USP22基因在氟尿嘧啶对肝癌细胞毒性作用中的影响

目的:探讨USP22基因在氟尿嘧啶对肝癌细胞毒性作用中的影响。方法:用Western blotting检测肝癌细胞HepG2和BEL7402中USP22基因的表达状态,构建并对肝癌细胞转染USP22基因的siRNA(siRNAUSP22),然后以氟尿嘧啶处理24h后,MTT检测法观察在USP22基因沉默前后,氟尿嘧啶对肝癌细胞活性的影响。结果:USP22基因在肝癌细胞中显著高表达。siRNA-USP22转染后显著抑制USP22基因的表达,同时可明显增强氟尿嘧啶对HepG2和BEL7402细胞的毒性作用,降低其细胞活性[(53.2±6.8)%,P<0.05;(49.8±7.3)%,P<0.05]结论:下调USP22基因可提高肝癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性,提示USP22高表达可能是造成肝癌化疗抵抗的原因之一。     

脂氧素A4调控肝癌细胞缺氧诱导因子-1α的表达

目的:探讨在营养剥夺环境下,脂氧素A4对肝癌细胞缺氧诱导因子-1α表达的影响及机制。方法:以Hanks平衡盐缓冲液对肝癌细胞系HepG2和BEL7402细胞进行营养剥夺培养8h,并联合脂氧素A4(100nmol/L)孵育8h,应用免疫蛋白印迹检测脂氧素A4对营养剥夺条件下,肝癌细胞缺氧诱导因子-1α和细胞因子信号转导抑制蛋白表达的影响。同时构建转染针对细胞因子信号转导抑制蛋白的siRNA,观察营养剥夺条件下,细胞因子信号转导抑制蛋白沉默前后,脂氧素A4对肝癌细胞缺氧诱导因子-1α表达的影响。结果:脂氧素A4能显著诱导HepG2和BEL7402肝癌细胞表达细胞因子信号转导抑制蛋白,但明显抑制Hanks平衡盐缓冲液诱导的缺氧诱导因子-1α表达。在应用siRNA沉默细胞因子信号转导抑制蛋白表达后,脂氧素A4在营养剥夺条件下对缺氧诱导因子-1α表达的抑制作用明显减弱。结论:在营养剥夺条件下,脂氧素A4通过诱导细胞因子信号转导抑制蛋白表达抑制肝癌细胞表达缺氧诱导因子-1α。     

靶向CIP2A的shRNA对人胃癌BGC-823细胞增殖、凋亡及侵袭的影响

目的 探讨shRNA介导的蛋白磷酸酶2A的癌性抑制因子(cancerous inhibitor of protein phosphatase 2A,CIP2A)基因表达抑制对人胃癌细胞株BGC-823细胞增殖、凋亡及侵袭的影响.方法 用已构建的shRNA-CIP2A重组质粒转染BGC-823细胞,荧光显微镜下观察转染效率;采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测重组质粒对CIP2A mRNA和蛋白表达的影响;分别用WST-1法、流式细胞术和Transwell小室法测定重组质粒转染对细胞增殖、凋亡及侵袭能力的影响.结果 shRNA-CIP2A转染效率达80％.转染shRNA-CIP2A后,可明显抑制BGC 823细胞内CIP2A mRNA和蛋白的表达(均P＜0.05),与阴性对照组相比,转染shRNA-CIP2A的BGC-823细胞增殖明显受到抑制[(1.880±0.050) vs.(0.794±0.042),P＜0.05],侵袭出的细胞数量明显少于对照组[(378.0±5.6) vs.(206.0±15.6),P＜0.05],BGC-823细胞的增殖和侵袭能力明显下降,凋亡细胞比例增加[(5.33±0.51)％vs.(7.40±0.09)％,P＜0.05].结论 shRNA下调CIP2A mRNA和蛋白的表达,可有效抑制BGC-823细胞的增殖、侵袭,同时诱导细胞发生凋亡,提示CIP2A基因可能成为一个潜在的胃癌治疗靶标.     

miR-373在人肝细胞癌中的表达及其作用

目的探讨miR-373在肝细胞癌的表达及其作用。方法 qRT-PCR法检测80例肝癌及癌旁灶中miR-373的表达;qRT-PCR法检测人肝细胞癌细胞株BEL7402、HepG2、Hep3b、Huh7、SMMC7721中miR-373的表达情况,选择高表达miR-373的细胞株为后续研究对象;干扰miR-373表达后,Transwell检测细胞株体外迁移和侵袭能力;Western blot检测细胞内MMP2、MMP9蛋白的表达变化。结果人肝细胞癌细胞株BEL7402、HepG2、Hep3b、Huh7、SMMC7721中,HepG2细胞中miR-373的表达最高。用miR-373 inhibitor转染HepG2细胞后,细胞内miR-373表达水平明显下调(P<0.05)。转染miR-373 inhibitor后,细胞迁移和侵袭细胞数目均少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);转染miR-373inhibitor后,HepG2细胞内MMP2、MMP9表达下调,(P<0.05)。结论 miR-373上调MMP2、MMP9表达促进了肝细胞癌的转移,miR-373可能为... 更多     

RNA干扰FUT6对人肝癌细胞HepG2侵袭迁移的影响

目的 初步探讨α1,3岩藻糖基转移酶-Ⅵ(FUT6)基因在肝癌细胞侵袭和转移中的作用,为肝癌FUT6基因治疗的可行性提供初步依据.方法 靶向FUT6的siRNA转染肝癌细胞株HepG2后,分为3组:空白对照组、阴性对照组和实验组,分别予等体积无RNase水、scrambled-siRNA和iRNA-FUT6,通过Western blot检测FUT6蛋白的表达,Transwell小室方法进行细胞迁移和侵袭实验检测肝癌细胞株HepG2转移和侵袭能力的变化.结果 空白对照组、阴性对照组及实验组FUT6蛋白的表达分别为1.24±0.07、1.09±0.04和0.30±0.06,实验组FUT6蛋白比空白对照组降低75.8％,差异有统计学意义(P＜0.05),阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05).与空白对照组比较,实验组HepG2细胞迁移能力降低了73.3％,侵袭能力降低了73.7％.结论 通过siRNA靶向沉默HepG2细胞的FUT6蛋白表达能削弱HepG2细胞在体外的迁移和侵袭能力.     

着色性干皮病C组基因蛋白缺失对膀胱癌细胞自噬的影响

目的 探讨膀胱癌细胞中着色性干皮病C组基因(xeroderma pigmentosum group C,XPC)蛋白缺失对自噬的影响.方法 利用shRNA策略,建立稳定干扰XPC的膀胱癌T24细胞模型,蛋白印迹技术检测干扰XPC后自噬表征蛋白LC3Ⅱ的表达,瞬时转染GFP-LC3,荧光显微镜观察细胞荧光聚集情况,CCK-8法检测细胞的增殖状况,免疫印迹技术检测自噬及凋亡相关蛋白的表达.结果 成功建立干扰XPC的膀胱癌T24细胞模型;干扰XPC后,膀胱癌T24细胞自噬小体的形成[(1.53±0.81)％ vs(3.30 ±0.70)％,P＜0.05]明显减少,顺铂作用下膀胱癌T24细胞自噬小体的形成[(2.19±0.37)％ vs(3.20 ±0.29)％,P＜0.05]明显减少;顺铂促进XPC缺失后的膀胱癌T24细胞自噬;XPC缺失后的自噬为非保护性自噬.结论 XPC蛋白参与调控膀胱癌T24细胞的自噬.     

慢病毒介导靶向P27RF-Rho基因沉默对肝癌细胞侵袭性的影响

目的: 探讨慢病毒靶向介导技术沉默P27RF-Rho基因,阐述其对肝癌细胞侵袭性的影响。方法: 构建P27RF-Rho RNAi慢病毒。慢病毒感染肝癌细胞BEL7402。实验分为P27RF-Rho-siRNA实验组、Scramble-siRNA阴性对照组和BEL7402空白对照组。Western bloting法检测P27RF-Rho基因沉默效果及肝癌相关蛋白RhoA、RhoC、VEGF、P53和PTEN表达水平;明胶酶谱分析肿瘤侵袭相关基质金属蛋白酶(MMPs)活性;细胞划痕和体外Transwell小室侵袭实验比对细胞迁移和侵袭能力的改变。结果: Western blotting法检测,P27RF-Rho-siRNA实验组BEL7402中P27RF-Rho、RhoA、RhoC和VEGF蛋白表达水平明显低于2个对照组(P<0.05),P53和PTEN表达水平高于2个对照组(P<0.05)。明胶酶谱,P27RF-Rho-siRNA实验组MMPs活性明显降低(P<0.01)。划痕实验,P27RF-Rho-siRNA实验组细胞迁移距离明显低于2个对照组(P<0.01)。实验组穿过Transwell小室的平均细胞数明显少于2个对照组(P<0.01)。结论: 沉默P27RF-Rho基因可以降低肝癌细胞BEL7402的侵袭和迁移能力。     

小干扰RNA沉默组织因子基因对肝癌侵袭转移能力的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人类肝癌细胞内组织因子(TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响。方法 本实验以人类肝癌细胞系HepG2细胞株为实验对象,将携带有针对TF小干扰RNA( siRNA)序列的质粒pGPU6/GFP/Neo-TF siRNA,转染HepG2细胞株,以适当浓度的G418筛选获得阳性克隆,通过RT-PCR和蛋白质印迹法比较转染TF siRNA(+)质粒、转染TF siRNA( -)质粒以及未转染任何质粒的HepG2细胞内源性TF在基因及蛋白质表达水平的差异,进而应用Transwell体外侵袭实验检测三者的侵袭转移能力,探讨TF对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。结果 (1) RT-PCR结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF表达水平低于转染TF siRNA（-）质粒和未转染质粒的表达水平。(2)蛋白质Western印迹法结果 显示,转染TFsiRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF蛋白表达水平低于转染TF siRNA( -)质粒和未转染质粒的表达水平。(3) Transwell体外侵袭实验结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2穿膜细胞数[(14±10)个]少于转染TF siRNA（-）质粒的HepG2穿膜细胞数[(128±18)个],经t检验比较,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示应用RNA干扰技术抑制肿瘤细胞TF表达可以使HepG2细胞侵袭转移能力显著下降。结论 TF与肝癌细胞的侵袭转移能力密切相关,应用RNA干扰技术抑制其表达可以明显降低细胞HepG2体外侵袭转移能力。     

姜黄素对肝癌细胞miR-29及VEGF表达的干预作用

目的观察姜黄素对肝癌细胞miRNA-29(miR-29)及血管内皮生长因子(VEGF)表达的干预作用。方法收集2008年12月1日—2018年12月1日杭州市肿瘤医院临床资料较完整的手术切除肝癌标本41份,含癌组织和癌旁非癌组织,采用免疫组化研究VEGF表达情况以及与肝癌分型的相关性;转染VEGF siRNA后,MTT检测其对细胞增殖的调控作用,Western blot检测其对凋亡蛋白Bcl2、Bax表达的影响;PCR检测肝癌细胞miR-29表达,转染miR-20mimics后,qRT-PCT和Western blot检测对VEGF表达的影响;MTT检测姜黄素对Hep G2细胞抑制效应的IC50,qRT-PCT和Western blot检测姜黄素对mi R-29-VEGF调控作用。结果肝癌组织VEGF表达阳性率70.73%(29/41)显著高于癌旁肝组织30.00%(3/10)和正常肝组织(0.00%)(P均0.01);肝癌组织VEGF表达水平与肿瘤的病理分级、侵袭转移性有关,病理分级Ⅲ～Ⅳ级明显高于Ⅰ～Ⅱ级(P0.05),高侵袭转移(15/24)明显高于低侵袭转移(7/17)(P0.05);qRT-PCR结果显示,与转染前比较,转染VEGF si RNA 48h后,细胞增殖下降[(2.31±0.39)%比(4.21±0.52)%,P0.05];与阴性对照组比较,抑制VEGF表达后,HepG2细胞迁移能力明显降低;与正常人肝细胞比较,HepG2细胞miR-29表达量显著降低[(2.11±0.92)比(7.32±2.11),P0.05];转染miR-29 mimics促进miR-29表达后,VEGF mRNA表达水平下降[(3.01±1.00)比(11.33±2.02),P0.05];姜黄素对Hep G2细胞抑制率在72h最好(IC50=49.50μmol/L);肝癌HepG2细胞与姜黄素59.68μmol/L共同培养72h后,miR-29表达显著升高[(9.04±2.19)比(2.18±1.00),P0.05],VEGF mRNA表达降低[(2.98±1.00)比(8.32±1.80),P0.05]。结论姜黄素可能通过促进肝癌细胞miR-29表达,抑制VEGF表达,调控肝癌细胞生物学过程。     

长链非编码RNA HOXC13-AS在肝细胞癌中的表达及对细胞增殖、侵袭的影响

目的观察长链非编码RNA HOXC13反义RNA(RNA HOXC13-AS)在肝细胞癌中的表达,探讨其对肝癌细胞增殖和侵袭的影响。方法实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测肝癌细胞株及正常肝细胞株中HOXC13-AS相对表达水平。体外培养HepG2细胞,设置空白对照组(不转染)、LV-NC组(转染携带HOXC13-AS-NC慢病毒)、LV-HOXC13-AS-shRNA组(转染携带HOXC13-AS-shRNA慢病毒),CCK-8法检测各组细胞增殖情况,Transwell法及细胞划痕实验检测各组肝癌细胞侵袭及迁移能力,蛋白免疫印记(WB)法检测增殖与侵袭相关蛋白表达水平。结果与人正常肝细胞株L02(0.22±0.03)比较,肝癌细胞株HepG2(1.02±0.04)、SMMC-7721(0.71±0.03)、HUH7(0.59±0.03)、SNU-182(0.41±0.03)中HOXC13-AS的表达水平显著升高,差异均有统计学意义(均P0.05),以肝癌细胞HepG2中HOXC13-AS相对表达水平最高。与空白对照组、LV-NC组比较,LV-HOXC13-AS-shRNA组中HepG2细胞增殖、迁移与侵袭能力及基质金属蛋白酶-2、Ki-67、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)相对表达水平明显降低,而组织金属蛋白酶抑制剂-2蛋白相对表达水平明显升高,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论 HOXC13-AS在肝癌细胞中高表达,HOXC13-AS低表达可抑制HepG2细胞的增殖、侵袭。