF—B链基因三链形成寡核苷酸(triplex—forming oligonucleotide，TFO)对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法应用流式细胞技术观察TFO对C6胶质瘤细胞PDGF—B、PCNA表达的影响，应用流式细胞技术观察TFO对C6胶质瘤细胞凋亡的影响。结果TFO对C6胶质瘤细胞PDGF—B、PCNA的表达有明显抑制作用，而且抑制作用存在浓度依赖性。TFO有明显诱导C6胶质瘤细胞细胞凋亡作用，而且诱导作用存在浓度依赖性。结论TFO抑制C6胶质瘤细胞细胞增殖，同时诱导C6胶质瘤细胞细胞凋亡。     

大鼠增殖抑制基因通过Ras-Raf-MEK-ERK信号通路抑制C6胶质瘤细胞增殖

目的探讨Ras-Raf-MEK-ERK通路在大鼠增殖抑制基因(r HSG)抑制C6大鼠胶质瘤细胞增殖中的作用。方法用r HSG过表达腺病毒载体(Adv-r HSG-GFP)转染C6细胞后,流式细胞仪分析腺病毒转染效率;Western blot检测r HSG蛋白表达变化;流式细胞仪分析细胞周期;qRT-PCR检测H-ras、N-ras、K-ras、Erk1、Erk2基因mRNA表达变化;Western blot检测H-ras、N-ras、K-ras、p-Erk1/2、Erk1/2、p-Rb、Rb蛋白表达变化。结果腺病毒载体能高效的转染C6细胞并表达GFP蛋白,Adv-r HSG-GFP组r HSG蛋白表达显著高于未转染组(PBS)和AdvGFP组,C6细胞被阻滞于G0/G1期(P<0.01);经IGF-1刺激后,Adv-r HSG-GFP组细胞H-ras、N-ras、K-ras、Erk1、Erk2基因的mRNA和蛋白表达水平与PBS组和Adv-GFP组无明显差异(P>0.05);Adv-r HSG-GFP组细胞过表达r HSG能显著抑制IGF-1诱导的Erk1/2的活化,p-Erk1/2蛋白表达量显著低于其余两组(P<0.01);同时其p-Rb蛋白的表达量显著低于其余两组(P<0.01),而Rb蛋白表达量3组无明显差异(P>0.05)。结论 r HSG可能通过抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号通路的激活抗C6恶性胶质瘤细胞增殖。     

环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对体外培养的C6胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法以不同浓度塞来昔布分别作用于C6胶质瘤细胞不同时间段,采用甲基噻唑蓝比色法检测细胞活性,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡,并用光镜及透射电镜观察细胞形态学和超微结构的变化。结果经不同浓度塞来昔布作用后,C6胶质瘤细胞活性受到抑制,且呈剂量时间依赖性,实验组与对照组之间以及实验组各亚组之间均有显著性差异（P〈0.05）。细胞周期检测发现实验组S期细胞减少,G2期细胞显著增加,与对照组比较有显著性差异（P〈0.05）;同时,塞来昔布还可诱导C6胶质瘤细胞凋亡,凋亡率在实验组与对照组之间有显著性差异（P〈0.05）。结论选择性环氧化酶-2抑制剂塞来昔布可抑制C6胶质瘤细胞增殖,诱导C6胶质瘤细胞凋亡。     

外源性TRAIL基因转染对胶质瘤C6细胞凋亡的实验研究

目的探讨外源性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因对大鼠C6胶质瘤细胞的凋亡作用。方法C6细胞在杜伯改良的Eagle培养基（DMEM）,37℃,5％CO2条件下培养;质粒提取与转染;用HoeChst试剂盒检测C6细胞凋亡。结果转染重组质粒PDC315-TRAIL的C6细胞组凋亡率明显高于未转染的C6细胞组及转染空载体PDC315的C6细胞组（P〈0．05）。结论外源性TRAIL基因可引起C6细胞凋亡。     

腺病毒载体介导的RNAi对胶质瘤U251细胞肝细胞生长因子受体表达的影响

目的探讨腺病毒载体介导的RNA干扰技术对胶质瘤细胞肝细胞生长因子（HGF）受体（c—Met）的表达和细胞凋亡的影响。方法用PCR法获得人U6启动子及带有c—Met反向互补靶序列的片段HU6shmet：利用腺病毒载体将其传递至U251细胞；分别采用RT-PCR和Western blot方法检测U251细胞的c—Met mRNA和蛋白的表达．Annexin—V—PI双染法流式细胞术检测细胞的凋亡状况。结果获得了带有人U6启动子及c—Met反向互补靶序列的重组腺病毒载体rAdUshmet1和rAdUshmet2。转导了rAdUshmet1和rAdUshmet2的U251细胞的c—Met mRNA和蛋白相对表达量较未转导腺病毒及转导了rAdGFP和rAdU-sicon的U251细胞均有明显下降（P〈0．01），rAdUshmet1和rAdUshmet2转导的U251细胞凋亡率分别为（13．5±4．21％和（28．2±5．6）％，明显高于未转导腺病毒的及rAdGFP和rAdUsicon转导的U251细胞凋亡率（P〈0．05）。结论腺病毒载体rAdUshmet通过抑制HGF受体c—Met表达，能在一定程度上阻断HGF—c—Met信号通路，有可能成为对胶质瘤进行基因治疗的有效载体。     

hTERT反义cDNA对人脑胶质瘤细胞的抑制作用

目的探讨人端粒酶催化亚基(hTERT)反义cDNA(pAdeasy-hTERT)在体外对胶质瘤细胞生长的抑制作用。方法将腺病毒介导的pAdeasy-hTERT作用于人胶质瘤细胞系U251,用MTT法检测细胞存活率、端粒酶重复序列扩增法测定端粒酶活性、Westem杂交鉴定hTERT蛋白的表达、RT-PCR法检测hTERT cDNA水平、PCNA观察肿瘤细胞的凋亡情况以及用流式细胞仪对转染后肿瘤细胞的周期进行分析。结果pAdeasy-hTERT在体外明显抑制肿瘤细胞生长,降低端粒酶活性,抑制hTERT表达。结论pAdeasy-hTERT显著抑制人胶质瘤细胞生长,可成为恶性胶质瘤基因治疗的靶基因。     

替莫唑胺及甲泼尼龙对人胶质瘤细胞放射治疗敏感性的影响

目的探讨替莫唑胺（TMZ）和甲泼尼龙（MP）对人胶质瘤细胞系U251放射治疗敏感性的影响,以期为临床优化治疗方案提供依据。方法经体外传代培养的U251细胞根据治疗方案的不同,分为对照组、放射治疗（R）组、放射治疗＋替莫唑胺（R＋TMZ）组、放射治疗＋甲泼尼龙（R＋MP）组、放射治疗＋替莫唑胺＋甲泼尼龙（R＋TMZ＋MP）组,分别予以放射治疗（2Gy／24h）、替莫唑胺、甲泼尼龙及三者联合治疗。采用磺酰罗丹明B（SRB）比色法、流式细胞术和Western blotting法分析U251细胞增殖率和凋亡率,观察凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达变化。结果放射线照射联合甲泼尼龙治疗后,U251细胞存活率明显升高（均P=0．000）;但经体外培养24和48h后,三者联合治疗组（R＋TMZ＋MP组）U251细胞增殖率显著高于放射治疗联合替莫唑胺组（P=0．000）。除对照组外,不同抗肿瘤治疗组U251细胞凋亡率均呈现升高趋势（P=0．000）,但放射治疗联合甲泼尼龙组细胞凋亡率显著低于其他各组（均P=0．000）。经放射线照射联合替莫唑胺和三者联合治疗后,U251细胞Bax蛋白表达水平升高（P=0．000）,而放射线照射联合甲泼尼龙和三者联合治疗,Bcl-2蛋白表达水平升高;其中以放射治疗联合替莫唑胺组Bax／Bcl-2比值最高（P=0．000）,放射治疗联合甲泼尼龙组最低（P=0．000）。结论甲泼尼龙可以诱导人胶质瘤细胞产生放射抵抗,而替莫唑胺对甲泼尼龙诱导的放射抵抗具有增敏作用。提示：胶质母细胞瘤患者在应用甲泼尼龙减轻放射治疗不良反应过程中所诱导的放射治疗抵抗可通过同时应用替莫唑胺而抵消。     

LRIG2基因全长及胞外段对胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2（LRIG2）基因全长及胞外段对脑胶质瘤细胞系U251细胞增殖和凋亡的影响。方法将LRIG2全长,LRIG2胞外段（LRIG2_ecto）及空白质粒（对照）经慢病毒法分别转染胶质瘤细胞系U251细胞,筛选稳定细胞株,实时PCR及免疫印迹法检测mRNA及蛋白表达,细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖,流式细胞分析检测细胞周期及细胞凋亡。结果两转染组Flag标签蛋白表达成功;两转染组LRIG2全长及LRIG2_ectomRNA表达较对照组明显升高（氏0．01）;两转染组细胞增殖率均明显高于对照组（P〈0．01）;两转染组s期与G2/M期细胞数之和（即细胞增殖指数）均明显高于对照组（P〈0．01）,而细胞凋亡率均明显低于对照组（P〈0．05）。结论LRIG2基因全长及LRIG2_ecto促进胶质瘤细胞增殖,并将细胞周期阻滞于G2/M期,抑制细胞凋亡。     

苯乙酸对胶质瘤C6细胞增殖和凋亡的影响

目的观察诱导分化剂苯乙酸（PA）对胶质瘤C6细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养胶质瘤C6细胞，用0、2．5、5．0和7．5mmol／L不同浓度的PA，分别在PA诱导24、48、72、96h后。甲基噻唑基四唑（MTT）比色法检测细胞增殖抑制率，进一步用免疫细胞化学检测胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达变化，末端脱氧核糖核酸转移酶介导的脱氧尿嘧啶核苷酸缺口末端标记（TUNEL）检测细胞凋亡。结果PA显著抑制c6细胞增殖，随药物浓度的增加和作用时间的延长，细胞增殖抑制率增加。PA作用后GFAP表达增强。随PA浓度和作用时间的增加，细胞凋亡率增加。结论PA对胶质瘤C6细胞有显著的增殖抑制和诱导凋亡作用，呈时间剂量依赖性。     

携带hIFN-β的骨髓间充质干细胞体外抑制C6胶质瘤细胞

目的研究携带人β干扰素基因（hIFN-β）的重组腺病毒转染骨髓间充质干细胞（MSCs-hIFN-β）以及其在体外抑制大鼠C6胶质瘤细胞。方法转染的MSCs行PT-PCR检测细胞内hIFN-βmRNA的表达;ELISA法检测培养液上清hIFN-β的分泌情况;MTT法检测细胞活力并绘制转染后MSCs生长曲线,MSCs-hIFN-β和C6胶质瘤细胞体外共培养,检测C6胶质瘤细胞活力和共培养液上清hIFN-β含量。结果 Ad-hIFN-β转染的MSCs分化后有绿色荧光蛋白表达,RT-PCR证实MSCs中有hIFN-βmRNA表达,ELISA测定显示MSCs分泌hIFN-β,而且转染MSCs的增殖能力无改变。体外共培养发现C6胶质瘤细胞的生长被不同程度的抑制,C6胶质瘤细胞培养上清hIFN-β的含量随着MSCs-hIFN-β的密度增加而增加。结论在体外MSCs-hIFN-β能抑制大鼠C6胶质瘤细胞的增殖。     

反义AKT2 cDNA治疗C6胶质瘤的体内外实验研究

目的研究反义AKT2(antisense AKT2，AS—AKT2)cDNA对鼠脑胶质瘤细胞系C6的生长抑制作用。方法将AS—AKT2 cDNA构建体转染鼠脑胶质瘤细胞系C6，原位杂交和蛋白印迹鉴定后，应用PCNA阳性率和MTT法检测细胞增殖能力，TUNEL法计算凋亡指数。应用立体定向技术将C6细胞和转染反义AKT2 cDNA的C6细胞种植到SD大鼠的右侧尾状核作为对照组和转染组；并对颅内已经形成C6胶质瘤的大鼠进行脂质体包裹的AS—AKT2 cDNA和空载体治疗；MRI动态监测大鼠颅内肿瘤生长情况，并检测标本AKT2和PCNA表达以及细胞的凋亡情况。结果转染AS—AKT2 cDNA后C6细胞AKT2表达显著抑制，增殖减慢，凋亡指数增加。反义治疗组和转染组大鼠生存时间明显延长；转染组和治疗组肿瘤标本AKT2表达下降或消失，PCNA阳性率降低，可见大量凋亡细胞，而对照组和空载组标本几乎没有凋亡细胞。结论体内外实验证明AS—AKT2 cDNA可以抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，AKT2可作为基因治疗胶质瘤的重要优选靶的。     

TRAIL腺病毒增强胶质瘤对顺铂的化疗敏感性研究

目的 探讨TRAIL腺病毒增强胶质瘤对顺铂的化疗敏感性.方法 制备TRAIL腺病毒,转染胶质瘤U251,流式细胞仪和MTT法检测顺铂作用于U251细胞后各组细胞的凋亡率和增殖率.结果 本研究成功将腺病毒转染进胶质瘤U251细胞,其转染率为82.1%.TRAIL腺病毒转染胶质瘤U251 后,细胞凋亡率增加为(34.2±5.8),%细胞生长缓慢,基本上处于抑制状态.结论 TRAIL腺病毒能显著增强U251细胞对顺铂的敏感性,为胶质瘤的基因治疗提供了理论依据.

Abstract：

Objective To investigate the effect of adenovirus TRAIL on the sensitivity of glioma cells to DDP chemotherapy. Method The adenovirus TRAIL was prepared and transduced into U251 glioma cells. After DDP treatment, the apoptosis and viability of glioma cells were analyzed by FCM and MTT assays. Results The adenovirus could transduce into U251 cell with the efficiency of 82. 1 %. After adenovirus TRAIL transduction, the apoptosis rate of glioma cells was increased to ( 34. 2 ± 5. 8) % , and the cell proliferation was inhibited after DDP treatment Conclusions Adenovirus TRAIL could increase the apoptosis and sensitivity of glioma cells to chemotherapy,which may povide an ideal strategy for glioma cell gene theray.