ENO1在胃癌干细胞中表达及其与胃癌侵袭转移的相关性研究

摘 要：［目的］ 探讨ENO1在胃癌干细胞中的表达及其对胃癌侵袭转移的影响。［方法］ 以胃癌SNU-5模型,实时荧光定量PCR和双色细胞免疫荧光检测ENO1在其分选的CD44+细胞中的表达情况。运用慢病毒载体稳定干扰SUN-5中ENO1的表达,并用实时荧光定量PCR和Western blot检验干扰效率。流式细胞术分选稳定干扰ENO1的SNU-5中CD44+细胞后（shRNA-ENO1）,实时荧光定量PCR检测其Oct-4、Sox 2以及干性相关基因Nanog的表达,同时分别进行细胞成球实验、体外侵袭与体内致瘤的胃癌干细胞生物学特性研究,Western blot检测ENO1对胃癌干细胞侵袭转移影响的相关分子机制。［结果］ SNU-5的CD44+细胞中ENO1基因和蛋白表达明显高于CD44-细胞,并建立稳定干扰ENO1的SUN-5。shRNA-ENO1细胞中干性基因Oct-4、Sox 2和Nanog中mRNA的表达显著低于PLV-Ctr细胞（P<0.05）。与PLV-Ctr细胞相比较,shRNA-ENO1细胞的自我更新能力、侵袭能力和肿瘤重量显著降低。Western blot检测shRNA-ENO1细胞中Vimentin、Snail和N-cadherin下调表达,同时E-cadherin上调表达,并伴随AKT和PI3K的磷酸化水平降低,提示ENO1的作用可能通过PI3K/AKT信号通路激活。［结论］ ENO1在胃癌干细胞中高表达,其在调控胃癌侵袭转移能力中发挥重要作用。     

缺氧诱导因子-2α对肝癌干细胞标记物EpCAM和CD133表达的影响

目的:研究缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)对肝癌干细胞标记物EpCAM和CD133表达的影响.方法:分别上调和下调肝癌细胞系HepG2细胞和Hep3B细胞中HIF-2α的表达,Real-time PCR检测EpCAM和CD133 mRNA表达的变化;Western Blot检测EpCAM和CD133蛋白水平的变化.结果:转染HIF-2α表达质粒后HepG2细胞和Hep3B细胞中EpCAM和CD133表达水平升高(P<0.05),干扰HIF-2α表达后肝癌细胞中EpCAM和CD133表达水平降低(P<0.05).结论:HIF-2α可能在肝癌细胞"干性"维持方面发挥着积极的作用.     

3D培养体系富集外周血中的循环肿瘤干细胞的研究

摘 要：［目的］ 探究建立3D培养体系富集外周血中的循环肿瘤干细胞。［方法］ 应用阴性筛选的方法富集外周血中的循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs),随后利用3D培养体系将富集得到的细胞进行培养。采用免疫荧光、定量RT-PCR对3D培养的前列腺癌LNCaP细胞系、肺癌H2347细胞系的干性表型特征进行分析。使用肺癌患者的血液样本分离CTCs进行3D培养验证该方法的可行性。 ［结果］ 在光镜下可观察到,在3D培养体系中从外周血分离的前列腺癌LNCaP细胞增殖形成肿瘤细胞微球。免疫荧光结果显示,在3D培养条件下成团生长的前列腺癌LNCaP细胞表达EpCAM和CD133。在3D无血清培养条件下,LNCaP细胞系成球率为18.67%±3.06%。前列腺癌LNCaP细胞在3D培养体系中与普通2D培养相比,干性相关基因CD133、CD44和ABCG2表达水平明显增高,3D培养的肺癌H2347细胞与普通2D培养相比,干性相关基因CD133表达水平明显升高。肺腺癌患者肺静脉血分离CTCs 3D培养,可形成多个微型肿瘤细胞微球（称为肺癌类器官）。在光镜下观察,同一个患者培养获得的肺癌类器官呈现不同的形态结构特征。［结论］ 利用3D培养体系能够培养外周血中的CTCs,并富集得到CD133+的肿瘤干细胞。肺癌患者的CTCs 3D培养能够形成肺癌类器官,并能够展现CTCs的异质性。     

高表达ANXA2肝癌干细胞外泌体对肝癌细胞恶性生物学特性的调控作用

摘 要：［目的］ 探讨肝癌干细胞来源外泌体中差异表达的蛋白质,重点分析外泌体ANXA2分子对肝癌恶性生物学特性（自我更新、侵袭和转移能力）的影响。［方法］ 采用无血清悬浮培养法和干细胞标志物流式分选术分离人肝癌干细胞;分别采用干细胞球形成实验、体外侵袭转移能力鉴定分离所得肝癌干细胞;采用蛋白质谱分析肝癌干细胞来源外泌体中的差异表达蛋白质;siRNA靶向抑制ANXA2表达后,分别进行肝癌细胞球形成实验、体外侵袭与迁移实验检测外泌体ANXA2对人肝癌细胞自我更新、侵袭、转移能力的影响;收集肝癌患者和正常人血浆,通过凝胶排阻层析联合CD63免疫磁珠分离纯化外泌体,Western blot检测外泌体中ANXA2表达情况,结合临床病理资料,综合分析外泌体ANXA2的临床相关性。［结果］ 成功分离得到肝癌干细胞CD133+ SK-Hep-1,其具有典型的肿瘤干细胞生物学特性。与CD133- SK-Hep-1细胞外泌体相比,CD133+ SK-Hep-1肝癌干细胞来源外泌体中具有多种差异表达蛋白,其中外泌体ANXA2表达明显上调。siRNA靶向抑制肝癌干细胞ANXA2表达后,其外泌体中ANXA2表达也下降。分别采用PBS、siRNA靶向抑制肝癌干细胞ANXA2后外泌体（Exo-LCSCs-siANXA2）、肿瘤干细胞来源外泌体（Exo-LCSCs）刺激肝癌细胞系HepG2、SNU398,其自我更新、侵袭和转移能力依次增强。Western blot结果显示,肝癌患者血浆外泌体ANXA2表达明显高于健康人血浆;肝癌患者血浆外泌体ANXA2表达与患者年龄、性别无明显相关性,而与肿瘤TNM分期和转移显著相关。［结论］ 高表达ANXA2的肝癌干细胞的外泌体对肝癌细胞恶性生物学特性具有调控作用。     

缺氧诱导肝癌细胞获得干细胞特性的初步实验研究

目的:观察缺氧对肝癌干细胞特性的影响.方法:用肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721建立细胞缺氧培养模型,利用倒置显微镜观察细胞形态学变化;克隆形成实验检测肿瘤细胞克隆形成能力;"肿瘤球"形成实验检测肿瘤细胞自我更新能力;实时定量RT-PCR和Western blot检测干细胞相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog mRNA和蛋白表达;采用流式细胞术检测干细胞表面标志物CD133表达.结果:缺氧条件下HepG2、SMMC-7721细胞克隆形成率显著高于常氧组(P<0.05).缺氧条件下HepG2、SMMC-7721细胞肿瘤球形成率显著高于常氧组(P<0.05).常氧条件下HepG2、SMMC-7721细胞中干细胞相关基因Oct-4、Sox-2、Nanog mRNA及蛋白表达水平极低,缺氧处理48 h后,其mRNA及蛋白表达水平明显增高(P<0.05).缺氧条件下HepG2、SMMC-7721细胞CD133阳性表达率表达量显著增加(P<0.05).在缺氧36 h和48 h,CD133蛋白表达水平显著增强(P<0.05).结论:缺氧能诱导肝癌细胞干细胞特性的获得.     

程序性死亡蛋白配体1在CD133+人肝癌干样细胞中的表达及功能研究

目的探讨肝癌干样细胞(LCSLC)中程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)的表达及其对LCSLC肿瘤干细胞特性和肿瘤生物学功能的影响, 探索LCSLC中调控PD-L1表达变化的上游信号通路和PD-L1调控干细胞特性和肿瘤生物学功能的下游分子机制。方法采用无血清球培养法培养肝癌细胞HepG2, 获得LCSLC。采用流式细胞术检测LCSLC中CD133等干性标志物分子的表达, Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测其干性特征分子和PD-L1的表达, 细胞功能实验检测其肿瘤生物学功能, 确认所获得的LCSLC具备肿瘤干细胞特性。以细胞信号通路抑制剂处理LCSLC, 明确介导PD-L1表达变化的相关上游信号通路。利用小干扰RNA(siRNA)下调LCSLC中PD-L1的表达, 检测干性特征分子的表达变化、LCSLC体内外肿瘤生物学功能变化以及下游细胞信号通路的变化。结果与普通HepG2细胞比较, LCSLC中CD133的表达率升高[分别为(92.78±6.91)%和(1.40±1.77)%, P<0.001], 干性特征分子CD133、Nanog、Oct4A...     

肿瘤干细胞标志物与非小细胞肺癌患者生存的相关性分析

摘 要：［目的］ 探讨肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）标志物与非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者预后的关系。［方法］ 入组53例2017—2018年在上海市胸科医院进行手术并病理确诊的ⅢA期NSCLC患者，通过单因素和多因素回归方法分析临床因素与NSCLC患者总生存期（overall survival，OS）的相关性。通过免疫组化检测CSCs标志物（OCT4、SOX2、CD44、ALDH1A1）在NSCLC中的表达，并进行免疫组织化学评分。将CSCs标志物高H评分、年龄和微乳头成分6项指标进行累加评分，定义为肿瘤干性指数。利用Kaplan-Meier法分析肿瘤干性评分与NSCLC患者OS的关系。［结果］ 多因素回归分析结果显示年龄(HR=1.948，95%CI：1.092～2.474，P=0.031）、微乳头成分（HR=2.720，95%CI：1.267～5.842，P=0.011）和CEA水平（HR=1.008，95%CI：1.000~1.015，P=0.040）与OS 显著性相关。免疫组化结果显示，OCT4在肺腺癌和肺鳞癌中均有较高的表达。在肺腺癌中，OCT4高表达组预后较差（P=0.004）。SOX2、CD44、ALDH1A1对肺癌预后的影响不明显。肿瘤高干性评分与OS显著性相关(HR=2.212，95%CI：1.245~3.676，P=0.024)。［结论］在肺腺癌患者中，OCT4高表达和肿瘤高干性指数可能与预后差相关。     

慢病毒介导Ras-GRF1调控肝癌干细胞干性维持与自我更新能力的机制

目的:探究Ras蛋白特异性的鸟苷酸释放因子1（Ras protein specific guanylate releasing factor 1,Ras-GRF1）在肝癌干细胞（cancer stem cells,CSC）生物学特性及自我更新中的作用,并初步探究其作用机制。方法:实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测人正常肝细胞系（HL-7702）和不同肝癌细胞系（Huh7、HepG2、Hep3B、CLC4、CLCl3、SMMC-7721）中Ras-GRF1表达水平;流式细胞术分选出肝癌干细胞,利用Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒感染肝癌干细胞,MTT法、EdU染色和平板克隆形成实验检测过表达Ras-GRF1对肝癌干细胞增殖能力的影响;Transwell小室实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞迁移与侵袭变化;成球实验检测过表达Ras-GRF1后肝癌干细胞的自我更新能力;蛋白免疫印迹（Western blot）检测肿瘤干细胞中Hippo信号通路关键蛋白大肿瘤抑制因子（large tumor suppressor,LATS）、Yes协同蛋白（Yes cooperative protein,YAP）和哺乳动物STE20样蛋白激酶（mammalian STE20-like protein kinase,MST）的蛋白及磷酸化表达水平。结果:不同肝癌细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量较人正常肝细胞中显著降低（P＜0.05）;分离到的肝癌干细胞在感染Ras-GRF1-pCMV6-GFP重组慢病毒后,细胞中Ras-GRF1 mRNA表达量显著升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;在两种肝癌干细胞 HepG2-CSC和SMMC-7721-CSC中,相较于空白对照组,Ras-GRF1-pCMV6组细胞增殖活性显著降低,EdU阳性染色数目和细胞克隆形成数目均显著减少,细胞迁移与侵袭数目也均显著减少,细胞成球能力明显降低,p-LATS/LATS、p-YAP/YAP及p-MST/MST蛋白表达显著增加,差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结论:通过慢病毒介导Ras-GRF1在肝癌干细胞中过表达后,能够抑制肝癌干细胞的增殖、迁移与侵袭,降低自我更新能力,其机制可能与调控Hippo信号通路相关。     

转化生长因子β1对肝癌细胞干性表型的调节作用

目的:探讨转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)体外对肝癌细胞干性特征的影响.方法:以转化H-ras的鼠肝肿瘤细胞LPC-H-ras和人肝癌细胞株PLC/PRF/5为研究对象,利用MTT法和多细胞球体培养法检测TGF-β1对肿瘤起始细胞增殖的抑制作用,FCM法检测细胞表面分子CD133的表达以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平;实时荧光定量PCR(real-time fluorogentic quantitative-PCR,RFQPCR)检测干细胞样基因的表达水平.结果:TGF-β1在体外能够改变LPC -H-ras细胞的形态并抑制细胞的生长;与未处理组相比,TGF-β1作用后,LPC-H-ras细胞表面CD133的表达降低,多细胞球体形成能力减弱,干细胞样基因的表达受到抑制;同样,在PLC/PRF/5细胞中,TGF-β1也能抑制CD133的表达、AFP基因表达以及多细胞球体的形成;另外,在LPC-H-ras细胞中,TGF-β1可诱导ROS表达升高,ROS的抑制剂N-乙酰半胱氨酸具有削弱TGF-β1诱导CD133表达下调的作用.结论:TGF-β1能够抑制肝癌起始细胞的增殖及干性,其作用机制可能与ROS表达上调有关.     

食管平滑肌瘤10例临床治疗体会

我院１９７５年６月～１９９０年７月共收治食管平滑肌瘤１０例，占同期食管肿瘤总数的０．１９２％（１０／１０９２）。位于食管上段２例，中段５例，下段３例。Ｘ线食管钡餐造影是诊断本病的主要方法。行食管粘膜外肿瘤摘除９例，食管部分切除１例，效果良好。本文就其诊断与手术治疗进行了讨论。     

仙人掌原液毒性的初步研究

背景与目的： 研究仙人掌原液的毒性。 材料与方法： 小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。 结果： 仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g/kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论： 在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

Assessment of the degree of carcinogenicity of small doses of nitrites

Chronic experiments on CBA and C57B1 mice and acute experiments on CBA mice established: (a) carcinogenic effect of sodium nitrite given continuously with drinking water (0.1; 1.0 and 10.0 maximum allowable concentration) in combination with morpholine fed with bread, and (b) endogenous synthesis of nitrosomorpholine as a result of simultaneous intragastric administration of same doses of sodium nitrite and morpholine. Also, nitrosomorpholine and N-nitrosodimethylamine synthesis was observed in vitro following addition of low-dose sodium nitrite, morpholine and amidopyrine to human gastric juice. Carcinogenic hazard associated with low-dose nitrite consumption in humans is discussed.     

仙人掌原毒性的初步研究

背景与目的:研究仙人掌原液的毒性。材料与方法:小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30 d喂养试验。结果:仙人掌原液雌、雄小鼠LD50均大于20.0 g／kg,属无毒物质;Ames试验、微核试验和精子畸形试验结果均为阴性;大鼠30 d喂养试验结果显示该样品30 d喂养对大鼠各项观察指标未见毒性作用。结论:在本次实验条件下,仙人掌原液为无毒物质,未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。     

中晚期贲门癌148例的外科治疗

目的　总结贲门癌手术治疗影响生存率的因素 ,提供今后工作参考。方法　对 14 8例经手术治疗的贲门癌患者进行术后并发症、绝对生存率的X2 检验。结果　本组切除率为 94.5 9% ,近半胃切除占 72 .14 % ,1、3、5年生存率分别为 67.9%、45 %和 2 4.3 %。病期、外侵程度和淋巴结转移等因素对 5年生存率有显著影响 (P <0 .0 1)。术后并发症以吻合口瘘及肺癌并发症为多见 ,其发生率为 3 .6% ,手术死亡率 1.4%。结论　提高生存率的关键在于早期诊断 ,根治手术和术后积极综合治疗。     

胆囊癌29例分析

目的探索胆囊癌的防治方法。方法分析29例胆囊癌病人临床资料、治疗方法及结果。结果术前诊断明确者21例，剖腹探查发现已属晚期，9例为Ⅳ期行根治术，12例为Ⅴ期未行根治术，均于术后1年内死亡。术前怀疑胆囊癌者5例，剖腹探查冰冻切片证实为Ⅴ期及Ⅳ期者各1例，Ⅴ期未行根治术，Ⅳ期行根治术，均于术后1年内死亡；Ⅲ期者3例，行胆囊癌根治术分别于术后10月、13月、17月死亡。2例术中冰冻切片发现的Ⅱ期胆囊癌，行胆囊癌根治术，分别于术后23月、26月死亡。1例意外胆囊癌属Ⅰ期胆囊癌，术后5年半死亡。结论要减少胆囊癌危害，重在及时治疗胆囊结石。     

胰头癌手术切除可能性的术前评价

目的通过总结胰头癌病人的临床表现和影象学检查结果来评价手术切除的可能性。方法总结32例胰头癌病人的临床表现和CT、磁共振（MRI）检查结果,判断肿瘤是否已发生邻近浸润或远处转移,以此来评价其手术切除的可能性。结果在22例作CT检查的病例中,判断正确的为17例,准确率为77．3%。作MR检查9例,全部判断正确,准确率为100%。结论某些特殊的临床表现和CT、MR检查对判断肿瘤是否发生邻近浸润或转移有较大价值,为术前评价手术切除的可能性提供依据。