姜黄素对胃癌细胞P300、P53、c-myc及乙酰化组蛋白H3和H4表达的影响

目的了解姜黄素对胃癌细胞P300、P53、c-myc以及乙酰化组蛋白H3和H4表达的影响,探讨其抗胃癌的分子机制.方法用不同浓度的姜黄素作用人胃腺癌细胞系SGC-7901,作用24、48 h后,Rt- PCR法检测P300、P53、c-myc mRNA的表达;蛋白免疫印迹法检测乙酰化组蛋白H3、H4、P300、P53、c-myc蛋白的表达.结果在胃癌细胞SGC-7901中P300和c-myc 的表达随姜黄素浓度的改变而改变,在20 μmol/L 24 h时抑制作用较为明显,且两者具有相关性(r=0.976),而野生型p53则没有明显变化;姜黄素对乙酰化的组蛋白H3、H4都有抑制作用.也以20 μmol/L 24 h的作用最强.结论姜黄素能抑制P300表达,进而抑制组蛋白H3和H4的乙酰化以及原癌基因c-myc的表达,但不影响抑癌基因P53的表达.提示姜黄素抑制组蛋白乙酰化酶P300可能是其抗癌的分子机制之一.     

P300/CBP相关因子在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的：检测P300/CBP相关因子（P300/CBP-associated factor,PCAF）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）中的表达情况,分析其与肝癌临床病理特征之间的相关性。方法：收集40例HCC及对应癌旁组织,运用RT-PCR、免疫组化技术检测PCAF在肝癌及对应癌旁组织中的表达情况,研究PCAF蛋白表达与肝癌临床病理特征之间的相关性;应用Western blot技术检测人正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中PCAF蛋白的表达。结果：PCAF mRNA及蛋白在肝癌组织中的表达低于对应的癌旁组织（P=0.000）;PCAF蛋白低表达与肿瘤肝内转移（rs=0.413,P=0.037）、门脉侵犯（rs=0.589,P=0.011）和高TNM分期（rs=0.513,P=0.029）相关;人肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721中PCAF 蛋白的表达较正常肝细胞株LO2降低（P=0.000）。结论：肝癌细胞系及肝癌组织中PCAF表达下调,且PCAF的表达下调与肝癌的恶性病理特征相关。     

p300特异性siRNA载体的构建及其对心肌细胞GATA4表达的影响

目的 构建并筛选小鼠p300特异性siRNA载体,并观察p300表达降低对心脏特异性转录因子的调控作用,为进一步研究p300介导的组蛋白乙酰化失衡对心脏发育的影响奠定基础.方法 针对小鼠p300基因的保守序列区域设计并构建3个重组质粒p300 RNAi1,p300 RNAi2和p300 RNAi3.利用阳离子脂质体将其分别转染入体外培养的乳鼠心肌细胞,分别利用RT-PCR和免疫荧光从mRNA和蛋白水平检测p300表达,判断抑制效率,并检测心脏特异性转录因子GATA4的表达水平.结果 pSOS-HUS组和p300 RNAi2组中p300 mRNA水平表达较正常对照组无明显降低,而p300 RNAi1组和p300 RNAi3组中p300 mRNA表达量较正常组有明显降低(分别为0.220 8±0.020 0,0.170 8±0.040 0,vs 0.509 5±0.030 0),且差别有统计学意义(P<0.05),抑制率分别为56.7%和66.5%.转染p300RNAi1组和转染p300RNAi3组的GATA4 mRNA表达水平(分别为0.423 1±0.110 0,0.262 7±0.080 0)明显低于正常组(0.856 4±0.070 0)和阴性对照组(0.841 5±0.040 0),差别有统计学意义(P<0.05).结论 p300特异性siRNA 质粒载体构建成功,p300 RNAi1和p300 RNAi3具有确切阻断p300蛋白表达的作用,并下调GATA4的表达.     

姜黄素对胃癌细胞19300、1953、c-myc及乙酰化组蛋白H3和H4表达的影响

目的 了解姜黄素对胃癌细胞P300、P53、c-myc以及乙酰化组蛋白H3和H4表达的影响，探讨其抗胃癌的分子机制。方法 用不同浓度的姜黄素作用人胃腺癌细胞系SGC-7901，作用24、48h后，Rt-PCR法检测P300、P53、c-mycmRNA的表达；蛋白免疫印迹法检测乙酰化组蛋白H3、H4、P300、P53、c-myc蛋白的表达。结果 在胃癌细胞SGC-7901中P300和c-myc的表达随姜黄素浓度的改变而改变，在20μmol／L 24h时抑制作用较为明显，且两者具有相关性（r=0.976），而野生型p53则没有明显变化；姜黄素对乙酰化的组蛋白H3、H4都有抑制作用。也以20μmol／L 24h的作用最强。结论 姜黄素能抑制P300表达，进而抑制组蛋白H3和H4的乙酰化以及原癌基因c-myc的表达，但不影响抑癌基因P53的表达。提示姜黄素抑制组蛋白乙酰化酶P300可能是其抗癌的分子机制之-。     

TGF-β2对心肌细胞H9C2转录因子表达的影响及其组蛋白H3乙酰化调控机制

目的 探讨转化生长因子-β2(transforming growth factor beta2,TGF-β2)对心肌细胞H9C2转录因子Mef2c和GATA4的影响及其与组蛋白H3乙酰化的关系.方法 比较TGF-β2对细胞生长的影响.利用Real-time PCR检测心肌细胞的心脏相关转录因子Mef2c和GATA4mRNA的相对表达量,筛选合适的TGF-β2干预浓度.采用Western blot检测心肌细胞乙酰化组蛋白H3(acetylated histone H3,acH3)的表达差异.染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP) Real-time PCR检测Mef2c和GATA4启动子区与acH3结合DNA的相对表达水平.比色分析法检测TGF-β2对心肌细胞的总体组蛋白乙酰化酶(HATs)活性的影响.结果 ①TGF-β2干预组相对于对照组心肌细胞的增殖能力增强(P＜0.05).②心肌细胞的心脏相关转录因子Mef2c和GATA4mRNA的相对表达量随着TGF-β2浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在5 μg/L的浓度时均达到最高,Mef2c mRNA相对表达量是对照组的1.8倍,GATA4mRNA是对照组的2.3倍(P＜0.05).③TGF-β2干预72 h后acH3蛋白表达量是对照组的4倍(P＜0.05),HATs活性是对照组的1.34倍(P＜0.05).④TGF-β2干预组Mef2c和GATA4启动子区组蛋白H3的乙酰化水平分别是对照组的2.56和2.16倍(P＜0.05).结论 5μg/L TGF-β2可以促进心肌细胞H9C2的分裂与增殖,并上调心脏相关转录因子Mef2c和GATA4的表达,组蛋白H3乙酰化水平的升高可能是Mef2c和GATA4表达上调的机制之一.     

胃癌组织中COX-2与P300/CBP表达的研究

目的：研究胃癌组织中环氧化酶-2（COX-2）和核蛋白P300/CBP的表达变化,并探讨两者与胃癌生物学行为的关系。方法：用免疫组织化学S-P法检测不同分化程度胃癌组织和正常胃黏膜组织中COX-2和P300/CBP的表达变化。结果：（1）COX-2在胃癌组织的表达阳性率为37.8%,明显高于正常胃黏膜组织（0.0）,P<0.05;在低分化型胃癌阳性率为56.1%,明显高于高中分化型胃癌组织（8.0%）,P<0.05。（2）P300/CBP在胃癌组织的表达阳性率为10.6%,明显低于正常胃黏膜组织（72.2%）,P<0.05;在低分化型胃癌阳性率为4.9%,低于高中分化型胃癌组织（20.0%）,但P>0.05,差异无显著性。（3）COX-2表达阳性率在胃癌淋巴结转移组和远处转移组均显著高于非转移组,P<0.05;P300/CBP表达阳性率在胃癌的淋巴结转移组和远处转移组均低于非转移组,但P>0.05,差异无显著性。（4）胃癌组织中COX-2和P300/CBP表达呈现负相关倾向。结论：COX-2和P300/CBP在胃癌组织中表达异常,在胃癌的发生、发展中起重要作用,可作为辅助临床判断胃癌分化程度和转移生物学行为的有用指标。     

p300/CBP、Smad4在非小细胞肺癌组织中的表达

目的：探讨p300/CBP、Smad4蛋白在非小细胞肺癌（NSCLC）组织中的表达及其临床意义。方法：采用免疫组化SABC法检测60例NSCLC组织和20例正常肺组织中p300/CBP、Smad4的表达,分析两者相关性,并探讨其与NSCLC临床病理特征之间的关系。结果：p300/CBP在NSCLC组织中表达率为65.0%,过表达率为51.7%。Smad4在NSCLC组织中表达率为63.3%。p300/CBP和Smad4均与NSCLC淋巴结转移、分期等临床病理学参数有关（P〈0.05）。p300/CBP的表达还与NSCLC分化有关（P〈0.05）。p300/CBP、Smad4在NSCLC组织中阳性表达率呈中度负相关（P〈0.05）。结论：联合检测p300/CBP和Smad4的表达,在预测NSCLC的恶性生物学行为方面可能比单因素检测更具意义。     

组蛋白去乙酰化酶SIRT1经Toll样受体4途径对巨噬细胞凋亡的调控

目的 观察组蛋白去乙酰化酶——人沉默调节蛋白(SIRT1)经组蛋白表观遗传学调控细胞凋亡的具体机制和途径,为动脉粥样硬化防治提出新思路。 方法 选用假手术组大鼠作为对照,观察颈动脉损伤组大鼠颈动脉组织凋亡、SIRT1、组蛋白3(H3)、H3赖氨酸9位点乙酰化(H3K9Ac)及炎症因子蛋白表达;选用不同条件干预的氧化低密度脂蛋白(oxLDL)暴露巨噬细胞为研究对象,采用细胞功能获得或缺失方法,观察巨噬细胞凋亡、SIRT1、H3、H3K9Ac及炎症因子蛋白表达。 结果 与假手术组大鼠和对照组巨噬细胞比较,颈动脉损伤组大鼠颈动脉组织和oxLDL暴露巨噬细胞SIRT1蛋白表达减少,H3K9Ac/H3比值增加,Toll样受体4(TLR4)、白介素1β(IL-1β)蛋白表达增加且伴有凋亡增加(P<0.01);与给予SP600125(JNK 通路拮抗剂)、IAXO-102(TLR4通路拮抗剂)、LY294002(PI3K 通路拮抗剂)干预的巨噬细胞比较,IAXO-102干预后,SIRT1减少现象被逆转(P<0.01);给予SIRT1兴奋剂后,巨噬细胞凋亡减轻伴有H3K9Ac/H3比值减少,TLR4、IL-1β蛋白表达减少(P<0.01);给予SIRT1抑制剂后,巨噬细胞凋亡加重伴有H3K9Ac/H3比值增加,TLR4、IL-1β蛋白表达增加(P<0.01)。 结论 组蛋白乙酰化表观遗传学参与细胞凋亡的调控,进而与动脉粥样硬化发生发展密切相关。组蛋白去乙酰化酶SIRT1减少,H3乙酰化增加,恶化细胞凋亡,促发动脉粥样硬化发生发展,这个过程必经TLR4途径实现。     

小鼠胚胎心脏发育过程中组蛋白乙酰化酶亚型p300调控心脏特异转录因子的动态表达

目的:观察小鼠胚胎心脏发育过程中GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因的动态表达和这些基因的启动子区域组蛋白H3乙酰化修饰状态的变化,以及组蛋白乙酰化酶亚型p300对这些基因启动子的直接调控作用,为进一步研究先天性心脏疾病的发生机制奠定基础.方法:选取胎龄(Embryo day,E)10.5d和16.5d小鼠正常胚胎心脏,用实时荧光定量PCR(Real Time PCR)的方法观察上述基因mRNA的动态表达;采用染色质免疫沉淀技术(Chromatin immunoprecipitation,ChIP),用ChIP级抗乙酰化H3和抗p300抗体免疫沉淀与其所结合的DNA,采用Real Time PCR扩增抗体所富集的上述基因启动子的DNA量,观察胚胎心脏发育过程中乙酰化组蛋白及组蛋白乙酰化酶亚型p300是否参与调控上述四种心脏特异转录因子的表达.结果:①胎龄E10.5d和E16.5d小鼠胚胎心脏的GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因的mRNA表达水平都有明显差异(P<0.05),其中GATA4和MEF2C mRNA相对β-actin的表达水平,E10.5明显低于E16.5,而Nkx2.5和Tbx5 mRNA相对表达水平,E10.5明显高于E16.5;并且ChIP结果显示这些基因启动子的乙酰化水平也随着时间而改变,但差异无统计学意义.②E10.5和E16.5胚胎小鼠心脏中,p300抗体均能免疫沉淀GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5基因启动子,其沉淀的基因量在这两个小鼠心脏发育的关键时间点有所不同,但差异无统计学意义.结论:小鼠胚胎心脏发育过程中,心脏发育相关基因GATA4、Nkx2.5、MEF2C、Tbx5呈现动态表达,提示这些基因在心脏发育不同阶段具有重要作用.ChIP结果提示p300介导的组蛋白乙酰化修饰可能为调节这些基因动态表达的机制之一.     

组蛋白修饰影响肿瘤血管生成的研究进展

组蛋白修饰是表观遗传调控的一种重要方式,它通过相关修饰酶发生翻译后修饰从而改变染色质的结构和功能.肿瘤血管生成是肿瘤发生、发展、转移、复发过程中至关重要的一个环节.已有大量研究发现,组蛋白修饰和肿瘤血管生成有着密切联系,组蛋白修饰酶可以改变自身表达量或者直接作用于癌基因,也可以与热休克蛋白等相互作用促进或抑制肿瘤血管生...     

氟桂利嗪对脑缺血再灌注损伤沙鼠脑组织p300/CBP表达的影响

目的研究氟桂利嗪对脑缺血再灌注损伤沙鼠脑组织内p300/CBP表达的影响。方法40只沙鼠随机分为对照组、假手术组、缺血再灌注组及氟桂利嗪组,每组10只。采用夹闭双侧颈总动脉制作脑缺血再灌注模型,于缺血再灌注后1 d处死动物取前脑组织;采用免疫组织化学法检查各组沙鼠脑内p300/CBP的表达情况。结果对照组及假手术组沙鼠脑内p300/CBP呈弱阳性表达,2组比较差别无统计学意义(P>0.05);缺血再灌注组沙鼠脑组织内p300/CBP阳性表达率较对照组及假手术组表达明显增强(P<0.01),氟桂利嗪组沙鼠脑组织内p300/CBP的表达较缺血再灌注组下降(P<0.05)。结论正常沙鼠脑内有p300/CBP表达;沙鼠脑缺血再灌注后脑组织内p300/CBP表达上调,氟桂利嗪可以降低其表达。     

胃癌组织中p300/CBP、Smad2蛋白表达及其临床意义

目的检测胃癌组织中p300/CBP、Smad2蛋白的表达,探讨p300/CBP在胃癌的发生与发展中的作用。方法采用免疫组化S-P法,检测51例胃癌和51例正常胃黏膜组织中p300/CBP、Smad2蛋白的表达;结果p300/CBP、Smad2在胃癌组织中的免疫组化染色强度分别为(5.2635±1.0047),(5.7027±0.6330),均明显低于相应正常胃黏膜组织分别为(12.9769±0.9274),(15.2297±0.8871),P<0.01。进展期胃癌组织中p300/CBP、Smad2的染色强度分别为(4.4274±1.3970),(4.6574±1.1281),均显著低于早期胃癌组织分别为(6.6684±1.0341),(7.4632±1.2856),P<0.05;伴淋巴结转移组p300/CBP、Smad2的染色强度分别为(4.4092±0.8203),(4.4115±0.7737)显著低于无淋巴结转移组分别为(6.8263±2.0127),(8.0699±0.7854),P<0.05;p300/CBP、Smad2染色强度与胃癌分化程度、患者年龄及性别无显著相关性。胃癌组织中p300/CBP的低表达与Smad2的低表达呈正相关。结论p300/CBP、Smad2在胃癌中的表达水平明显降低,并与胃癌的分期以及淋巴结的转移有关,提示p300/CBP、Smad2低表达使TGF-β信号传导通路受阻,可能参与胃癌的发生发展过程。     

小鼠GATA4基因真核表达载体的构建及其在P19细胞中的表达

目的:构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,检测其在P19细胞中的表达.方法:由于GATA4基因的全长编码区的GC含量很高,因此本实验采用分段克隆后PCR拼接的方法获得GATA4基因的全长编码序列,连接入pMD19-T载体,经鉴定正确后亚克隆入pCDNA 3.1A,构建pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体,测序验证无误后,采用脂质体介导法转染至P19细胞,Western blot检测其在P19细胞中的表达.结果:成功扩增小鼠GATA4基因全长编码区,测序证明重组真核表达载体pCDNA3.1A-GATA4构建成功,Western blot确认目的基因在P19细胞中过表达.结论:pCDNA3.1A-GATA4真核表达载体构建成功,并在P19细胞内过表达,将为研究其在心肌分化、心脏发育中的功能奠定基础.     

转录因子GATA4和甲胎蛋白在小鼠胎肝和肝癌细胞中的表达对比及相关性

目的:探讨转录因子GATA4和甲胎蛋白(AFP)在小鼠胎肝和肝癌细胞中的表达及二者相关性.方法:获取小鼠孕10.5 d、孕13.5 d、孕15.5 d、孕17.5 d、出生后0.5 d的肝组织,半定量RT-PCR检测GATA4和AFP mRNA的表达,并以成鼠肝、正常肝细胞株和肝癌细胞株作为对照.将小鼠GATA4真核表达载体成功转染正常肝细胞并鉴定,将多柔比星作用肝癌细胞,然后均进行以下指标监测:半定量RT-PCR法检测GATA4、AFP和胎蛋白转录因子(FTF)mRNA的表达,免疫印迹法检测GATA4和AFP蛋白的表达,ELISA法检测细胞上清AFP的含量.结果:随着胎肝细胞分化的不断成熟,GATA4和AFP的表达逐渐下降,至出生后0.5 d已降至成肝水平.GATA4、FTF和AFP在正常肝细胞不表达,而在肝癌细胞高表达;正常肝细胞转染GATA4后,FTF和AFP表达显著增高,其细胞上清液AFP含量亦明显增高.多柔比星作用肝癌细胞后,6 h内GATA4的表达首先降低;随着时间延长(≥12 h),FTF和AFP表达逐渐降低,细胞上清液AFP含量亦逐渐降低,差别具有显著的统计学意义.结论:GATA4在胎肝组织和肝癌细胞中高表达并可能对AFP也有一定的上调作用.     

GATA4基因修饰骨髓间充质干细胞对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的: 研究锌指转录因子(GATA4)基因修饰骨髓间充质干细胞（MSCs）对心肌梗死大鼠心功能的影响,为进一步探讨其机制提供依据。方法: 构建GATA4-pEGFP基因质粒,体外分离培养大鼠MSCs,利用脂质体将质粒转染入MSCs。40只SD大鼠制备大鼠心肌梗死模型,于术后10 d测定心功能指标。将模型鼠随机分为MSCs 组和DMEM组,每组各20只。MSCs 组将GATA4-pEGFP基因修饰的MSCs植入心肌梗死后10 d大鼠心肌梗死区,DMEM组同时注射等体积无血清DMEM于心肌梗死区。移植注射后4周,检测左心室射血分数（LEVF）和左室缩短分数（FS）。结果: 体外分离培养的MSCs呈梭形或条形,贴壁生长 。 GATA4-pEGFP重组基因质粒转染MSCs 2周后,可见细胞中有绿色荧光蛋白表达。移植4周后,MSCs组大鼠LEVF（85%±7%）明显高于DMEM组(47%±4%)（P<0.01）; MSCs组大鼠FS(52%±6%)明显高于DMEM组(35%±8%)（P<0.01）。结论: GATA4基因修饰的MSCs移植能够改善心肌梗死大鼠心功能。     

SLE中GATA3和MBD2 对IL-4表达的影响

目的本文通过检测LE中MBD2、GATA3和IL-4表达的量化关系,探索LE中GATA3和MBD2表达水平对Th2异常分化的影响,旨在探讨基因表达调控异常对LE自身免疫异常的可能机制。方法获取12例系统性红斑狼疮患者和11例健康志愿者外周静脉血单核细胞,以RT-PCR半定量法检测GATA3、MBD2和IL-4的转录水平。采用两样本均数T检验比较分析SLE患者与正常人之间GATA3、MBD2和IL-4转录水平的差异。结果正常对照组PBMC中GATA3表达水平为(0.342±0.117),SLE患者组PBMC中GATA3表达水平为(0.552±0.234),SLE中GATA3表达水平显著高于正常对照(t=1.761,P=0.009);正常对照组MBD2表达水平为(0.587±0.193);SLE患者组MBD2表达水平为(0.760±0.203),SLE中MBD2表达水平显著高于正常对照(t=1.721,P=0.024);正常对照组IL-4表达水平为0.299±0.198;SLE患者组IL-4表达水平为(0.442±0.183),SLE中IL-4表达水平显著高于正常对照(t=1.725,P=0.042)。结论LE中与自身免疫反应有关的Th2细胞活化不仅受到低甲基化造成的IL-4表达增加的影响,而且受到低甲基化造成的沉默因子结合下降的影响,使GATA3失去了MBD2的竞争性抑制,更加有利于诱导IL-4表达,活化Th2,促进LE发病。