纳米微粒偶联抗OX40/抗AFP抗体在细胞毒性T细胞抗肝癌中的作用

目的探讨乳酸-羧基乙酸共聚物(PLGA)制备的纳米微粒偶联抗OX40及抗AFP抗体(抗OX40/抗AFP-NP)对甲胎蛋白AFP158-166抗原肽特异性细胞毒性T细胞(CTL/AFP158-166)体外杀伤肝癌细胞的影响。方法用溶剂蒸发法制备纳米微粒(NP),并与抗OX40和抗AFP共价偶联。用扫描电镜观察所制得PLGA-NP纳米颗粒的形态;ZetaPlusTM粒度测定仪检测纳米微粒的粒径及电荷;用BCA蛋白定量方法检测纳米微粒偶联抗体的效率;用人外周血单核细胞诱导形成树突状细胞(DC),用AFP158-166抗原肽负载DC诱导AFP特异性的CTL/AFP158-166;分别用2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑单钠盐-1法(WST-1)法、ELISA及乳酸脱氢酶(LDH)法分别检测抗OX40/抗AFP-NP对CTL/AFP158-166细胞增殖能力、分泌IL-2和IFN-γ及杀瘤活性的影响。结果所制得的PLGA-NP为圆形,大小较均一,粒径约为(300±42)nm,带负电荷,约为-(25.12±5.34)mV。蛋白定量显示每mg的PLGA-NP偶联约100μg抗体,偶联效率为25%;增殖和活化实验显示偶联有抗OX40的纳米微粒能显著刺激CTL的增殖、IL-2和IFN-γ的分泌;杀伤实验显示,抗OX40/抗AFP-NP能显著增强AFP特异性CTL/AFP158-166细胞对HepG2细胞特异性杀伤作用,而对SMMC-7721杀伤作用无明显效果。结论抗OX40/抗AFP-NP能刺激CTL/AFP158-166细胞的增殖、细胞因子的分泌并增强CTL/AFP158-166细胞对AFP阳性肝癌细胞的特异性杀伤作用。     

罗勒多糖对人树突细胞抗原摄取功能及共刺激分子表达的影响

目的探讨罗勒多糖对人外周血单核细胞来源的树突细胞（dendritic cells，DC）抗原摄取功能以及共刺激分子表达的影响。方法从正常人外周血单核细胞诱导未成熟和成熟的DC，实验组加入罗勒多糖（150μg/ml），对照组加入PBS，分别培养24h，收获未成熟的DC，与OVA—FTTC（100μg/ml）共同孵育，流式细胞仪检测DC的抗原摄取能力。同时收获成熟DC，流式细胞仪检测DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达情况。结果与对照组比较，罗勒多糖作用组DC的抗原摄取能力显著提高，同时成熟DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达也明显升高。结论罗勒多糖可显著增强DC的抗原摄取能力，并且能够提高细胞表面共刺激分子的表达，这可能是罗勒多糖发挥抗肿瘤免疫的机制之一。     

小鼠骨髓树突状细胞制备方法的比较研究

为了比较GM CSF与IL 4 (IL 4DC )以及GM CSF与IL 3(IL 3DC )共刺激培养制备的两种树突状细胞 (DC )的差异 ,采用GM CSF (10 0 0U/ml)和IL 4 (10～ 2 0ng/ml)或IL 3(10～ 2 0ng/ml)从小鼠骨髓培养制备DC ,流式细胞仪分析表型 ,体外饲以颗粒化抗原 (与Latexbead交联的Ovalbumin ,微粒 OVA )或抗原多肽 (Ovalbumin的SL8表位 ,即SIIFEKL )后 ,测定两种DC体外对颗粒化抗原的摄取能力和对抗原多肽的递呈能力 ,以及体内对特异性CTL的诱导能力。结果显示 ,IL 3DC较IL 4DC胞体略大 ,但树突状分支略少 ,表达更高的F4 / 80和更低的NLDC14 5、CD4 0 ,而两者的共刺激分子CD80、CD86和MHCI类分子的表达率无显著差异。体外IL 3DC对颗粒化抗原具有更高的摄取能力和对SIIFEKL多肽有更强的递呈能力 ,但体内对特异性CTL的诱导能力二者无显著差异。研究表明 ,两种方法制备的DC在形态、表型、体外抗原多肽递呈和抗原摄取能力方面存在一定差别 ,但具有相似的体内细胞免疫应答诱导能力     

HIV-1 C亚型密码子优化gp120负载人DC疫苗的构建及体外功能

目的构建HIV-1C亚型gp120负载人树突状细胞(dentriti ccell,DC)疫苗,并对其体外功能进行初步检测。方法利用Amaxa细胞核转染技术将pcDNA3.1-gp120质粒转染至人成熟DC,以Western blot检测gp120的表达。通过流式细胞仪检测DC表面共刺激分子的变化、混合淋巴细胞反应、CD8+T细胞表面活化分子CD25的表达及其分泌IFN-γ的变化。结果通过Western blot检测,gp120在DC中得到了正确表达。经流式细胞仪检测,DC表面分子CD80表达率由刺激前的33.34%上升至43.20%,CD86表达率由刺激前的60.08%上升至90.34%;负载gp120DC刺激淋巴细胞增殖率为86.72%;CD8+T细胞表面分子CD25表达率由刺激前的5.27%上升至74.21%,IFN-γ的表达率达37%。结论负载了HIV-1gp120的人树突状细胞能够显著刺激淋巴细胞的增殖、增强CD8+T细胞表面活化分子CD25表达以及促进CD8+T细胞分泌IFN-γ,为下一步DC治疗性疫苗的体内研究奠定基础。     

慢性乙肝患者树突状细胞抗原递呈功能状态的初步研究

目的:研究慢性乙肝患者树突状细胞(DC)抗原递呈功能的改变。方法:从慢乙肝患者和健康人外周血分离单个核细胞,诱导培养出DC,显微镜下观察DC形态并计数,流式细胞仪检测DC表面协同刺激分子(CD80,CD86),MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力,ELISA法测定培养上清液中IL-12、r-IFN水平。结果:慢乙肝患者外周血单个核细胞诱导培养所获得的DC数量及表面协同刺激分子(CD80,CD86)表达水平、刺激同种异体淋巴细胞增殖能力和细胞因子产生水平均明显低于健康者(P<0.05)。结论:慢乙肝患者DC的数量及抗原递呈、免疫刺激功能状态均处于低下水平。     

纳米微粒包装肿瘤抗原诱导CTL抗肿瘤免疫

用纳米微粒包装肿瘤抗原,并探讨其诱导产生CTL的免疫学特性和杀瘤活性。采用复乳溶剂蒸发法制备包含有恶性黑色素瘤抗原肽Mart-1-27-35纳米微粒;扫描电镜观察所制得纳米颗粒的形态。用NP-Mart-1-27-35诱导抗原特异性CTL并用ELISPOT法和LDH法检测其特性和杀瘤活性。结果:电镜观察所制得的纳米颗粒为圆形,平均直径为(208.52±12.43)nm。HPLC分析纳米-抗原肽的抗原载入量为6.72%±0.28%,平均包封率为91.23%±3.56%;ELISPOT检测表明纳米微粒包装的抗原肽能引起较强的免疫反应,产生分泌IFN-γ的细胞斑点数分别为(476.37±29.43)/2×104,显著高于单纯使用抗原肽时所产生的斑点数;LDH检测显示与单纯使用抗原肽相比,纳米-抗原肽诱导的CTL对Mart-1+细胞的杀伤能力显著提高。纳米微粒包装的抗原肽能够显著增强并延长DC对抗原的提呈作用;其诱导产生的CTL能以MHC I限制的方式特异识别和杀伤表达相应抗原的肿瘤细胞。     

Gp130分子的活化在树突状细胞分化和成熟中的意义

目的 :研究激发型抗gp130分子单抗B S12对树突状细胞 (DC)分化成熟和功能的影响。方法 :人外周血单核细胞在GM CSF和IL 4作用下分化为未成熟DC后 ,加入B S12单抗 ,观察它对DC表型、摄取抗原的能力以及DC分泌IL 12、进行混合淋巴细胞反应及趋化T细胞能力的影响 ;同时比较B S12和激发型抗CD4 0单抗 5C11对DC的作用。结果 :激发型抗gp130分子单抗B S12作用于未成熟DC ,可以上调DC上CD1a和共刺激分子CD80、CD86以及成熟DC的标志CD83分子的表达 ,下调CD14的表达 ,降低DC摄取抗原的能力 ,增强DC分泌IL 12、进行混合淋巴细胞反应及趋化T细胞的能力 ,但这些作用都稍弱于 5C11对DC的作用。结论 :未成熟DC上gp130分子的直接活化可以诱导DC的分化和功能成熟。     

骨髓来源的原代树突状细胞对细菌颗粒抗原交叉呈递的动力学研究

目的研究小鼠骨髓细胞来源的树突状细胞对细菌颗粒抗原交叉递呈的动力学特点。方法取小鼠骨髓细胞,采用GM-CSF诱导培养。用倒置显微镜观察培养过程中细胞形态,用流式细胞仪进行细胞纯度和表型测定。采用第7天未成熟的DC细胞进行细菌抗原的交叉递呈能力检测和动力学分析。结果小鼠骨髓细胞经GM-CSF诱导培养,第7天获得大量具有典型形态和免疫表型的树突状细胞,并且在细菌脂多糖刺激后,其表型也发生特征性变化表现在共刺激分子CD80由刺激前的27.7%上调到71.6%,CD86从刺激前的36.0%上调到80.3%,DEC205从刺激前的6.5%上调到26.2%。同时该细胞吞噬低剂量的细菌抗原即可有效活化T细胞,其动力学曲线为:1～3h,该细胞抗原递呈能力呈对数增加,3～8hDC抗原递呈能力进入一个平台期,10～12h,抗原递呈能力又迅速增强。结论采用GM-CSF可以从小鼠骨髓中获得大量纯度高并且具有典型免疫表型的DC,该DC细胞能有效的递呈外源性细菌抗原,并具有特殊的抗原递呈动力学曲线。     

纳米乳剂的制备及特性鉴定

目的: 制备包裹BSA- FITC的纳米乳剂 (NEBSA -FITC), 研究其特性以及树突状细胞 (DC)和巨噬细胞对其摄取的效率。方法: 采用界面聚合法, 制备包裹BSA- FITC的纳米乳剂(NEBSA- FITC), 于电镜下观察其形态并测量其粒径。用凝胶层析法检测纳米乳剂的包裹率、载药量及稳定性。将小鼠骨髓DC及腹腔巨噬细胞与NEBSA -FITC共育后, 用流式细胞仪检测DC及腹腔巨噬细胞摄取NEBSA- FITC的阳性率。用激光共聚焦显微镜观察DC摄取NEBSA -FITC的能力。结果: 成功地制备出粒径为(25±10)nm的纳米乳剂, 其包裹率为 91%, 载药量为 0. 091g/L, 于 4℃放置 6个月后性质稳定。流式细胞仪检测显示, DC和腹腔巨噬细胞摄取NEBSA FITC的能力明显强于对游离BSA- FITC的摄取。激光共聚焦显微镜下观察到DC可摄取NEBSA -FITC。结论: 纳米乳剂具有良好的包裹率和载药量, 可有效地增强抗原递呈细胞对所载药物的摄取, 有望作为肿瘤抗原疫苗的新型载体。     

树突状细胞与T细胞免疫反应结果研究进展

树突状细胞(dendritic cell，DC)是美国学者Steinman于1973年发现的，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC起源于骨髓和脐血的CD34^ 造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell，HPC)，分布于除脑组织以外的全身各处。DC是体内功能最强的专职抗原递呈细胞(antigcn presenting cells，APCs)，捕获外来抗原，迁移至引流淋巴结，发育成熟并递呈抗原，启动和诱导初始型T细胞，     

卵巢癌细胞株冻融抗原负载的树突状细胞诱导CTL抗卵巢癌免疫应答的体外研究

目的研究卵巢癌冻融抗原负载的树突状细胞(dendriticcells,DC)诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外杀伤卵巢癌细胞的细胞毒性效应。方法利用免疫磁珠分离法(MACS)分离纯化脐血CD34 细胞并在体外诱导分化为DC,用反复冻融法从卵巢癌细胞系SKOV3中提取的可溶性相关抗原负载DC。流式细胞学检测负载抗原后DC表面各种分化相关抗原的表达,ELISA法检测DC上清中IL12的表达,混合淋巴细胞反应(MLR)测定DC体外刺激T细胞增殖的能力,MTT法检测抗原负载DC激活的抗原特异性CTL对卵巢癌细胞的杀伤作用。结果与未经抗原负载的DC相比,经卵巢癌抗原负载的DC不仅能更高地表达各种DC分化相关抗原CD1α(73.35%±2.94%vs34.1%±2.35%)、CD83(73.9%±8.46%vs54.68%±3.26%)、CD80(91.95%±2.48%vs52.53%±3.18%)、HLADR(70.05%±2.35%vs48.7%±2.07%)以及CD54(88.9%±5.52%vs71.45%±2.29%),同时具有更强的刺激同种异体T淋巴细胞增殖和IL12分泌的能力(P均<0.05)。此外,卵巢癌细胞SKOV3冻融抗原负载DC激活的CTL在体外对SKOV3的杀伤率为77.35%,显著高于未经抗原负载的DC(P=0.0001)。结论经卵巢癌细胞冻融抗原负载DC激活的CTL在体外具有更强的增殖能力和杀伤卵巢癌细胞的作用。     

影响树突细胞功能的因素及其调控机制

树突细胞(Dendritic cells,DCs)尽管数量不足外周血单核细胞的1%,但表面具有丰富的抗原递呈分子(MHCⅠ和MHCⅡ)、协同刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40、CD44、等)和粘附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3等),是已知最强的专职抗原递呈细胞(APC)。DCs自身具有     

树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗研究

树突状细胞是抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞。树突状细胞可通过交叉致敏途径呈递外源性抗原如肿瘤抗原，诱导CD8 的CTL应答。应用不同形式的肿瘤抗原负载DC，将致敏DC作为疫苗回输体内可诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答。     

树突状细胞介导的肿瘤免疫治疗研究

树突状细胞是抗原递呈能力最强的抗原递呈细胞。树突状细胞可通过交叉致敏途径呈递外源性抗原如肿瘤抗原,诱导CD8+的CTL应答。应用不同形式的肿瘤抗原负载DC,将致敏DC作为疫苗回输体内可诱导机体产生有效的抗肿瘤免疫应答。     

人树突状细胞上共刺激分子的表达及其生物学意义

树突状细胞(Dendritic Cells)是一种专职的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cell，APC)，亦是目前已知功能最强的APC，在自体、异体混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)中起着重要的刺激淋巴细胞活化的作用。未成熟DC具有摄取和加工递呈抗原的能力，而刺激初始型T细胞活化的能力     

Tat-Rac1 C-末端肽促进树突状细胞的交叉递呈

目的 研究Rac1、Rac2、Rac3、RhoA以及Cdc42的C-末端肽对树突状细胞(DC)交叉递呈的影响.方法 合成Rac1、Rac2、Rac3、RhoA及Cdc42 C末端区与人工改造的穿膜肽Tat47-57的融合肽,负载DC2.4细胞后,采用荧光显微镜及流式细胞术检测DC2.4细胞吞噬能力的变化,采用B3Z细胞检测DC2.4细胞抗原交叉递呈能力的变化.结果 负载了Tat-Rac1 C-末端肽的DC2.4细胞吞噬能力增强,并显著促进DC2.4细胞经MHC I类分子途径递呈外源性抗原的能力.结论 Tat-Rac1 C-末端肽能够有效促进DC的交叉递呈,为病毒感染和肿瘤等疾病的治疗奠定了基础.     

T-exo 负载DC 诱导抗肝癌细胞免疫效应研究

目的:观察肝癌细胞来源的外泌体(T-exo)负载DC体外诱导细胞毒T细胞(CTL)对肝癌细胞的杀伤作用。方法:采用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度超速离心的方法从肝癌Huh-7细胞培养上清液中分离外泌体(T-exo),透射电镜鉴定形态,Western blot检测外泌体相关蛋白CD9、CD63、HSP70及肿瘤抗原分子AFP的表达;分离健康供者外周血单个核细胞(PBMC)培养DC,流式细胞术鉴定负载T-exo的DC细胞表型;用2-(4-碘苯)-3-(4硝基苯)-5-(2,4-磺苯基四氮唑)-2H-四唑单钠盐-1(WST-1)法检测负载T-exo的DC刺激T淋巴细胞增殖情况;流式细胞术Annexin-V/PI双染法检测负载T-exo的DC诱导CTL分别对AFP阳性Huh-7细胞及AFP阴性的SMMC7721细胞的杀伤作用。结果:透射电镜下可见T-exo为圆形或椭圆形双层膜囊泡状小体,大小不等,平均直径50~100 nm,表达外泌体膜相关分子及肿瘤抗原分子。负载T-exo的DC可促进初始T细胞增殖,T-exo致敏DC对AFP阳性的Huh-7肝癌细胞系杀伤活性明显高于AFP阴性的SMMC7721肝癌细胞组(P0.05)及未负载T-exo的对照组DC(P0.05)。结论:负载T-exo的DC能促进T细胞增殖,提高CTL细胞的细胞毒活性诱导特异性的抗肝癌效应。经T-exo抗原致敏DC诱导的CTL对肝癌细胞有明显的细胞毒作用,明显高于DC对照组(P0.05)。     

凋亡肿瘤细胞负载的树突状细胞对抗原特异性CTL的激活

为探讨凋亡Daudi细胞负载的树突状细胞 (DC )激发诱导肿瘤抗原特异性CTL及其生物学特性 ,采用常规方法从人外周血单个核细胞 (PBMC )诱导DC ,激发型CD40mAb联合 50Gyγ射线辐照诱导Daudi凋亡后负载DC ,然后与自体T细胞共育 ,并联合IL 2激发诱导肿瘤特异性CTL ;采用免疫荧光标记和流式细胞仪测定分析膜分子的表达 ;ELISA检测细胞因子的产生 ;Dextran FITC内吞实验分析DC的抗原摄取能力 ;3H掺入试验和51 Cr释放试验分别测定CTL的增殖和细胞毒效应。结果 :(1 )细胞因子序贯体外诱导 7d的DC ,对Dextran吞噬能力最强 ;(2 )CD40mAb诱导联合γ射线辐照 ,能有效介导Daudi细胞的凋亡 ;(3 )抗原负载联合CD40mAb激发可使DC上调表达CD1a、CD80、CD86和HLA DR ,并能促进IL 1 2的分泌 ;(4)凋亡Daudi负载后的DC在激发型CD40mAb作用下 ,能激发和扩增对Daudi细胞具有高效和特异杀伤作用的细胞毒性T细胞。因而认为凋亡肿瘤细胞负载联合CD40mAb刺激的DC可有效激活和扩增肿瘤特异性CTL。     

负载滋养层细胞抗原对小鼠树突状细胞表型及功能的影响

目的 研究负载滋养层细胞抗原对小鼠髓源性树突状细胞(DC)分化成熟过程的影响,获得致耐受性DC.方法 体外使用粒细胞巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)诱导小鼠骨髓细胞定向分化、经LPS刺激获得成熟DC;通过外胎盘锥组织块培养法获得滋养层细胞,制备可溶性抗原,加入DC培养体系.流式细胞术检测DC表面共刺激分子及MHC-Ⅱ的表达,ELISA法检测DC分泌IL-10和IL-12的浓度,混合淋巴细胞培养评估 DC刺激同种T细胞增殖、活化的功能.结果 成熟DC表型为CD40high CD80highCD86highMHC-Ⅱhigh,分泌大量的IL-12和极少量的IL-10 ,体外能有效刺激T细胞的增殖;负载滋养层细胞抗原的DC表型为CD40midCD80lo wCD86lowMHC-Ⅱlow,在分泌大量IL-12的同时IL-10也明显升高,不能有效刺激T细胞增殖,并使T细胞分泌细胞因子呈现明显Th2偏倚.结论 负载滋养层细胞抗原后的DC表面共刺激分子及MHC-Ⅱ表达降低,刺激T细胞增殖能力下降;其自分泌和促使T细胞旁分泌的细胞因子呈现Th2偏倚,是一种耐受性DC.     

青藤碱促进树突状细胞分化抑制其成熟

目的 探讨青藤碱对树突状细胞(Dendritic cell,DC)体外分化发育、成熟、抗原递呈及刺激T细胞活化能力的影响.方法 DC体外培养时,青藤碱处理,观察细胞生长情况,流式检测细胞表型及抗原内吞能力,混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞活化的能力,E(I)ISA检测细胞因子分泌.结果 与对照组相比,青藤碱处理DCCD1a表达上调而CD14下调,IL-12分泌减少,共刺激分子表达减少,同种T细胞刺激活性降低.结论 合适剂量的青藤碱能刺激单核细胞分化为不成熟DC但能抑制其进一步成熟.