转染重组质粒pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1的肝细胞系的建立及功能评价

目的:获得一株适合用于生物人工肝支持系统的细胞材料.方法:用已构建好的重组质粒pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1转染肝脏肿瘤细胞系C3A,用Zeocin筛选,所得细胞系命名为C3A-未优势化;通过qRT-PCR方法检测目的基因表达情况;对转染重组质粒的肝脏肿瘤细胞系C3A的合成、代谢、解毒等功能及性状进行综合评价.结果:成功构建了转染重组质粒pBudCE4.1-CYP3A4-GSTA1的细胞系;构建好的C3A-未优势化细胞系通过qRT-PCR方法检测其目的基因CYP3A4和GSTA1的表达量较正常C3A细胞系高;通过色谱法证明CYP3A4活性较正常C3A细胞系高;用免疫组织化学实验证实目的基因GSTA1的表达较正常C3A细胞系多;另外,对利多卡因的代谢能力亦高于正常C3A细胞.结论:构建的C3A-未优势化细胞系功能有所改善,有望成为生物人工肝系统的细胞材料.     

CYP3A29稳定表达HepG_2细胞株的建立及其硝苯地平代谢活性鉴定

目的建立稳定表达Bama小型猪CYP3A29的HepG2细胞株。方法通过总RNA提取、经RT-PCR得到Bama小型猪CYP3A29的基因,并将此基因克隆至亚克隆载体PMD18-T上得到重组质粒pMD-3A29;以测序正确的重组质粒pMD-3A29为模板,采用PCR扩增CYP3A29基因并在其3′添加组氨酸标签,扩增产物经BamHI/XhoI双酶切,将带有组氨酸标签的CYP3A29基因定向克隆至pcDNA3.1(+)中,并测序验证;将测序正确的CYP3A29基因通过脂质体转染至HepG2细胞,G418筛选10代,经RT-PCR及Western-blot分析及探针药物硝苯地平对重组细胞进行活性鉴定。结果与HepG2相比,HepG2-CYP3A29细胞株具有极显著的硝苯地平氧化活性。结论成功建立了稳定表达CYP3A29的HepG2细胞株,可用于相关药物代谢研究。     

含有MS4A7基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建及意义

目的构建含有人4次跨膜监视蛋白A（MS4A）基因启动子的萤火虫荧光素酶报告基因质粒。方法用PCR方法扩增获得含有人MS4A7基因启动子的DNA片段,将其连接至TA克隆质粒后转移至虫荧光素酶质粒pGL3-basic中,得到pGL3-MS4A7-Promoter重组质粒;经限制性内切酶酶切、PCR及测序鉴定得到确认;将该质粒转染进入HL-60细胞,并检测细胞中虫荧光素酶的活性。结果 pGL3-MS4A7-Promoter重组质粒插入片段和相邻序列正确,克隆的MS4A7基因片段有启动子活性。结论成功构建了pGL3-MS4A7-Promoter报告基因质粒,为进一步研究MS4A7基因的表达调控奠定了基础。     

铜绿假单胞菌重组Bb-OprF疫苗构建及鉴定

目的构建和鉴定铜绿假单胞菌重组双歧杆菌(rBb) OprF疫苗。方法以铜绿假单胞菌PAOl标准株提取总RNA为模板,自行设计引物,RT PCR扩增获得OprF抗原编码基因,经酶切、连接定向克隆入大肠埃希菌 双歧杆菌穿梭表达载体pGEX 1λT,构建重组质粒pGEX OprF。转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,抽提质粒行酶切电泳和测序验证后,电穿孔转化到Bb中,构建铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,抽提质粒进行PCR扩增鉴定。结果RT PCR扩增出1 016bp的OprF编码基因;重组质粒经双酶切鉴定,切出4 947bp的载体片段和10 16bp的目的基因片段;以rBb抽提质粒为模板进行PCR扩增可得到1 016bp的oprF基因片段。结论成功构建了铜绿假单胞菌rBb OprF疫苗,为该疫苗的进一步研究奠定基础。     

弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70复合基因真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒。方法根据HSP70基因序列,设计合成HSP70基因的引物,PCR扩增HSP70基因片段,克隆入pMD18-T载体,再经酶切、连接等,亚克隆至pcDNA3-ROP2-p30表达重组质粒中,并进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 PCR扩增出长度为916bp的HSP70基因片段,将其克隆到pMD18-T中,成功亚克隆获得pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒。测序结果显示,pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒包含了HSP70蛋白基因完整序列。结论成功构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒,为下一步核酸疫苗的研究奠定了基础。     

zs株弓形虫P22基因片段在巨噬细胞中的表达

目的　克隆表达ZS株弓形虫表膜抗原P2 2编码基因的巨噬细胞株。方法　扩增P2 2编码基因ORF的全长 5 6 1bp片段 ,经PstI、XbaI双酶切后 ,定向克隆于质粒 pBudCE 4 .1,构建真核重组表达质粒 pBudCE 4 .1/P2 2 ,通过脂质体介导转染入小鼠巨噬细胞RAW2 6 4 .7,以RT PCR方法鉴定目的基因在巨噬细胞中的表达。结果　成功获取pBudCE 4 .1/P2 2转染的巨噬细胞阳性克隆 ,并证实P2 2 mRNA在阳性克隆细胞中的表达 ,为P2 2蛋白对巨噬细胞的免疫调节功能作用的研究奠定基础。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列2的克隆与表达

目的 构建SARS冠状病毒棘突蛋白部分序列2(S2)的原核表达质粒，分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法 采用逆转录聚合酶链式反应技术从SARS冠状病毒基因组中扩增出编码S蛋白的第2170到2814位碱基的基因片段，克隆至pMD18-T载体，PCR筛选阳性克隆并测序。用限制性内切酶消化后，目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌．JM109，PCR和双酶切鉴定转化菌落。将阳性菌落经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达。结果 RT—PCR扩增出S2特异片段，经测序与GenBank比对存在1处碱基突变。S2基因片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2构建成重组表达质粒，并在JM109中表达了S2融合蛋白。结论 成功构建了SARS冠状病毒S2的重组表达质粒，并在大肠杆菌中表达了S2融合蛋白。     

真核表达载体质粒pcDNA4/rhHIF-1α的构建与鉴定

目的 构建重组人缺氧诱导因子-lα（HIF-lα）真核表达载体质粒pcDNA4/rhHIF-1α,为进行人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体的制备研究奠定基础。方法 从人血细胞中提取总RNA,RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对引物分别调取目的基因片段A和B,与T载体连接后转化大肠杆菌JM109,LB平板筛选菌落,提取质粒。测序正确后双酶切先后克隆进入pcDNA4/HisMaxA载体。结果 获得重组质粒pcDNA4/rhHIF-1α,经PCR扩增获得的目的基因相对分子质量与预计相同,插入pcDNA4/HisMaxA载体部位正确。结论 重组的人HIF-lα真核表达载体质粒pcDNA4/rhHIF-1α构建成功,所选用的pcDNA4/HisMax可高表达目的基因,可用于人HIF-1α基因的克隆与表达及其抗体制备的研究。     

日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体基因的构建和表达

目的　构建日本血吸虫单克隆抗独特型抗体NP30单链抗体 (scFv)基因。　方法　通过PCR方法体外扩增并经测序验证的重链、轻链可变区 (VH、VL)基因先后重组入原核表达质粒 pTHA90相应的位点上 ,中间通过一连接肽 (Gly4 Ser) 3基因连接构建成单链抗体基因 (scFv) ,连接产物转化相应受体菌Top1 0 ,提取质粒 ,酶切鉴定重组克隆。表达产物经ELISA方法测定活性。　结果　重组克隆经酶切鉴定可见预期大小的片段 ,表明重组成功。表达产物经ELISA检测 ,OD4 92 值为 1 .0 6 ,高于阴性对照 3倍以上 ,证实具有与相应抗原结合的能力。　结论　成功地构建了scFv基因 ,且其表达产物保留了抗体的亲和性和特异性     

恶性疟原虫海南株CSP3′末端基因的克隆及序列分析

目的　构建恶性疟原虫海南株 (FCC1 HN)CSP3′末端基因的原核表达载体 ,并对CSP3′末端基因进行序列测定。方法　根据恶性疟原虫CSP编码的基因序列设计引物 ,采用PCR技术扩增出CSP3′末端基因 ,将其克隆入原核表达载体pGEX 4T 1,转化大肠杆菌JM10 9;阳性重组质粒经PCR、酶切鉴定 ,用双脱氧链末端终止法进行序列测定。　结果　从恶性疟原虫基因组中扩增出CSP3′末端基因 ,其片段大小为 2 2 5bp ,构建的阳性重组质粒pGEX 4T 1 CSP3′末端经PCR和酶切鉴定与预期结果一致 ,测序结果进一步确认了插入片段的正确性。　结论　成功地构建了CSP3′末端的原核重组质粒 ,为进一步研究其功能奠定了基础。     

巨噬细胞内表达的人颗粒溶素对胞内结核分枝杆菌的杀菌活性

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)的真核表达质粒并探讨其表达后对巨噬细胞RAW264.7内结核分枝杆菌的杀菌能力.方法利用套式PCR从同种异型抗原激活的人CTL中扩增出GLS基因,并克隆入pBudCE4.1载体,构建重组质粒.将其转染至感染结核分枝杆菌H37Rv的巨噬细胞株RAW264.7中,套式PCR、免疫荧光检测GLS表达;转染96 h后裂解细胞作抗酸染色及菌落计数,检测GLS细胞内直接杀菌活性.数据行t或t'检验.结果成功构建携带GLS的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS;在转染的已感染H37Rv巨噬细胞株RAW264.7中,从转录和翻译水平都检测到目标基因GLS的表达产物;转染96 h,佛波酯+pBudCF4.1/GLS组、佛波酯+pBudCE4.1组与未激活初始巨噬细胞荷菌量分别为(1.44±1.25)、(3.16±0.20)和(3.59±0.21)个,两两比较,差异均有统计学意义(t=2.403,t=2.854,均P＜0.05).结论携带人GLS的真核表达质粒在巨噬细胞表达后具有明显的杀菌活性,为进一步作为结核基因治疗疫苗的应用提供了实验依据.     

人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒的构建及其在RAW264.7细胞中的表达

目的构建人天然颗粒溶素（Granulysin，GLS）和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM02并在RAW264．7细胞中进行表达。方法将人GLS和小鼠单链IL-12基因同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4．1中，得到真核共表达质粒pZM02，以pZM02转染小鼠巨噬细胞株RAW264．7，通过RT-PCR、免疫细胞化学和ELISA的方法检测目的基因的表达。结果在转染后的RAW264．7细胞中同时检测到了人GLS和小鼠IL-12的表达。结论人GLS能够与小鼠IL-12在小鼠巨噬细胞株RAW264．7中实现共表达，pZM02的成功构建为进一步研究GLS与IL-12的协同细胞免疫作用机制和免疫治疗作用奠定了基础。     

CYP3A4 is a vitamin D-24- and 25-hydroxylase: analysis of structure function by site-directed mutagenesis

Studies were performed to identify the microsomal enzyme that 24-hydroxylates vitamin D, whether 25-hydroxylation occurs, and structure function of the enzyme. Sixteen hepatic recombinant microsomal cytochrome P450 enzymes expressed in baculovirus-infected insect cells were screened for 24-hydroxylase activity. CYP3A4, a vitamin D-25-hydroxylase, and CYP1A1 had the highest 24-hydroxylase activity with 1 alpha-hydroxyvitamin D(2) (1 alpha OHD(2)) as substrate. The ratio of rates of 24-hydroxylation of 1 alpha-hydroxyvitamin D(3) (1 alpha OHD(3)), 1 alpha OHD(2), and vitamin D(2) by CYP3A4 was 3.6/2.8/1.0. Structures of 24-hydroxyvitamin D(2), 1,24(S)-dihydroxyvitamin D(2), and 1,24-dihydroxyvitamin D(3) were confirmed by HPLC and gas chromatography retention time and mass spectroscopy. In characterized human liver microsomes, 24-hydroxylation of 1 alpha OHD(2) by CYP3A4 correlated significantly with 6 beta-hydroxylation of testosterone, a marker of CYP3A4 activity. 24-Hydroxylase activity in recombinant CYP3A4 and pooled human liver microsomes showed dose-dependent inhibition by ketoconazole, troleandomycin, alpha-naphthoflavone, and isoniazid, known inhibitors of CYP3A4. Rates of 24- and 25-hydroxylation of 1 alpha OHD(2) and 1 alpha OHD(3) were determined in recombinant wild-type CYP3A4 and site-directed mutants and naturally occurring variants expressed in Escherichia coli. Substitution of residues showed the most prominent alterations of function at residues 119, 120, 301, 305, and 479. Thus, CYP3A4 is both a 24- and 25-hydroxylase for vitamin D(2), 1 alpha OHD(2), and 1 alpha OHD(3).     

9ku颗粒溶素活性肽重组减毒沙门菌的构建与表达

目的构建人9ku颗粒溶素(granulysin)的重组减毒沙门菌,并在真核细胞中表达,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础。方法以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR、双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌;重组质粒电转化减毒沙门菌后,将重组菌感染巨噬细胞,以RT-PCR检查颗粒溶素的表达。结果成功扩增出含分泌肽编码基因的9ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9ku颗粒溶素;重组减毒沙门菌感染细胞后,检测到颗粒溶素的表达。结论成功构建含9ku颗粒溶素活性肽基因的重组减毒沙门菌,该菌能成功递呈携带基因在感染细胞内表达。     

人颗粒溶素对肝癌细胞SMMC-7721凋亡、线粒体跨膜电位及细胞色素C释放的影响

目的 构建携带人颗粒溶素(GLS)的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS并研究其表达后对肝癌细胞SMMC-7721凋亡、线粒体跨膜电位与细胞色素C转位的影响. 方法 将RT PCR扩增出的人GLS编码基因克隆入pBudCE4.1载体中构建真核表达质粒pBudCE4.1/GLS并将其转染肝癌细胞株SMMC-7721,用RT-PCR、免疫细胞化学检测GLS的表达;用Hoechst法及电镜检测细胞的凋亡状况;用荧光染料MitocaptureTM检测线粒体跨膜电位,用Western blot法检测细胞色素C从线粒体的释放. 结果 成功构建了携带GLS的真核表达质粒pBudCE4.1/GLS,在转染的肝癌细胞株SMMC-7721中,从转录和翻译水半都检测到了目标基因GLS的表达产物;重组质粒转染SMMC-7721细胞后,细胞核染色质固缩,旱致密浓染的凋亡状态,线粒体膜跨电位下降并伴随有细胞色素C从线粒体至细胞质的释放. 结论携带人GLS的真核表达质粒在肝癌细胞SMMC-7721中表达后有致细胞凋亡作用,引起线粒体跨膜电位下降与细胞色素C的释放可能是其诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一.