NRF2/PI3K通路介导肝癌细胞SMMC-7721出现索拉非尼耐药的机制研究

目的探讨NRF2PI3K通路介导肝癌细胞SMMC-7721出现索拉非尼耐药的机制研究。方法建立肝癌细胞系SMMC-7721耐药细胞株SMMC-7721-SR,构建NRF2-siRNA转染肝癌细胞,并给与10μmol/L索拉非尼处理48 h。采用CCK-8法检测细胞活力,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平。Real-Time PCR检测NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt基因表达水平。结果索拉非尼明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的存活率,促进肝癌细胞SMMC-7721凋亡发生(P0.05)。索拉非尼对SMMC-7721细胞促凋亡作用明显强于SMMC-7721-SR细胞(P0.05)。SMMC-7721-SR细胞中NRF2蛋白水平及mRNA表达明显高于SMMC-7721细胞,Keap1、ARE、PI3K和Akt蛋白水平及mRNA表达明显增加(P0.05)。索拉非尼明显上调SMMC-7721细胞中NRF2蛋白水平及mRNA表达(P0.05)。抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理后,SMMC-7721-SR细胞存活率明显降低,凋亡率显著升高,Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白水平及mRNA表达明显降低(P0.05)。结论索拉非尼激活NRF2后诱导肝癌细胞SMMC-7721出现耐药;抑制NRF2可逆转肝癌细胞SMMC-7721对索拉非尼的耐药情况。     

5-氟尿嘧啶作用人肝癌细胞系SMMC-7721后残存细胞中肿瘤干细胞比例增加

目的主要探讨5-氟尿嘧啶(5-FU)作用肝癌细胞系SMMC-7721后残余细胞中NCAM/CD56、ICAM-1/CD54、EpCAM、CD133及ABCG2阳性细胞表达率的变化。方法检测不同浓度5-FU作用于SMMC-7721细胞系前后细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测残存细胞的细胞周期分布以及5种表面标志物阳性细胞表达率的变化。结果不同浓度5-FU均可抑制SMMC-7721增殖。使用10μg/mL的5-FU浓度作用48 h进一步研究,SMMC-7721细胞周期各期细胞比例均较对照组有影响,且G0/G1、S和G2/M期5-FU作用前后差异有统计学意义(P<0.05),G0/G1期阻滞明显。5-FU处理使SMMC-7721 5种细胞表面标志物阳性细胞比例均明显升高,差异均具有统计学意义(P<0.05),阳性细胞比例均明显升高。结论上述实验提示肝癌干细胞逃避5-FU单药物的杀伤可能是临床上肝癌化疗失败和肿瘤复发的重要原因,同时,此实验方法可以作为肝癌干细胞富集的科研模型。     

槲皮素联合survivin反义核苷酸对肝癌SMMC7721/ADM细胞MDR的逆转作用

目的 探讨槲皮素与survivin反义核苷酸(ASODN)联合应用对肝癌SMMC7721/ADM细胞多药耐药(MDR)的逆转作用.方法 选择肝癌敏感细胞株SMMC7721和MDR细胞株SMMC7721/阿霉素(ADM),观察其对四种不同化疗药物的耐药性及槲皮素、survivin反义核苷酸(ASODN)对SMMC7721/ADM细胞MDR的逆转效果.结果 槲皮素和ASODN联合时较两者单独应用时能显著降低四种化疗药物对SMMC7721/ADM细胞的半数抑制浓度(IC50) (P<0.05).槲皮素单独应用及联合ASODN时均能明显降低SMMC7721/ADM细胞的多药耐药基因1(MDR1)mRNA及p170和多药耐药相关蛋白基因(MRP)mRNA及p190的表达(P均<0.05). 结论 槲皮素与ASODN联合能明显逆转SMMC7721/ADM细胞对四种化疗药物的耐药性.槲皮素可能通过抑制MDR1 mRNA和MRP mRNA的表达使p170和p190的合成减少而发挥耐药逆转作用,ASODN不能通过该途径发挥作用.     

羟基喜树碱对人肝癌细胞增殖影响及凋亡诱导

目的 探讨羟基喜树碱对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的影响及其诱导凋亡的作用。方法 以不同浓度的羟基喜树碱在体外作用于人肝癌细胞株SMMC-7721,采用MTT法检测细胞增殖;化学荧光法检测Bcl-2的细胞表达;电镜观察、流式细胞仪与原位末端标记方法检测细胞凋亡情况。结果 与空白对照组比较,羟基喜树碱浓度在3.125μg/mL～100μg/mL组,对肿瘤细胞的增殖抑制率显著增高(P<0.01);在0.05mg/mL组出现细胞早期凋亡现象,Bcl-2表达明显减少;在0.1mg/mL组形成凋亡小体;细胞凋亡比例随羟基喜树碱浓度增加而增高。结论 羟基喜树碱在体外可抑制人肝癌细胞株SMMC-7721增殖,其作用机制可能系通过抑制Bcl-2表达诱导细胞凋亡。     

多药耐药基因反义寡核苷酸逆转肝癌细胞耐药的研究

目的 观察反义硫代磷酸酯寡核昔酸(AsODN)联合逆转耐药肝癌细胞多药耐药基因1(MDR1)和多药耐药相关蛋白基因(MRP)的作用。 方法 用人工合成互补于MDR1基因及MRP基因的反义20聚硫代磷酸寡核苷酸,以脂质体作载体,转染入耐阿霉素(ADM)肝癌细胞SMMC-7721/ADM,四甲基偶氮唑蓝法测定细胞对化学疗法药物的敏感性,流式细胞仪分析细胞相对荧光强度,激光扫描共聚焦显微镜测定细胞内Rhdaming123(Rh123)及柔红霉素(DNR)潴留以反映蛋白质p170和p190功能。 结果 ASODN/MDR1 MRP联合转染SMMC-7721/ADM细胞,能更大程度增加细胞对ADM(47.8倍)和DNR(21.6倍)的敏感性。ASODN/MDR1 MRP联合转染SMMC-7721/ADM细胞,与单独任一种ASODN转染相比,对p170或p190表达的抑制并不增加(q值分别为3.23、3.24,P>0.05)。 结论 针对MDR1 MRP的ASODN联合转染SMMC-7721/ADM细胞,能更大程度逆转肝癌细胞的耐药性。     

中药抗癌灵诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及其机制研究

目的 探讨复方中药抗癌灵对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及凋亡相关基因survivin和caspase-3表达的影响.方法 肝癌SMMC-7721细胞,以含100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、10% FBS的RPMI 1640培养液,在37℃、5%CO2的培养箱中培养,细胞生长至对数增殖期,更换含0、10、20、40 ml/L 抗癌灵新鲜培养液,用DDP(25 mg/L)为阳性对照组,药物作用时间均为48 h.采用MTT法检测细胞抑制率,TUNEL法检测细胞凋亡率,半定量RT-PCR检测survivin和caspase-3 mRNA表达.结果 与正常对照组相比,抗癌灵各浓度组细胞抑制率显著升高(P＜0.001),细胞凋亡率明显上升(P＜0.01),Caspase-3 mRNA表达显著上升(P＜0.05,P＜0.01),Survivin mRNA表达明显下降(P＜0.05,P＜0.01).结论 复方中药抗癌灵具有诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡的作用,其分子机制可能与上调caspase-3和下调survivin基因表达有关.     

肝癌干细胞逃避5-氟尿嘧啶单药杀伤可能是造成化疗失败的重要原因

目的通过观察5-氟尿嘧啶(5-FU)处理人肝癌细胞系BEL-7402和SMMC-7721,分析细胞生物学特性的变化。方法采用Cell Counting Kit-8法检测5-FU作用前后肝癌细胞系BEL-7402和SMMC-7721增殖能力的变化;采用流式细胞法检测细胞周期组成变化和细胞群体中肿瘤干细胞标志物EpCAM、ABCG2和ICAM-1阳性细胞的比例变化。结果 10μg.ml-15-FU作用48h后,BEL-7402和SMMC-7721细胞增殖均明显受抑制(P<0.05);两细胞系实验组静息期(G0/G1期)细胞比例较对照组均明显升高(P<0.05);两细胞系中肿瘤干细胞标志物阳性细胞比例均明显升高(P<0.05)。结论肝癌细胞系BEL-7402及SMMC-7721中的肿瘤干细胞能够逃避一定剂量5-FU的杀伤作用。肝癌干细胞逃避5-FU单药杀伤可能是造成临床化疗失败的重要原因。     

survivin反义寡核苷酸对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响.方法 人工合成survivin基因ASODN和正义ODN(SODN),并行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径转染SMMC-7721;分别用RT-PCR和Western blot检测survivin mRNA和蛋白表达;用MTT法检测ASODN对SMMC-7721增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡率;倒置显微镜观察细胞形态变化.结果 SMMC-7721可强表达survivin mRNA和蛋白;ASODN呈浓度依赖性抑制survivin mRNA和蛋白表达及SMMC-7721增殖,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M期.SODN对survivin mRNA和蛋白及SMMC-7721的增殖、细胞周期无明显抑制作用.结论 脂质体介导转染survivin ASODN可抑制细胞增殖、使细胞阻滞于G2/M期,从而促进细胞凋亡.     

牛蒡子苷元对肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的观察牛蒡子苷元（ARG）对肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法将不同浓度的ARG作用于SMMC-7721细胞,并设不加ARG对照组。MTT法测算细胞增殖抑制率、流式细胞术检测细胞周期及凋亡率,RT-PCR法检测细胞中的Bcl-2 mRNA。结果与对照组比较,随ARG浓度增加,SMMC-7721细胞增殖率逐渐降低（P均〈0.05）,G0/G1期细胞比例显著增加（P均〈0.05）,G2、M、S期细胞比例减少（P均〈0.05）;随ARG浓度增加、作用时间延长,SMMC-7721细胞凋亡率显著增加（P均〈0.05）,Bcl-2 mRNA表达量减少（P均〈0.05）。结论 ARG可明显抑制SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡;可能与ARG下调细胞中Bcl-2基因的表达有关。     

抗人DR5单克隆抗体诱导肝癌细胞株SMMC-7721凋亡实验研究

目的探讨抗人DR5单克隆抗体对肝癌细胞株SMMC-7721致凋亡作用。方法常规培养肝癌细胞SMMC-7721,通过MTT法检测细胞抑制作用,流式细胞术定量分析凋亡细胞率。结果抗人DR5单抗能够诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡,在抗人DR5单抗浓度2μg/ml作用48h,对肝癌SMMC-7721细胞的杀伤率可达50.10%,增加抗人DR5单抗浓度细胞凋亡作用无明显增加。结论抗人DR5单抗能够诱导肝癌细胞SMMC-7721凋亡,以死亡受体为靶点的抗体制剂为肝癌治疗提供新途径。