变形链球菌葡聚糖结合蛋白B的纯化

目的：从变形链球菌S.mutans Ingbritt(serotype c)培养液上清中纯化葡聚糖结合蛋白B。方法：Sephadx G-200凝胶（α-1,6键葡聚糖）亲和层析和Q－SephroseFF离子交换层析。结果：纯化出约10μg具有葡聚糖结合特性的GbpB蛋白。结论：通过Sephadx G-200凝胶（α-1,6键葡聚糖）亲和层析和Q－Sephrose FF离子交换层析纯化出变链菌葡聚糖结合蛋白B。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段在大肠杆菌中的表达

目的原核表达变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因(glucan-bindingproteinCgene,gbpC)特异片段。方法将克隆获得的约0.45kb的gbpC基因特异片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1/gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropy1-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达融合蛋白GST-GbpCE,SDS-PAGE检测表达产物。结果在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白质条带,其相对分子质量约为43000,与预计大小相符合。结论成功表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpCE,可用于制备GbpC抗体。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B基因防龋疫苗的构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的：观察变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(gbpB)真核表达质粒pcDNA3．1( )-gbpB在哺乳动物细胞COS-7的表达情况，方法：通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3．1( )-gbpB，通过脂质体转染法将其转染车COS-7细胞，通过免疫组化SABC法检洲其在COS-7细胞的表达结果：pcDNA3．1( )-gjhB质粒转染的细胞胞浆中呈棕黄色染色，胞核中无着色，pcDAN3．1( )空载体转染的细咆咆浆及胞核无着色，空白对照组也无着色结论：质粒pcDNA3．1( )-ghpB转染COS-7后能够住细胞内翻译、表达，表达的蛋白质位于胞浆中．可与抗GbpB抗体特异性结合，具存抗原性，可作为基因疫苗。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因（Glucan-binding protein C gene,gbpC）编码序列的特异片段,并在大肠杆菌中实现原核表达。方法：根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1342bp～1794bp间的一段特异片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。将克隆获得的约0．45kb的gbpC基因特异片段经EcoRI／SalI双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1／gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达融合蛋白GST-GbpC^E,SDS-PAGE检测表达产物。结果：测序结果与Sato等报道的序列一致;原核表达后,在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带,其相对分子量约43000,与预计大小相符合。结论：成功克隆并表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpC^E,为制备GbpC抗体打下了基础。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白D基因的分子克隆及其原核表达和初步纯化

目的:克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白D(gbpD)基因,在大肠杆菌中表达并对重组蛋白进行初步纯化,为进一步的蛋白功能研究奠定基础。方法:体外培养变形链球菌UA159菌株并以其基因组为模板,对gbpD基因编码区进行PCR扩增,连接pMD-18T载体并测序。随后将该片段克隆入原核表达载体pPROEX HTb中,构建表达质粒pPROEX/gbpD,转化大肠杆菌DH5α并用IPTG诱导表达。表达产物经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱进行亲和层析纯化。结果:成功克隆变形链球菌gbpD基因并在大肠杆菌中得到可溶性表达,经Ni-NTA柱纯化后获得纯度大于95%、相对分子量(Mr)为76×103的变链菌GbpD蛋白。结论:获得Mr为76×103的变形链球菌GbpD蛋白。对进一步确定GbpD的葡聚糖结合能力,探讨其在变链菌致龋过程中的作用,以及在龋病预防领域的应用前景都具有重要的意义。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白的研究进展

本文介绍了一类对牙菌斑的发育,结构和致龋力具有重要意义的变形链球菌表面蛋白－葡聚糖结合蛋白,阐述了其作用,种类及分子结构等。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白B功能区片段的分子克隆及表达

目的 :克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白B(GbpB)功能区的基因片段 ,并在大肠杆菌中表达。方法 :通过PCR技术克隆GbpB功能区的基因片段并通过蛋白重组融合表达技术使其在大肠杆菌中表达。 结果 :成功克隆了GbpB功能区的基因片段 ,并在大肠杆菌中得到其融合蛋白的表达。 结论 :利用分子生物学技术能够成功克隆GbpB功能区基因并获得其融合蛋白的表达 ,为后续研究奠定了基础     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白A真核表达质粒pcDNA3.1/GBD在哺乳动物细胞中的表达

目的　观察变形链球菌葡聚糖结合蛋白A(GbpA)的葡聚糖结合区(GBD)真核表达质粒pcDNA3·1/GBD在哺乳动物细胞COS-7的表达情况。方法　通过基因重组技术构建真核表达质粒pcDNA3·1/GBD,通过脂质体转染法将其转染至COS-7细胞,通过免疫组化SABC法检测其在COS-7细胞的表达。结果　pcDAN3·1/GBD质粒转染的细胞质呈棕黄色染色,胞核无着色,pcDAN3·1空载体转染的细胞质及胞核无着色,空白对照组也无着色。结论　质粒 pcDAN3·1/GBD转染COS-7后能够在细胞内翻译、表达,表达的蛋白质位于细胞质中,可与抗GbpA抗体特异性结合,具有抗原性,可作为基因疫苗。     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的分子克隆

目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白Ｃ基因（ｇｂｐＣ）编码序列的特异片段。方法：根据文献报道的ｇｂｐＣ序列设计并合成一对寡核苷酸引物,ＰＣＲ扩增位于ｇｂｐＣ编码序列１１０５～１５５４ｂｐ间的一段牧民片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体ｐｕｃ１８中,连接产物转化感受态大肠杆菌ＤＨ５α,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。结果：测序结果与Ｓａｔｏ等报道的序列一致。结论：成功克隆了ｇｂｐＣ基因片段     

变形链球菌表面蛋白可变区与葡聚糖合成的关系

目的:探讨变形链球菌表面蛋白可变区与葡聚糖合成的关系。方法:取本课题组前期工作所获得的变链c型临床株,分成水溶性葡聚糖(W SG)组和水不溶性葡聚糖(W IG)组;每组又按葡聚糖合成能力分为合成量高(ABS>0.3)与合成量低(ABS<0.15)组。以所选细菌DNA为模板,PCR扩增表面蛋白V区编码基因SrV ,经DdeI酶切分型,比较各基因型在两组细菌中的分布情况。结果:1)两组均有4种基因型(A、B、C、D)并且在构成比上都以A、B型占多数,C、D型所占比例较少且存在明显差异;2)在W SG组主要基因型的分布出现差异:合成量高的以A型为主占50%,B型占33.33%,C型占11.11%;合成量低的以B型为主占50%,A型占30.77%,C型19.15%。3)在W IG组A、B型的分配基本相似,均在40~48%之间。结论:变形链球菌表面蛋白可变区的基因型分布与水溶性葡聚糖的合成存在一定的相关性而与水不溶性葡聚糖的合成未见明显关联。     

变形链球菌UA159上葡聚糖结合蛋白C的定位探讨

目的探索C端结构变异为亮氨酸-脯氨酸-任意氨基酸-丙氨酸-甘氨酸（LPXAG）的葡聚糖结合蛋白C（glucan binding proteinC，GbpC）是否在变形链球菌UA159的细胞壁上。方法用PCR法扩增变形链球菌UA159GbpCC端的编码基因片段，推测和分析C端氨基酸序列组成；分别提取上清蛋白、胞内蛋白和胞壁蛋白，用Western blot法在变形链球菌UA159各成分中检测GbpC；用免疫金标直接观察GbpC的表达位置；应激条件下进行多聚糖依赖黏附实验。结果变形链球菌UA159GbpCC端亮氨酸-脯氨酸-任意氨基酸-苏氨酸-甘氨酸（LPXTG）的结构变异为LPXAG；免疫印迹叮以在细菌的壁蛋白中检测到GbpC；电镜下可以观察到金颗粒围绕细菌细胞壁聚集；变形链球菌UA159在应激条件下表现为多糖依赖黏附实验阳性。结论C端为LPXAG的GbpC仍然锚定在细菌的细胞壁上。     

变形链球菌表面蛋白PAc的原核表达及纯化

目的：对在大肠杆菌中表达重组变形链球菌表面蛋白抗原PAc的培养条件进行优化,制备高纯度重组蛋白rPAc。方法：载体构建原核表达载体pET20b（＋）-AP对不同培养基、诱导浓度,温度和时间等进行筛选确定最佳条件,采用亲和层析分离纯化rPAc蛋白。结果：含原核表达载体pET20b（＋）-AP的大肠杆菌在LB培养基中培养至A600—0．6时,终浓度为1mM的IPTG诱导,30℃继续振荡培养4h,可使rPAc的表达量达到最大。分离纯化的蛋白在SDSPAGE中显示为单一条带。结论：对PAcA～P区的重组质粒pET20b（＋）-AP表达的rPAc经纯化后可用于动物免疫,为探索防龋DNA疫苗pCIA—P的新型免疫策略奠定必要的物质基础。     

变形链球菌185—SA表面蛋白抗原的提取与鉴定

变形链球菌Ｃ血清型的１８５ＫＤ表面蛋白抗原,是变链的重要抗原。本文自变链ＭＴ６Ｒ（Ｃ血清型）的培养上清液中,用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析电泳,制备电泳和透析电泳的方法,提取了变链１８５ＫＤ表面蛋白抗原。这种抗原与标准抗体具有免疫反应性,是一种类似于或相同ＳＡⅠ／Ⅱ的抗原。     

变形链球菌表面蛋白P1的提取纯化

目的：探索高效率、条件温和的方法分离纯化有黏附活性的变形链球菌表面蛋白P1,为进一步分析表面蛋白P1生物学特性奠定实验基础。方法：硫酸铵分级沉淀法提取变形链球菌表面蛋白P1粗提物,在AKTAexDlorer100快速纯化工艺开拓系统中采用SepharoseXL填料（强阴离子交换剂）分离纯化变形链球菌表面蛋13P1。通过黏附抑制实验检测蛋白的黏附活性。结果：蛋白乡电化后SDS—PAGE电泳可见分子量约185kD的单一蛋13条带。该蛋白可明显抑制变形链球菌在唾液包被羟基磷灰石表面的黏附（P〈0．05）。结论：运用硫酸铵分级盐析沉淀粗提变形链球菌表面蛋白,在AKTAexplorer100快速纯化工艺开拓系统中采用强阴离子交换层析可获得较高得率的、保持黏附活性的纯化P1蛋白。     

变异链球菌葡聚糖结合蛋白B的生物学特性研究进展

变异链球菌是人类龋病的主要致病菌,葡聚糖结合蛋白是其重要的毒力因子之一.葡聚糖结合蛋白B在变异链球菌的致龋、维持细菌形态、发挥细胞壁生理功能等方面有重要作用,同时其N端具有免疫原性,可应用于免疫防龋.下面就葡聚糖结合蛋白B的生物学特性研究进展作一综述.     

Biological functions of glucan‐binding protein B of Streptococcus mutans

Introduction: Streptococcus mutans has been implicated as a major causative agent of dental caries in humans. Bacterial components associated with the adhesion phase of S. mutans include glucosyltransferases, protein antigen C and proteins that bind glucan. At least four glucan‐binding proteins (Gbp) have been identified; GbpA, GbpB, GbpC and GbpD. Methods: In our previous study, the contributions of GbpA and GbpC to the virulence of S. mutans were investigated; however, the biological function of GbpB and its role in the virulence of S. mutans remain to be elucidated. Using a GbpB‐deficient mutant strain (BD1), we demonstrated in the present study that GbpB has a role in the biology of S. mutans. Results: The growth rate of BD1 was lower than that of other strains, while it was also shown to be less susceptible to phagocytosis and to form longer chains than the parental strain MT8148. In addition, electron microscope observations of the cell surfaces of BD1 showed that the cell‐wall layers were obscure. Conclusion: These results suggest that GbpB may have an important role in cell‐wall construction and be involved in cell separation and cell maintenance.     

携带变形链球菌表面蛋白、葡聚糖结合蛋白及信号肽基因的真核表达质粒的构建

目的通过构建带有变形链球菌表面蛋白SpaP的P区、葡聚糖结合蛋白A葡聚糖结合区（glucan bind-ing domain,GBD）及一段信号肽基因的嵌和体真核表达质粒pSSG,为基因疫苗的制备提供实验基础。方法通过PCR扩增,获得分别编码SpaP的P区和GBD的两个基因片段sp和gg,以及人白介素2信号肽基因（signal）。将它们分别定向插入pMD20-T克隆载体中,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,初步鉴定后测序。将获得的3个基因片段分别双酶切,胶回收纯化后将同样进行双酶切的pVAX1质粒在T4 DNA连接酶作用下进行连接反应,获得真核表达质粒pSSG,并转化DH5α,提取纯化pSSG,进行质粒RCR,酶切电泳鉴定并测序。结果真核表达质粒pSSG构建正确,目的基因sp、gg和signal定向插入至真核表达载体。结论真核表达质粒pSSG包含了SpaP的P区和GBD以及人白介素2信号肽的编码基因,为基因疫苗研究奠定基础。     

Biological functions of glucan-binding protein B of Streptococcus mutans

INTRODUCTION: Streptococcus mutans has been implicated as a major causative agent of dental caries in humans. Bacterial components associated with the adhesion phase of S. mutans include glucosyltransferases, protein antigen C and proteins that bind glucan. At least four glucan-binding proteins (Gbp) have been identified; GbpA, GbpB, GbpC and GbpD. METHODS: In our previous study, the contributions of GbpA and GbpC to the virulence of S. mutans were investigated; however, the biological function of GbpB and its role in the virulence of S. mutans remain to be elucidated. Using a GbpB-deficient mutant strain (BD1), we demonstrated in the present study that GbpB has a role in the biology of S. mutans. RESULTS: The growth rate of BD1 was lower than that of other strains, while it was also shown to be less susceptible to phagocytosis and to form longer chains than the parental strain MT8148. In addition, electron microscope observations of the cell surfaces of BD1 showed that the cell-wall layers were obscure. CONCLUSION: These results suggest that GbpB may have an important role in cell-wall construction and be involved in cell separation and cell maintenance.