Survivin反义RNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 为了特异封闭白血病细胞survivin的表达，抑制其功能，本实验构建了survivin反义核酸载体并导入白血病细胞系中。方法 应用RT—PCR获得survivin的cDNA片段，反向插入pcDNA3质粒载体中；经限制性酶切和测序鉴定所构建的反义核酸是否正确；采用电转染方法将重组体导入HL—60细胞中；RT—PCR技术检测转染细胞survivin表达的变化。结果 经限制性酶切和测序鉴定证明survivin反义核酸已成功构建；RT—PCR产物电泳结果显示，与转染前细胞、空质粒转染细胞相比，转染survivin反义核酸的细胞survivin mRNA水平明显降低。结论 本实验已成功建立了survivin反义核酸真核表达载体，而且在白血病细胞系中发挥了特异封闭作用，为进一步研究survivin反义核酸在白血病治疗中的作用提供了实验基础。     

CD147 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的针对CD147基因的不同部位,构建不同CD147 shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制CD147的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆.方法用DNA重组技术将针对人CD147基因的不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGE-1中,构建CD147 shRNA表达质粒载体pGE-1 CD147shRNA1、2、3.用阳离子脂质体介导转染人卵巢癌高转移细胞系HO-8910pm,经G418筛选后获得克隆进行鉴定.结果3个CD147 shRNA表达载体pGE-1CD147shRNA1、2、3经PCR、限制性酶切及部分序列分析证明基因插入正确.半定量RT-PCR、Western blotting均证实:转染细胞8910 pm/pGE-1 CD147shRNA,与亲本细胞相比,CD147的表达在mRNA和蛋白水平均明显下降.结论成功构建了CD147 shRNA表达载体pGE-1 CD147shRNA,并筛选出特异而高效地阻断CD147表达的克隆.此实验结果为进一步研究CD147蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础,并对shRNA设计靶序列的选择有一定指导意义.     

针对ATM基因RNA干扰质粒的构建及鉴定

目的：构建针对ATM基因的RNA干扰表达质粒pRiATM，并观察其抑制SPCA1人肺癌细胞ATM表达的效果。方法：构建针对ATM基因的短发夹状小干扰RNA真核表达载体pRiATM，并短暂转染SPCA1细胞，采用荧光定量RT—PCR和Westemblotting观察其抑制SPCA1细胞ATM表达的效果。结果：pRiATM1和pRiATM2转染SPCA1细胞后，与转染pRiG—FP非特异性对照组相比，ATMmRNA水平分别下降86．4％和77．6％（两组均P〈0．01）。与转染pRiGFP对照组相比，pRiATM1组和pRiATM2组ATM蛋白表达水平分别是对照组的4．3％和10，6％（均P〈0．01），以pRiATM1抑制ATM表达效果最显著。结论：pRiATM质粒构建成功，转染SPCA1细胞后可以明显抑制ATM基因的表达。     

CD147慢病毒表达载体的构建及稳定转染A549细胞系的建立

背景与目的 CD147是一类位于肿瘤细胞膜表面的跨膜糖蛋白,可促进肿瘤的浸润和转移。本研究拟构建CD147慢病毒表达载体,建立稳定过表达CD147的人肺腺癌A549细胞系,观察过表达CD147后对MMP-9及细胞增殖、侵袭能力的影响。方法 RT-PCR扩增CD147基因全长序列,将序列插入pEGFP载体,构建pEGFP-CD147慢病毒表达载体,随后转入293FT细胞中进行慢病毒包装,用获得的慢病毒毒液感染人肺腺癌细胞系A549,建立稳定过表达CD147的A549细胞系。Real-timePCR检测MMP-9的变化情况,CCK-8及Transwell法检测人肺腺癌细胞增殖、侵袭能力的变化。结果经限制性内切酶鉴定及测序分析,成功构建了pEGFP-CD147慢病毒表达载体质粒。Real-timePCR和Westernblot检测显示,与对照组相比,转染pEGFP-CD147慢病毒表达载体组的细胞,CD147的表达在mRNA和蛋白两个水平均增高,成功建立了A549-CD147细胞系。上调CD147的表达后,MMP-9的mRNA表达水平明显升高。同时,A549-CD147细胞增殖和侵袭能力明显增加(P<0.05)。结论成功构建CD147慢病毒表达载体和A549-CD147细胞系,过表达CD147可上调MMP-9的表达,增强人肺腺癌细胞的增殖和侵袭能力。     

核苷酸切除修复基因XPB反义RNA表达质粒的构建及其功能的初步研究

背景与目的：核苷酸切除修复机制是细胞修复损伤DNA的重要途径,肿瘤细胞的耐药常伴随DNA损伤修复基因表达增强,采取反义策略降低细胞的DNA损伤修复能力可以增加肿瘤细胞的药物敏感性。本研究拟构建能在哺乳动物细胞中表达XPB反义RNA的表达质粒pcDNA-XPB/AS(XPB：着色性干皮病B基因),并初步探讨其对肺癌细胞DNA损伤修复能力及抗肿瘤药物耐药性的影响。方法：采用RT-PCR技术扩增的XPB cDNA5′端一段69--520bp的序列被反向插入表达质粒pcDNA3．1／His。将该重组质粒瞬时转染肺癌A549细胞。单细胞凝胶电泳(SCGE)比较阿霉素诱导的转染前后细胞DNA损伤修复情况。MTT法检测转染前后细胞对阿霉素的敏感性。结果：酶切图谱分析和基因测序证实反义表达质粒构建成功。RT-PCR显示转染细胞XPB mRNA表达水平下降。以4．Oμg／ml阿霉素诱导细胞DNA损伤,SCGE显示转染细胞修复DNA损伤能力受到抑制。MTT显示未转染细胞与转染细胞对阿霉素的敏感性存在差别,但无统计学意义。结论：构建的反义表达质粒能下调转染细胞XPB mRNA表达,抑制细胞DNA损伤修复能力,为进一步研究XPB基因功能奠定了基础。     

CD147在胃癌组织中的表达及临床意义

目的：了解CD147在胃癌组织中的表达,探讨CD147在胃癌进展中的作用及临床意义.方法：应用免疫组化SP法检测123例胃癌组织中CD147的表达.结果：CD147在黏液腺癌、乳头状腺癌、管状腺癌、低分化腺癌和印戒细胞癌中的表达率分别为62.5%、81.48%、81.48%、86.21%和95.83%,印戒细胞癌的阳性表达率明显高于黏液腺癌,P=0.011.表达强度与临床分期、淋巴结有无转移有关,Ⅲ～Ⅳ期阳性表达率（94.44%）明显高于Ⅰ～Ⅱ期阳性表达率（51.52%）,P=0.000;淋巴结转移组阳性表达率（89.69%）与无淋巴结转移组阳性表达率（57.69%）差异有统计学意义,P=0.000;CD147高表达与患者术后生存期＜3年相关,P=0.036.结论：CD147与胃癌的侵袭、转移密切相关,CD147的检测可作为评价胃癌恶性程度和判断预后的重要指标.     

CD147在胃癌组织中的表达及临床意义

目的了解CD147在胃癌组织中的表达,探讨CD147在胃癌进展中的作用及临床意义.方法应用免疫组化SP法检测123例胃癌组织中CD147的表达.结果CD147在黏液腺癌、乳头状腺癌、管状腺癌、低分化腺癌和印戒细胞癌中的表达率分别为62.5%、81.48%、81.48%、86.21%和95.83%,印戒细胞癌的阳性表达率明显高于黏液腺癌,P=0.011.表达强度与临床分期、淋巴结有无转移有关,Ⅲ～Ⅳ期阳性表达率(94.44%)明显高于Ⅰ～Ⅱ期阳性表达率(51.52%),P=0.000;淋巴结转移组阳性表达率(89.69%)与无淋巴结转移组阳性表达率(57.69%)差异有统计学意义,P=0.000;CD147高表达与患者术后生存期＜3年相关,P=0.036.结论CD147与胃癌的侵袭、转移密切相关,CD147的检测可作为评价胃癌恶性程度和判断预后的重要指标.     

CD147在骨巨细胞瘤中的表达及临床意义

目的：研究CD147在骨巨细胞瘤组织中的表达，探讨其与临床病理及预后的关系。方法：运用免疫组织化学S—P法，检测CD147在36例骨巨细胞瘤中的表达，分析其与肿瘤临床病理资料及Jaffe分级、En-neking分期和复发的关系。结果：CD147的阳性表达率为47．2％，阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤发生部位等因素无关。在Jaffe分级中随着级别的增高，阳性表达率也升高，差异有显著性（P〈0．05）；按Enneking分期Ⅱ、Ⅲ期阳性表达率明显高于Ⅰ期，差异有显著性（P〈0．05）；复发组的CD147阳性表达率明显高于未复发组，差异明显（P〈0．05）。结论：CD147与骨巨细胞瘤的侵袭、转移密切相关，CD147可作为评价骨巨细胞瘤恶性程度和判断预后的重要指标。     

CD147在骨肉瘤中的表达及其临床意义

目的研究CD147在骨肉瘤中的表达情况,探讨其与临床病理及预后的关系。方法用S-P免疫组织化学染色法对76例骨肉瘤CD147蛋白的表达进行检测,并对其与骨肉瘤临床病理及预后的关系进行统计学分析。结果CD147在骨肉瘤中呈普遍阳性表达,对照组骨软骨瘤、骨瘤和正常骨基本不表达。CD147蛋白表达与Enneking分期和Price分级呈正相关,与软组织侵犯、WHO分型和预后相关。结论骨肉瘤CD147蛋白的表达与肿瘤恶性程度和侵袭性密切相关,对骨肉瘤诊断和预后评估具有重要价值。     

CD147在骨肉瘤中的表达及其临床意义

目的研究CD147在骨肉瘤中的表达情况,探讨其与临床病理及预后的关系。方法用S-P免疫组织化学染色法对76例骨肉瘤CD147蛋白的表达进行检测,并对其与骨肉瘤临床病理及预后的关系进行统计学分析。结果CD147在骨肉瘤中呈普遍阳性表达,对照组骨软骨瘤、骨瘤和正常骨基本不表达。CD147蛋白表达与Enneking分期和Price分级呈正相关,与软组织侵犯、WHO分型和预后相关。结论骨肉瘤CD147蛋白的表达与肿瘤恶性程度和侵袭性密切相关,对骨肉瘤诊断和预后评估具有重要价值。     

Expression of CD147 is associated with prostate cancer progression

Novel molecular markers that are associated with prostate cancer (PCa) progression will provide valuable information in the diagnosis and treatment of the disease. Extracellular matrix metalloproteinase inducer (CD147) has been demonstrated to be involved in tumor invasion, metastasis, growth and survival. In our study, we examined whether the expression of CD147 can be used as a prognostic marker for predicting PCa progression. Tissue samples from 240 patients who received radical prostatectomy for PCa were obtained. CD147 expression in these samples was evaluated using immunohistochemical staining with a monoclonal antibody specifically against CD147. Increased expression of CD147 was correlated with higher Gleason scores (GS), positive surgical margin, prostate-specific antigen (PSA) failure, metastasis and reduced overall survival. Both univariate Cox regression analysis and multivariate analysis including competing biological variables demonstrated that increased CD147 expression was associated with increased risk for reduced PSA failure-free, metastasis-free and overall survival. Kaplan-Meier survival curves showed that the CD147 overexpression was a significant predictor for the PSA failure-free, metastasis-free and the overall survival in both pT2 and pT3 PCa patients. More significantly, higher expression of CD147 can serve as an independent prognostic predictor for PSA failure-free survival in PCa patients when they are stratified by GS. Our study results demonstrate the involvement of CD147 in PCa progression and suggest its potential role as an independent predictor of biochemical recurrence, development of metastasis and reduced overall survival in PCa.     

畸胎瘤细胞源性生长因子反义核酸载体对高度恶性人卵巢癌细胞增殖和侵袭的抑制效应及相关机制

目的 观察畸胎瘤细胞源性生长因子(PCDGF)反义核酸载体对高度恶性人卵巢癌细胞株Sw626和A2780增殖和侵袭的抑制效应,并初步探讨其相关机制.方法 采用二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法和Boyden小窒体外侵袭实验,检测PCDGF反义RNA真核表达载体对Sw626和A2780细胞增殖和侵袭能力的影响.采用Western blot技术,检测转染PCDGF反义RNA真核表达载体前后Sw626细胞cyclin D1和CDK4蛋自表达的变化.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和明胶酶谱法,分析PCDGF反义RNA真核表达载体对Sw626细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达和活性的影响.结果 与空白对照组相比,PCDGF反义核酸载体转染组Sw626和A2780细胞的增殖抑制率分别为72.9%和70.9%,侵袭能力分别被抑制了62.9%和59.0%.转染组Sw626细胞cyclin D1和CDK4蛋白的表达水平分别为0.38±0.08和0.37±0.13,明显低于空白对照组(0.84±0.11和0.64±0.11,P<0.01).与空白对照组(0.89±0.09)相比,转染组Sw626细胞MMP-2 mRNA的表达水平(0.66±0.11)虽未见降低(P>0.05),但MMP-2酶原的活性被叨显抑制.结论 PCDGF反义核酸可显著抑制高度恶性人卵巢癌细胞株Sw626和A2780的增殖和侵袭能力,并逆转其部分恶性表型,这可能与其能下调cyclin D1和CDK4蛋白的表达并抑制MMP-2酶原的活性有关;PCDGF可以作为卵巢癌治疗的新靶点.     

人反义VEGF基因表达载体的构建及其对卵巢癌细胞增殖的影响

目的：构建人反义VEGF基因真核表达载体,进行抗血管生成治疗卵巢癌实验。方法：RT－PCR法获得人VEGF基因,将VEGF基因反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定结果。用此真核表达载体转染人卵巢癌细胞HO－8910,G418筛选获得阳性克隆,RNA斑点杂交鉴定HO－8910细胞中VEGF表达。Western blot及间接免疫荧光法检测转染前后HO－8910 细胞中VEGF蛋白表达。检测转染前后瘤细胞的生物学性状及裸鼠体内致瘤性。结果：RT－PCR法得到VEGF基因,并获得反向构建的VEGF真核表达载体。VEGF反义RNA部分阻断了HO－8910细胞中VEGF表达,转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;细胞周期中,G1期细胞增多,S期细胞减少,细胞增殖能力降低;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。裸鼠体内致瘤性降低。结论：成功构建了反义VEGF基因真核表达载体,该载体可明显抑制卵巢癌细胞增殖,为卵巢癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

CD59 RNAi逆转录病毒载体转染卵巢癌细胞株A2780的构建

目的获得携带针对人CD59基因p SUPER retro RNAi逆转录病毒载体的卵巢癌细胞株A2780。方法设计能转录产生靶向CD59小发夹RNA(sh RNA)转染逆转录病毒载体p SUPER retro neo+gfp质粒,构建p SUPER-si CD59重组质粒,将重组质粒导入卵巢癌细胞株A2780内。鉴定转染后细胞株能形成稳定的扩增。结果重组质粒经PCR凝胶电泳、核苷酸测序证实与设计序列一致;重组质粒转染卵巢癌细胞株A2780,可稳定表达绿色荧光蛋白。结论携带针对人CD59基因p SUPER retro RNAi逆转录病毒载体的卵巢癌细胞株A2780的建立为深入进行肿瘤细胞研究奠定了基础。     

雌激素调节人乳腺癌细胞CD147表达的研究

目的：探究雌激素对人乳腺癌细胞系中CD147表达的调节作用。方法：用雌激素处理人乳腺癌细胞系,RT-PCR及Real-time PCR定量检测用药前后细胞中CD147 mRNA表达水平变化,Western blot检测用药前后细胞中CD147蛋白表达水平变化。结果：经雌激素处理后的ER阳性人乳腺癌细胞系中CD147 mRNA及蛋白的表达均呈上升趋势,而ER阴性人乳腺癌细胞系则无明显变化。结论：雌激素通过ER激活CD147的表达,在乳腺癌的发生发展过程中发挥了重要的作用。     

VEGF-C基因RNA干扰真核表达载体的构建及其效果鉴定

目的：构建VEGF-C基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体。方法：以VEGF-C为靶基因,以pGenSil-1质粒为载体,设计构建重组体,根据GenBank数据库提供的VEGF-C基因核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计两条带发夹结构的核苷酸序列,克隆到空载体pGenSil-1中,转化DH5α菌株,提取质粒,进行限制性内切酶酶切鉴定和测序分析,将重组的pGenSil-VEGF-C质粒转染LOVO细胞48小时,检测其对LOVO细胞VEGF-C蛋白与mRNA表达的影响。结果：经酶切鉴定筛选出的重组体测序结果与目的序列完全一致,重组载体显著降低Lovo细胞VEGF-C的蛋白和mRNA表达,重组载体构建成功。结论：利用RNAi技术可成功构建抑制VEGF-C表达的小干扰RNA重组体。     

CD147和MMP-9在结直肠癌组织中的表达及临床意义

目的 探讨CD147和基质金属蛋白酶（MMP）-9在结直肠癌中的表达及临床意义。方法 采用免疫组化法检测60例结直肠癌和50例癌旁组织中CD147和MMP-9的表达,并分析两者表达与结直肠癌临床病理特征的关系。结果 结直肠癌组织中CD147及MMP-9的阳性表达率分别为86.7％和85.0％,高于癌旁组织中的20.0％和15.0％（P＜0.05）。两者表达与年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、pTNM分期、淋巴结转移、浸润深度和远处转移均无关。CD147和MMP-9在结直肠中的表达呈正相关（r=0.470,P＜0.001）。结论 MMP-9及其诱导因子CD147在结直肠癌组织中高表达,两者与结直肠癌发生、发展的关系需进一步研究。     

CD147和MMP-2在乳腺癌组织中的表达及其与预后的相关性

背景与目的已知基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)在恶性肿瘤侵袭与转移中发挥重要作用,而CD147作为MMPs的诱导因子,可促进肿瘤及间质细胞表达MMPs。本研究旨在探讨CD147和MMP-2在乳腺癌及肿瘤周围组织中的表达与乳腺癌的侵袭、转移及预后的关系。方法用免疫组化EnVision法检测112例乳腺癌及其癌旁正常组织中MMP-2和CD147的表达。结果CD147在55例肿瘤组织中有表达,阳性率为49.1%(55/112),但在癌旁正常腺体及肿瘤间质细胞中无表达。而MMP-2在60例肿瘤周围正常间质细胞中有表达,阳性率为53.6%(60/112);在33.1%(37/112)的肿瘤组织中也有表达。MMP-2的表达与肿瘤大小、淋巴结转移和临床分期呈显著性正相关(P<0.01);CD147的表达与病理分级、淋巴结转移以及雌激素受体(estrogenreceptor,ER)的表达呈显著性正相关(P<0.01)。单因素生存分析显示CD147和MMP-2阳性组的总生存率低于阴性组(P<0.05)。多元回归分析证实CD147是风险因子,其表达越高患者生存期越短。结论MMP-2及其诱导因子CD147可能参与了乳腺癌的侵袭与转移;CD147可做为独立的预后判断因子,结合病理分级和临床分期分析能提高对乳腺癌患者预后判断的准确性。