柯萨奇病毒B组5型非结构蛋白3C表达纯化及多克隆抗体的制备

目的 表达和纯化柯萨奇病毒(CVB5)非结构蛋白3C,免疫雄性大鼠制备多克隆抗体.方法 通过酶切质粒获取3C基因序列,构建到原核表达系统大肠埃希菌中诱导表达重组的3C蛋白,使用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和考马斯亮蓝染色法(BSA)对重组蛋白的纯度与浓度进行分析,重组的3C蛋白作为抗原,免疫雄性SPF级大鼠获得多抗血清,用ELISA测定抗体效价并Western印迹检测抗体特异性,用该抗体检测病毒在细胞内的复制.结果 构建了重组表达载体命名为3C-pET-28a,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达重组3C蛋白.ELISA测定制备的多抗血清效价为1:500 000,Western印迹检测在EV71、CVA16中都有交叉反应,并确定病毒感染细胞后24 h开始复制.结论 实验成功地利用原核表达系统表达柯萨奇病毒非结构蛋白3C,为进一步研究柯萨奇病毒的感染机理以及疫苗制备提供了基础.     

柯萨奇病毒B组3型VP1蛋白的原核表达及免疫效果研究

目的:用原核细胞表达柯萨奇病毒B组3型VP1蛋白并观察其免疫效果.方法:构建原核表达质粒pET-his/VP1,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,诱导VP1蛋白的表达并纯化.BALB/c小鼠随机分为实验组和对照组.实验组腹腔注射VP1蛋白,对照组注射PBS,每3周免疫1次,共免疫3次.每次免疫后2周取血清,用微量中和试验法检测血清CVB3特异性中和抗体滴度;末次免疫后3周,每组随机取3只小鼠,用细胞计数试剂盒检测淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性;每组另随机抽取3只腹腔注射3LD50CVB3,第7天检测血中病毒滴度;用致死量的CVB3攻击每组剩余12只小鼠,观察免疫保护作用.结果:实验组小鼠血清中和抗体滴度随免疫次数增加而提高(P＜0.05),第3次免疫后中和抗体滴度达70.79±1.31,明显高于PBS对照组(P＜0.05);非特异性淋巴细胞增殖活性亦明显高于PBS组(P＜0.05),但特异性淋巴细胞增殖活性和CTL杀伤活性两组间无统计学差别(P＞0.05);CVB3攻击后,实验组小鼠血中病毒滴度显著降低,生存率达33.33%,而PBS组小鼠无存活,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:VP1蛋白可显著增强小鼠的体液免疫应答水平,提高致死量CVB3感染后小鼠的生存率.     

柯萨奇B组病毒VP1胞质表达系统的建立

目的　利用T7RNA聚合酶介导的胞质表达系统增加目的抗原的表达量 ,提高基因疫苗的免疫效果。方法　 (1)构建带有T7启动子、脑心肌炎病毒 (EMCV) 5′非编码区和柯萨奇B组病毒衣壳蛋白VP1的质粒pT7EMCVP1。将该质粒和编码T7RNA酶的pAR 3132共转染HeLa细胞和小鼠腹腔巨噬细胞 ;(2 )将上述质粒分别转化减毒鼠伤寒沙门菌SL72 0 7,让带有不同质粒的两种载体细菌共感染小鼠腹腔巨噬细胞。结果　 (1)经共转染 ,在HeLa细胞和小鼠腹腔巨噬细胞中 ,目的抗原VP1在胞质中的表达比单独转染真核表达质粒pcDNA3VP1增加 2～ 4倍 ;(2 )两种质粒载体细菌感染小鼠巨噬细胞后 ,目的抗原VP1也能在细胞中较好表达。结论　pT7EMCVP1和pAR 3132能在HeLa细胞和小鼠腹腔巨噬细胞胞质中表达 ,且表达量比单独转染真核表达质粒pcDNA3VP1明显增加     

柯萨奇B1病毒VP1基因序列分析

柯萨奇病毒Ｂ组 (ＣＶＢ)有 6个血清型 (ＣＶＢ1～ 6 ) ,是引起人类病毒性心肌炎等疾病的主要病原 ,近年来其发病呈上升趋势 ,目前尚缺乏有效防治措施。ＣＶＢＶＰ1基因编码其主要中和抗原 ,本研究拟克隆柯萨奇Ｂ1病毒 (ＣＶＢ1)中国分离株的ＶＰ1基因并测定其序列 ,以期为我国ＣＶＢ1感染的防治提供理论基础。1　材料和方法1 1　材料　ＣＶＢ1中国分离株由哈尔滨医科大学克山病研究所提供。ｐＭＤ18 Ｔ(ＴａＫａＲａ公司 )为 2 7ｋｂ的ＴＡ克隆载体。Ｖｅｒｏ细胞和ＪＭ10 9菌株由中国预防医学科学院病毒学研究所诊断二室提供。ＶＰ1的Ｐ…     

柯萨奇病毒A10型VP1蛋白生物信息学分析

目的 对手足口病柯萨奇病毒A10型(CVA10) VP1蛋白进行生物信息学分析.方法 利用生物信息学软件对分离的毒株与CVA10其他基因型进行同源性比对,并构建系统进化树;预测和分析VP1蛋白的理化特性、二级结构和三级结构以及该蛋白的B细胞抗原表位.结果 JN-C10与CVA10 D型基因组同源性最高,核苷酸和氨基酸的同源性分别为91.0％-97.6％和90.4％-98.6％,属于D亚型.JN-C10 VP1基因全长为732个核苷酸,理论相对分子质量为60 580道尔顿,理论等电点为5.10,其二级结构中以无规则卷曲为主,属于胞外蛋白.以已知结构的蛋白质3vbhA为模板,构建JN-C10株VP1蛋白三级结构模型.综合多种抗原表位分析方法得出,JN-C10株VP1蛋白的B细胞抗原表位可能是13-22、101-108、120-127、169-180、213-230 5个区段等区域.结论 JN-C10毒株VP1蛋白多个可能B细胞抗原表位的预测,将为CVA10有效免疫疫苗的制备、特异性诊断系统的发展提供重要的参考依据.     

间接ELISA检测柯萨奇B组病毒抗体

用PEG处理的CoxB病毒抗原,建立了快速测定该组1～6型病毒抗体的ELISA法,其特异性与中和试验相同。用此法测定健康人330名,病毒性心肌炎患者122例,不明原因发热患者45例。结果显示:健康人群普遍存在低水平该组病毒抗体。CoxB病毒感染与病毒性心肌炎密切相关,也是原因不明发热的重要病因,因此该项检查对CoxB组病毒感染的病因诊断有重要意义。     

柯萨奇B组病毒IgM抗体特性研究

目的 研究柯萨奇B组病毒（CVB）感染后患者急性期CVB－IgM抗体的反应特性。方法 对临床确诊为CVB感染的患者急性期血清用免疫印迹法检测CVB－IgM抗体。结果 患者的急性期血清IgM抗体均仅针对CVB的VP1抗原反应。经ELISA与免疫印迹方法的比较表明：用免疫印迹法检测的CVB－IgM抗体可对CVB各型病毒抗原反应,具有CVB各型病毒之间的交 叉反应性。而同时,在16例ELISA检测反应阴性的健康人血清中未见有CVB的VP1特异性的IgM抗体存在。结论 临床感染CVB的患者急性期,其血清中的特异性的IgM抗体是针对CVB的VP1抗原,而且,此类抗体对各型的CVB抗原具有交叉反应性。     

柯萨奇病毒A6 型VP1 蛋白的生物信息学分析

目的:预测柯萨奇病毒A组6型(Coxsackievirus A6,CVA6)的衣壳蛋白VP1的基本理化性质、结构功能及线性B细胞表位。方法:应用Bioedit软件、Sub Loc、Target P和生物信息学资源门户Ex PASy中的多种在线工具对CVA6 VP1的氨基酸序列进行分析。结果:CVA6 VP1为一亲水性蛋白,其相对分子量为33.6 k D,等电点为7.92,含有24个可能的磷酸化位点,没有信号肽、跨膜区和可能的脂酰化位点;其二级结构中以无规则卷曲居多,有48.52%的氨基酸残基暴露于溶液界面;该分子内存在多个潜在的线性B细胞表位,其中的155~165位氨基酸残基区域的抗原指数最高。结论:成功预测到CVA6 VP1的基本理化性质、结构功能特征及可能的线性B细胞表位,为该蛋白的进一步研究及疫苗和免疫诊断试剂的研制打下基础。     

柯萨奇B组病毒的研究进展

柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＶＢ）隶属于小ＲＮＡ病毒科，病毒毒粒小，单链线状ＲＮＡ，其感染可引起病毒性心肌炎等人类多种疾病。本文就该组病毒的核酸结构、毒粒蛋白组成、受体分子的研究和对发病机理的认识作一较为概括性的综述。     

新生儿肺炎患者血清柯萨奇B组病毒抗体测定

新生儿肺炎患者血清柯萨奇Ｂ组病毒抗体测定李芳秋，熊华，宋韶鸣，于毅，杨毓华南京军区总医院微生物科南京２１０００２柯萨奇Ｂ组病毒（ＣＢＶ）是引起新生儿肺炎的病原之一［１］。本文利用ＥＬＩＳＡ法，对９０例新生儿肺炎患者血清ＣＢＶ－ＩｇＭ、ＣＢＶ－ＩｇＧ抗...     

ELISA法检测血清中柯萨奇B组病毒抗体

以柯萨奇Ｂ组１－６型病毒感染的Ｖｅｒｏ细胞上清液作抗原，建立了间接ＥＬＩＳＡ法，用于检测心肌炎患者血清中ＣｏｘＢ１－６型病毒ＩｇＧ抗体，ＩｇＧ抗体滴度≥６４００者定为阳性，在４４例心肌炎患者中有３１例为阳性占７０．４５％，其阳性检出率明显高于正常对照组，后者仅占７．４１％。     

柯萨奇B3病毒VP1基因在原核中的表达及其临床意义

目的：研究柯萨奇B3病毒（CVB3）VP1基因在大肠杆菌中的表达及其临床意义。方法：将柯萨奇B3病毒中国分离株VP1基因克隆入PQE-30载体,转导入大肠杆菌（Ml5）中,使CVB3的VP1基因在大肠杆菌中得到稳定的表达,采用NAT亲和方法纯化,间接ELISA方法做免疫学活性鉴定。结果：表达的VP1产物与抗柯萨奇B3病毒的兔抗CVB3（多克隆抗体）血清产生较强的免疫反应,与天然的CVB3蛋白抗原（病毒组织培养抗原）的抗原性近似。应用无关兔抗体对照呈阴性反应。应用表达的VP1产物作为抗原,对临床急性病毒性心肌炎患者血清进行了特异性IgM酶联免疫吸附试验检测,其结果与组织培养的CVB3制备的细胞蛋白抗原对上述患者血清的特异性IgM检测结果基本一致。结论：采用基因工程方法制备出的CVB3-VP1蛋白抗原产量高,纯化后免疫反应原性基本没有变化。试用表达CVB3的VP1基因工程抗原代替目前实验用有感染危险的病毒培养抗原的方法,快速、特异地检出CVB3的感染,为急性心肌炎的早期诊断和及时的临床治疗提供可靠的实验室诊断指标。     

人肠道病毒71型VP0蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的:原核表达并纯化人肠道病毒71型(EV71)VP0蛋白,免疫豚鼠制备多克隆抗体,并鉴定其用于EV71检测的反应性和特异性。方法:PCR方法扩增VP0基因,构建原核表达质粒pET-VP0并转化大肠杆菌,诱导表达并纯化VP0重组蛋白,免疫豚鼠制备抗VP0多克隆抗体,ELISA方法检测抗VP0抗体效价,细胞免疫荧光和Western blot方法鉴定抗体特异性。结果:VP0重组蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达,制备的抗VP0抗体效价为1∶106。细胞免疫荧光及Western blot检测结果显示,抗VP0多克隆抗体可以识别原核表达及EV71感染细胞中的VP0蛋白。结论:原核表达了EV71的VP0蛋白并制备出抗VP0多克隆抗体,为EV71的临床诊断、疫苗开发和分子病毒学研究提供了新的研究工具和手段。     

柯萨奇病毒B3 VP1蛋白、rAd/VP1和pcDNA3/VP1的免疫效果比较

目的 观察柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)衣壳蛋白VP1、表达VP1蛋白的重组腺病毒rAd/VP1和重组质粒pcDNA3/VP1的免疫效果.方法 用原核细胞表达VP1蛋白并纯化、扩增重组腺病毒rAd/VP1,扩增并提取真核表达质粒pcDNA3/VP1.BALB/c小鼠随机分为4组,每组18只,分别在股四头肌注射VP1蛋白、rAd/VP1、pcDNA3/VP1和PBS.VP1蛋白组和pcDNA3/VP1组免疫3次,间隔3周;rAd/VP1组免疫2次,间隔2周.VP1蛋白、pcDNA3/VP1和rAd/VP1每次每只注射剂量分别为50μg、100μg和1.2×107PFU.用ELISA法和微量中和试验法检测各次免疫后血清CVB3特异性IgG抗体和中和抗体滴度;末次免疫后3周,CCK-8法检测脾脏淋巴细胞的CTL杀伤活性;用致死量CVB3攻击小鼠后,检测血中病毒滴度并观察动物的存活情况.结果 VP1蛋白组血清特异性IgG抗体和中和抗体滴度明显高于其他实验组(P＜0.05),而脾脏淋巴细胞CTL杀伤活性低于rAd/VP1组(P＜0.05);致死量病毒攻击后,VP1蛋白组血中病毒滴度低于pcDNA3/VP1和rAd/VP1组(P＜0.05),生存率明显高于这两组(P＜0.05).结论 VP1蛋白疫苗能诱导较高水平的体液免疫应答,对动物有明显的免疫保护作用,免疫效果优于质粒pcDNA3/VP1和重组腺病毒rAd/VP1.

Abstract：

Objective To compare the immune effects of Coxsackievirus B3 (CVB3) capsid protein VP1 expressed bacterially, recombinant adenovirus rAd/VP1 and recombinant plasmid pcDNA3/VP1which express VP1 protein in mice. Methods After expressed in prokaryotic cells, VP1 protein was purified. Recombinant adenovirus rAd/VP1 and recombinant plasmid pcDNA3/VP1 were amplified and extracted. Six to 8-week-old, male BALB/c mice were divided into four groups randomly. Each group contained 18 mice. The mice of pcDNA3/VP1 group or VP1 protein group were immunized intramuscularly with three injections at three weeks apart, of recombinant plasmid pcDNA3/VP1 at a dose of 100 μg/mouse or recombinant protein VP1 at a dose of 50 μg/mouse. The mice of rAd/VP1 group were immunized intramuscularly twice at two weeks interval with rAd/VP1 at a dose of 1.2 × 107 PFU. The control group was mock-immunized with 100 μl of PBS intramuscularly. Mice were bled from the retroorbital sinus plexus every two weeks after each immunization. ELISA and micro-neutralization test were used to detect levels of CVB3-specific IgG antibody and neutralizing antibody titers in the sera of immunized mice. Three weeks after the last immunization, the cytotoxic T lymphocyte(CTL) killing activity of spleen lymphocytes was detected with CCK-8 assay. Subsequently, virus titers in the sera of immunized mice were determined by the 50% cell culture infective dose( CCID50 ) assay on HeLa cell monolayers and percentage of animals surviving were observed after lethal CVB3 attack over a period of 21 days. Results The titers of specific IgG antibody and neutralizing antibody in sera of VP1 protein immunized mice were higher than other groups( P ＜0.05 ). While CTL killing activity of spleen lymphocytes of VP1 protein immunized mice was lower than mice in rAd/VP1 group( P ＜0. 05). Virus titers in sera of VP1 protein immunized mice were lower than the mice in pcDNA3/VP1 or rAd/VP1 groups ( P ＜ 0.05 ), while survival rate was significantly higher than these two groups ( P ＜ 0.05 ).Conclusion VP1 protein induced higher level of humoral immune response and acquired obvious immune protection effects in mice. The immunizing potency of VP1 protein vaccine surpassed plasmid pcDNA3/VP1or recombinant adenovirus rAd/VP1. It appeared to be a promising candidate among the three different vaccines.     

海南省2010年柯萨奇病毒A组16型VP1区基因特征分析

目的 分析2010年引起海南省手足口病流行柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CA16）的分子流行病学特征.方法 从海南省2010年手足口病（hand,foot,and mouth disease,HFMD）标本中分离到56株CA16毒株,用RT-PCR的方法对VP1编码区扩增及核苷酸序列的测定和整理分析,并与CA16各基因型和基因亚型的代表株序列构建亲缘关系进化树.结果 其中34株属于B基因型中的B1a基因亚型,22株属于B1b基因亚型.B1a基因亚型的毒株主要分布于海口市以及海南省西北部相邻的4个县市,B1b基因亚型的毒株主要分布于海口市以及海南省中部、西南部相邻的4个县市.结论 2010年海南省B1a和B1b基因亚型在人群中共循环,两个基因亚型呈现一定区域性分布的特点,提示在海南省CA16至少存在两条大的传播链.在2008年至2010年,海南省手足口病例中CA16感染的比例明显上升,分别为8.05％、5.35％、35.45％.     

柯萨奇病毒B3VP1重组腺病毒载体疫苗rAd/VP22-L-VP1的构建及表达**

背景：VP22是单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1,HSV-1)UL49基因编码的碱性蛋白质,具有蛋白转导结构域(protein transduction domain, PTD),能够把与之融合的蛋白或与之结合的DNA 等大分子跨膜送递到邻近细胞,在基因靶向预防中表现出优势。 目的：构建表达单纯疱疹病毒1型VP22与柯萨奇病毒B3主要中和抗原VP1融合蛋白的重组腺病毒载体疫苗,观察外源基因在HEK293细胞中的良好表达。 方法：PCR法扩增目的基因HSV-1 VP22和CVB3 VP1,经Linker连接,将VP22-L-VP1插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒AdTrack-CMV/VP22-L-VP1。再将此载体与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组,生成重组腺病毒质粒pAd/VP22-L-VP1,脂质体介导pAd/VP22-L-VP1转染HEK293细胞包装重组腺病毒rAd/VP22-L-VP1。HEK293细胞上进行病毒扩增和滴定并检测外源基因的表达。 结果与结论：构建的重组腺病毒载体pAd/VP22-L-VP1经过第4轮扩增,其滴度达到6.77×107 pfu/mL,体外感染293细胞可见VP22和VP1融合蛋白的表达。说明实验成功构建并包装重组腺病毒rAd/VP22-L-VP1。     

柯萨奇B组病毒致病性的分子生物学研究

柯萨奇B组病毒(coxsackievirus group B,CVB)是微小RNA病毒科肠道病毒属成员,病毒性心肌炎的病例中大约有20%~25%是由柯萨奇B组病毒引起.CVB的致病机制十分复杂,病毒基因组以及病毒蛋白均在病毒致病过程中发挥重要作用.因此,对柯萨奇B组病毒的基因组、结构蛋白以及某些非结构蛋白与靶细胞内分子间相互作用生物信息的认识是阐述该病分子机制的基础.     

柯萨奇B组病毒致病的分子生物学机制

本文对柯萨奇B组病毒（CVB）致病性与抗原性的近期研究内容进行了复习，CVB的每个血清型存在多种毒株。病毒基因组编码区与非编码区核苷酸决定CVB的致病力。心肌球蛋白的氨基酸序列与疾病的发生有关联。T细胞基因在CVB致病及CVB蛋白2PC在CVB性自身免疫反应中均有重要地位。