99Tcm-TP1093的制备及其在健康动物体内的生物分布及动力学特点

目的 制备标记率符合显像要求的99Tcm-TP1093,探讨其在健康动物体内的生物分布及动力学特点.方法 化学合成G(D) AGG-Aba-ATAQSAYG-NH2(TP1093);氯化亚锡还原法99Tcm标记TP1093,纸层析测定标记率,计算比活度;体外稳定性实验、血清蛋白结合实验及脂/水分配实验鉴定99Tcm-TP1093的理化性质;研究标记多肽在健康家兔体内的示踪动力学和正常小鼠体内生物分布;健康家兔99Tcm-TP1093显像,观察体内放射性动态分布变化,利用感兴趣区(region of interest,ROI)技术分析重要组织器官的时间-放射曲线(time-activity curve,TAC).结果 99Tcm-TP1093的标记率为(97.23±0.87)％,比活度为(15.91±0.62) TBq/mmol.标记多肽室温放置4h,其放射化学纯度为(93.34±0.91)％.标记多肽与血清蛋白无明显结合,脂/水分配系数lgP=-(1.68±0.09).标记多肽在健康家兔体内的动力学过程符合权重为1/c的二室模型,t1/2α为(2.689 ±0.541) min,t1/2β为(69.156±20.342) min,总清除率(CL)为(5.029±4.381)mL/kg.小鼠体内分布和健康家兔显像示:血液放射性清除迅速,软组织放射性消退快;胃区呈放射性缺损,甲状腺区未见异常放射性浓聚,脑呈低放射性分布;体内放射性主要经泌尿系统排泄,少量通过肝胆系统分泌.结论 99Tcm-TP1093标记方法简便,标记率与比活度高,可制备成一步法冻干药盒,具有良好的稳定性、体内生物分布及动力学性质.     

Preparation of 99Tcm-TP1326 targeting integrin αv β3 receptor and its imaging in rabbits

目的 制备99Tcm-TP1326,鉴定其理化性质,研究其在兔体内的示踪动力学及组织器官分布特点.方法 化学合成制备GA(D) GG-Aba-RGD-4CK( TP1326),并以氯化亚锡为还原剂进行99Tcm标记,纸层析法测定标记率;采用体外稳定性实验、血清蛋白结合实验及油/水分配实验鉴定标记物的理化性质;测定标记物经健康大耳兔静脉注射后不同时相血液放射性浓度,利用药代动力学分析软件判断其最佳房室模型,并得出药代动力学参数;经健康兔耳缘静脉注射99Tcm-TP1326,SPECT动态显像,观察主要组织器官的放射性分布变化.结果 99Tcm-TP1326的标记率为(95.86±0.83)％,比活度为(38.62±0.32) TBq/mmol.室温放置4h后放化纯度为(91.76±2.75)％;柱层析未见蛋白结合放射峰;油/水分配系数为-(1.76±0.06).99Tcm-TP1326在健康兔体内动力学符合权重为1/c的二室模型,t1/2αt1/2β分别为(3.115±0.771)、(76.978±22.460)min.SPECT显像示血池影消退迅速,放射性主要经肾脏清除,肠道、胃区、颈部未见明显放射性浓聚,脑呈低放射性本底.结论 99Tcm-TP1326标记方法简便,标记率高,体内外稳定性好,动力学特性优良,血液清除快,主要通过泌尿系统排泄,是一种具有潜在应用价值的肿瘤αvβ3受体分子显像剂.     

~(99)Tc~m-MAG_3-K237的制备及其在健康动物体内的药代动力学和分布研究

目的探讨99Tcm标记血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR-2,KDR)小分子拮抗肽K237的方法,研究标记物在健康动物体内的药代动力学特性及体内分布特点。方法化学方法合成制备MAG3-K237,并用99Tcm标记;鉴定标记物的理化性质;测定标记物经新西兰大白兔静脉注射后不同时相血液放射性浓度,得出最佳房室模型与药代动力学参数;分别测定经尾静脉注射7.4MBq标记物后的昆明小鼠各器官质量和放射性计数,经参考源校正后计算各脏器每克组织百分注射剂量率(%ID/g);经耳缘静脉注射37MBq标记物,在SPECT下观察其在兔体内的动态分布。结果99Tcm-MAG3-K237的放化纯度为(97.98±0.76)%,比活度为(3.54±0.03)TBq/mmol;室温(25℃)下保存8h后放化纯度为(96.15±0.37)%;半胱氨酸置换率为0.2%～0.37%;不与血清蛋白结合;兔体内动力学过程符合权重为1/c2的三室模型,快分布相半衰期(t1/2α)、慢分布相半衰期(t1/2β)及消除相半衰期(t1/2γ)分别为(4.00±3....     

99Tcm-RGD-4CK在健康家兔体内的示踪动力学研究

目的 探讨99Tcm-RGD-4CK在健康日本大耳兔体内的示踪动力学.方法 采用预锡化法99Tcm直接标记RGD-4CK.静脉注射99Tcm-RGD-4CK 37 MBq(0.5 ml),在注射后1.5～240 min时间内分10个时相点采血并称重,测定血样品放射性计数,结果经参考源衰减校正,最后换算为kBq/ml血液.血样放射性活度数据应用DAS软件处理,结合αvβ3受体在正常体内实际表达情况进行室模型判断,并得出相应的示踪动力学参数.结果 99Tcm-RGD-4CK的标记率为(96.86±1.24)%,比活度为(13.01±0.17)TBq/mmol.99Tcm-RGD-4CK在正常家兔体内符合二室模型示踪动力学过程(权重数为1/C).分布相半衰期(T1/2α)为(4.19±2.17)min,消除相半衰期(T1/2β)为(69.32±0.00)min,转运速率常数K10、K12与K21分别为(0.013±0.002)、(0.138±0.139)、(0.095±0.063)/min,清除率(CL)为(2.00±1.00)ml/min.结论 99Tcm-RGD-4CK制备方法简便,标记率高,无需分离纯化而直接应用;99Tcm-RGD-4CK在正常家兔体内的示踪动力学符合权重数为1/C的二室模型.     

~(99)Tc~m-EGFR-McAb及~(99)Tc~m-CD44-McAb单独及联合用于荷人肺腺癌裸鼠的显像研究

目的 评价99Tcm-EGFR-McAb及99Tcm-CD44-McAb单独及联合应用于荷人肺腺癌裸鼠的放射免疫显像效果.方法 建立荷人肺腺癌裸鼠动物模型;采用直接法99Tcm标记抗EGFR和CD44的单克隆抗体,运用柱层析法对标记抗体分离、纯化,并对标记、纯化后的抗体特性进行鉴定;利用99Tcm-EGFR-McAb及99Tcm-CD44-McAb单独及联合进行倚人肺腺癌裸鼠显像及体内分布研究.结果 99Tcm对EGFR-McAb和CD44-McAb的标记率分别为(91.5±3.8)%、(92.3±4.1)%,标记抗体比活度分别为(2.8±0.3)MBq/μl、(2.9±0.5)MBq/μl,放射化学纯度分别为(96.5±2.8)%、(96.2±3.1)%.放射免疫显像结果显示,肿瘤组织对2种标记抗体均有较高的摄取,2种标记抗体联合使用肿瘤部位的放射性浓聚明显高于2种标记抗体单独使用,通过ROI技术测得T/NT值分别为(5.58±0.46)、(2.72±0.22)、(2.30±0.18).标记抗体的体内分布规律与显像结果一致.结论 99Tcm-EGFR-McAb、99Tcm-CD44-McAb用于荷人肺腺癌裸鼠的放射免疫显像能得到较理想的靶/非靶比值,2种标记抗体的联合应用,可在一定程度上提高靶/非靶比值,优于一种标记抗体的单独使用.     

99Tcm-MPO用于早期心肌灌注显像的动物实验研究

目的 :制备99mTc-2-巯基吡啶N-氧化物-N-乙氧基乙基-N,N-二[2-(二(3-甲氧基丙基)膦)乙基]胺([99mTcN(MPO)(PNP5)]+,简称99Tcm-MPO),考察其体内生物分布及其作为新型心肌灌注示踪剂的应用价值。方法 :二步法合成99TcmMPO,采用高效液相色谱仪(HPLC)分析其标记率及体外稳定性,鼠尾静脉注射99Tcm-MPO(3.7 MBq)后不同时间进行生物学分布研究,新西兰兔耳缘静脉注射99Tcm-MPO后行单光子发射断层扫描(SPECT)平面序列显像,以99Tcm-替曲膦(37 MBq)和99Tcm-甲氧基异丁基异腈(99Tcm-MIBI,37 MBq)为对照组;实验小型猪冠状动脉左回旋支(LCX)球囊血流阻断后,静脉注射99Tcm-MPO后15、60 min分别行心脏灌注显像(MPI)显像。结果:99Tcm-MPO标记率为(98.8±1.0)%,体外放置12 h放化纯为(96.5±0.8)%。体内生物分布显示:5 min时,99Tcm-MPO肾脏摄取与99Tcm-替曲膦类似,均低于99Tcm-MIBI,99Tcm-MPO肝脏摄取为(30.38±0.43)%ID/g,略高于99Tcm-MIBI和99Tcm-替曲膦,但99Tcm-MPO肝脏排泄快,15 min时99Tcm-MPO心脏摄取(9.38±0.70)%ID/g略低于99Tcm-MIBI,但差异无统计学意义,而99Tcm-MPO心/肝比值(2.21±0.44)明显高于99Tcm-MIBI(0.62±0.02)和99Tcm-替曲膦(0.89±0.06,F=22.29,P=0.016);静脉注射99Tcm-MPO后5 min兔平面显像可见心、肝清晰显影,15 min肝脏放射性摄取显著降低,心/肝比值为(0.85±0.32),高于99Tcm-MIBI(0.71±0.15)和99Tcm-替曲膦(0.59±0.64),差异无统计学意义。猪心肌缺血模型SPECT/CT显像示注射后15 min外侧壁心肌可见99Tcm-MPO明显放射性缺损区,心/肝比值与60 min差异无统计学意义。结论:99Tcm-MPO作为新型心肌显像剂,心脏摄取多,肝脏清除快,15 min心/肝放射性摄取高于99Tcm-MIBI和99Tcm-替曲膦,预期可用于早期心肌灌注显像,具有良好的临床应用前景。     

99Tcm标记Gd-DTPA-DG及其在裸鼠体内的生物分布

目的 探讨锝(99Tcm)标记顺磁性脱氧葡萄糖类MRI对比剂二乙三胺五乙酸-脱氧葡萄糖钆盐(Gd-DTPA-DG)的稳定性及在荷瘤裸鼠体内的生物分布,寻找一种核素与磁共振双模式影像探针.方法 对 Gd-DTPA-DG进行99Tcm标记,并对需要的Gd-DTPA-DG、氯化亚锡(SnCl2·2H2O)用量,pH,温度采用正交实验设计,确定最佳标记条件.采用薄层纸层析法(TLC)分析标记率,体外放置6 h,观察标记物的稳定性.将标记的99Tcm -Gd-DTPA-DG注入裸鼠体内,10、30 min及1、2、4、24 h后断头处死裸鼠,测定血液、心脏、脑、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、肌肉、肿瘤中的每克组织百分注射剂量率(%ID/g).结果 取10 mg Gd-DTPA-DG、0.6 mg SnCl2·2H2O,在pH值小于2时加入新淋洗的Na99TcmO4洗脱液(37 MBq),沸水反应30 min所得99Tcm -Gd-DTPA-DG放化纯度最高,可达98.5%,体外放置6 h,放化纯度仍大于96%.尾静脉注射99Tcm -Gd-DTPA-DG 2 h后,裸鼠肿瘤组织的摄取率约为(1.48±0.12)%ID/g,肿瘤与肌肉的放射性摄取比(T/NT)达2.91.结论 采用放射性核素99Tcm标记顺磁性对比剂Gd-DTPA-DG 简单易行;荷瘤裸鼠模型显示其具有良好的肿瘤靶向性,有望成为一种极具发展潜力的新型单光子发射计算机断层显像(SPECT)-MRI双模式影像探针.     

99mTc标记的新型肺癌多肽分子探针及其生物学分布

目的探讨99mTc标记特异性靶向肺癌小分子多肽的标记方法,观察99mTc-多肽在正常动物体内的动力学特性及体内生物学分布特点。方法采用NHS-MAG3双功能螯合法进行99mTc标记小分子多肽(cNGQGEQc),纸层析法测定标记率,通过体外稳定性实验、半胱氨酸置换实验及血清蛋白结合实验评价99mTc-多肽的放化特性,测定标记物静脉注射后在新西兰大白兔不同时相血液放射性清除曲线;分别测定经尾静脉注射7.4 MBq标记物后的小鼠体内各脏器质量数和放射性计数,计算各脏器每克组织百分注射剂量率(%ID/g);经耳缘静脉注射37 MBq标记物,应用SPECT显像法观察标记物在大白兔体内的放射性动态分布变化。结果99mTc标记多肽的标记率>90%,室温下和血清中37℃下放置12 h放化纯度分别为91%和85%;半胱氨酸置换率<7%;血清蛋白结合率<5%。99mTc标记多肽在兔体内血放射性清除迅速;在小鼠体内清除较快,主要通过肾脏排泄,其余脏器内放射性均较低(P<0.05)。结论99mTc标记基于肺癌特异性靶向多肽的标记方法简单,标记率高,具有良好的体内外稳定性,具有比较理想的体内分布动力学特性。     

放射性核素示踪法对多肽VEGF125-136在家兔体内的药代动力学研究

目的 探讨VEGF125-136在家兔体内的药代动力学.方法 采用放射性核素99Tcm对VEGF125-136进行间接标记.测定6 只家兔静脉注射37 MBq 99Tcm-VEGF125-136后不同时间血浆中药物的放射性浓度,用DAS软件编制放射性浓度-时间曲线,并计算药代动力学参数.结果 99Tcm-VEGF125-136的放射化学纯度大于97%,99Tcm-VEGF125-136在家兔体内的代谢符合三室模型,快分布相半衰期(t1/2α)为(5.327±2.351) min,慢分布相半衰期(t1/2β)为(26.446±6.502) min,消除相半衰期(t1/2γ)为(304.41±216.811) min,转运速率常数K10、K12、K21 、K31 及K13分别为(0.047±0.034)、(40.65±68.54)、(0.111±0.058)、(0.111±0.058) min-1及(0.002±0.004) min-1,清除率(CL)为(4.00±1.00) ml/min.结论 VEGF125-136在家兔体内的药代动力学符合三室模型,且血液清除快而周边血管丰富的组织停留时间相对较长.     

99mTc标记的新型肺癌多肽分子探针及其生物学分布

目的探讨99mTc标记特异性靶向肺癌小分子多肽的标记方法,观察99mTc-多肽在正常动物体内的动力学特性及体内生物学
分布特点。方法采用NHS-MAG3双功能螯合法进行99mTc标记小分子多肽（cNGQGEQc）,纸层析法测定标记率,通过体外稳定
性实验、半胱氨酸置换实验及血清蛋白结合实验评价99mTc-多肽的放化特性,测定标记物静脉注射后在新西兰大白兔不同时相
血液放射性清除曲线;分别测定经尾静脉注射7.4 MBq标记物后的小鼠体内各脏器质量数和放射性计数,计算各脏器每克组织
百分注射剂量率（%ID/g）;经耳缘静脉注射37 MBq标记物,应用SPECT显像法观察标记物在大白兔体内的放射性动态分布
变化。结果99mTc 标记多肽的标记率>90%,室温下和血清中37 ℃下放置12 h 放化纯度分别为91%和85%;半胱氨酸置换率
<7%;血清蛋白结合率<5%。99mTc标记多肽在兔体内血放射性清除迅速;在小鼠体内清除较快,主要通过肾脏排泄,其余脏器内
放射性均较低（P<0.05）。结论99mTc标记基于肺癌特异性靶向多肽的标记方法简单,标记率高,具有良好的体内外稳定性,具有
比较理想的体内分布动力学特性。
     

Screening of TACE Peptide Inhibitors from Phage Display Peptide Library

Summary： To obtain the recombinant tumor necrosis factor-α converting enzyme （TACE） ectodomain and use it as a selective molecule for the screening of TACE peptide inhibitors, the cDNA coding catalytic domain （TS00） and full-length ectodomain （T1300） of TACE were amplified by RT-PCR, and the expres.sion plasmids were constructed by inserting T800 and T1300 into plasmid pET-28a and pET-28c respectively. The recombinant TS00 and T1300 were induced by IPTG, and SDS-PAGE and Western blotting analysis results revealed that TS00 and T1300 were highly expressed in the form of inclusion body. After Ni^2＋-NTA resin affinity chromatography, the recombinant proreins were used in the screening of TACE-binding peptides from phage display peptide library respectively. After 4 rounds of biopanning, the positive phage clones were analyzed by ELISA, competitive inhibition assay and DNA sequencing. A common amino acid sequence （TRWLVYFSRPYLVAT） was found and synthesized. The synthetic peptide could inhibit the TNF-α release from LPS-stimulated human peripheral blood mononuclear cells （PBMC） up to 60.3%. FACS analysis revealed that the peptide mediated the accumulation of TNF-α on the cell surface. These results demonstrate that the TACE binding peptide is an effective antagonist of TACE.     

应用噬菌体随机十二肽库筛选hFGF 7相关模拟肽

目的应用噬菌体随机十二肽库生物淘选具有刺激表皮细胞增殖作用的人成纤维细胞生长因子 7(hFGF 7)噬菌体模拟肽。方法以hFGF 7单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选噬菌体随机十二肽库;随机挑取单克隆噬菌体,应用ELISA方法检测单克隆噬菌体的结合力,对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,并行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得11个与促进细胞分裂、增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与hFGF 7相关的噬菌体模拟肽,其中部分噬菌体模拟肽可能会促进表皮细胞增殖,期望将来可应用于促进创面愈合。     

利用噬菌体肽库技术筛选卵巢特异的VEGFR3亲和肽

目的从噬菌体12肽库中筛选VEGFR3胞外区蛋白高亲和肽作为卵巢癌淋巴管上皮细胞潜在靶向载体。方法用噬菌体展示固相结合法,生物淘选与扩增。经过4个循环的筛选,利用ELISA法鉴定噬菌体单克隆的亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体融合蛋白的DNA序列,竞争法ELISA检测优势克隆与靶蛋白的特异性。结果经过4轮筛选,噬菌体出现良好的富集,选择8个阳性克隆测序,经测序5个克隆插入短肽是(WHGSLKQNLWWY),竞争性ELISA显示其与VEGFR3具有良好的亲合性,并能被VEGF-D分子抑制。结论噬菌体12肽库筛选的VEGFR3高亲和多肽(WHGSLKQNLWWY),可望成为靶向载体构建的结构基础。     

利钾尿肽与心钠素在急性脑血管疾病中的作用

目的：探讨利钾尿肽（KP）与心钠素摩尔比在急性脑血管疾病（ACVD）中的意义。方法：用放射免疫分析方法测定34例ACVD患者发病没时期血浆KP和心钠素（ANP）含量。结果：急性脑血管疾病患者在发病第7天血管KP水平升高、病程中ANP含量明显升高（P＜0．05），病程第1天、第3天KP与ANP摩尔比显著低于对照组（P＜0．05）。结论：KP、ANP含量及KP与ANP比例关系的改变在脑血管疾病病理生理中起着一定的作用。     

乙肝治疗性疏水肽胰蛋白酶消化肽图的LC-MS验证

目的：验证乙肝治疗性疏水肽胰蛋白酶消化反相高效液相色谱（RP－HPLC）特征肽图的可信度。方法：采用液质联用的方法对胰蛋白消化后的多肽片断进行质量解析。结果：乙肝治疗性疏水肽的胰蛋白酶切片段与理论上计算值相符。结论：通过直接采用疏水肽悬液制作乙肝治疗性疏水肽胰蛋白酶RP－HPLC肽图的方法切实可行。     

以小鼠精子/睾丸特异性抗原为基础的合成肽免疫避孕效应研究

目的：研制以精子/睾丸特异性抗原为基础的多价嵌合肽避孕疫苗。方法：选择小鼠精子/睾丸特异性抗原Sp17、Gy-ritestin作为对象，采用分子设计的方法与外源性牛核糖核酸酶非选择性T细胞表位组合合成新型嵌合肽-35肽，并对其免疫效应进行研究。结果：该嵌合肽可刺激小鼠产生较高效价的血清和阴道粘膜特异性抗体，诱导脾脏淋巴细胞增殖，促进细胞因子IL-4的分泌；将其与佛氏佐剂混悬，免疫雌性BALB/c小鼠可明显降低受孕率和每胎产仔率，其抗血清可显著抑制体外精-卵结合和融合。结论：新型嵌合肽具有较明确的抗生育作用，提示以分子设计、蛋白质优化方案进行多价避孕疫苗的研究是可行的。     

从噬菌体随机十二肽库中筛选乙酰胆碱酯酶的抑制肽

目的从随机肽库中筛选乙酰胆碱酯酶（ACHE）的抑制性多肽。方法以人AChE作为靶标，应用噬菌体随机12肽库进行筛选，经过3轮筛选，对阳性克隆进行测序并进行序列分析及抑酶活性测定。结果筛选得到6个能与人AChE较强结合的噬菌体克隆，其中有4个克隆可以抑制AChE的酶活性，其保守序列为W（S／P）HY。结论通过噬菌体肽库技术能够筛选到抑制人AChE活性的多肽，为进一步研究AChE的多肽抑制剂奠定了基础。     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

哑铃型树枝状多肽大分子的合成

目的：合成哑铃型树枝状多肽大分子。方法通过引入小分子化合物Fmoc-Gly-OH作为连接臂,高产率得到双端氨基化聚乙二醇（NH2-CH2-COO-PEG2000-OOC-CH2-NH2）;然后再分别以双芴甲氧羰基保护的赖氨酸〔Fmoc-Lys（Fmoc）-OH〕、芴甲氧羰基及叔丁氧羰基保护的赖氨酸〔Fmoc-Lys（Boc）-OH〕为支化单元,采用液相发散法合成了表面富含氨基的哑铃型PEG/赖氨酸树枝状大分子共聚物。结果和结论利用1H NMR和MS对中间产物及终产物的结构和相对分子质量进行表征,结果表明成功合成了哑铃型树状多肽大分子,为其在生物医学领域的应用打下基础。