SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究

目的：获得纯的重组SARSCoV M蛋白，并初步测定重组蛋白的抗原性。方法：软件分析SARSCoV M蛋白富含免疫表位的片断，体外合成编码SARSCoV M蛋白15．170aa序列的DNA片段，利用DNA重组技术，将该合成DNA克隆至表达载体pGEX-5X-1，构建重组质粒pGEX．SARSCoV M。在大肠杆菌BL2l中诱导表达GST-SARSCoV M重组融合蛋白，分离纯化GST-SARSCoV M蛋白，利用纯化蛋白作为抗原，建立ELISA试验检测抗SARSCoV M抗体。结果：GST-SARSCoV M蛋白分子量为43kD，纯化的GST-SARSCoV M蛋白作为抗原检测血清中SARSCoV M抗体，53例正常成人献血者血清未检出SARSCoV M抗体。结论：SARSCoV M蛋白表达成功，在健康人血清中未检出SARSCoV M抗体。     

SARS冠状病毒基因组及其编码蛋白生物信息学分析

目的：理论分析严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒基因组及其编码蛋白的分子生物学特征，为进一步研究SARS冠状病毒蛋白质功能提供信息资料。方法：利用生物信息学序列对比分析软件、蛋白氨基酸序列分析软件及蛋白质结构预测软件对GenBank公布的SARS冠状病毒基因序列及其编码的蛋白氨基酸序列进行分析。结果：SARS冠状病毒在基因结构上具有冠状病毒属的特征，而又与其他已知的冠状病毒编码序列存在明显的不同，与其他冠状病毒相比没有明显的基因重组、大片段插入或缺失的现象。来源于不同SARS冠状病毒株的基因序列变异速度较快。出现基因序列在不同区段同源性差异的现象。S蛋白氨基酸序列不存在与其他物种相同的连续性抗原决定簇序列。结论：SARS冠状病毒与其他冠状病毒的变异程度基本相同。SARS冠状病毒可能是自然界已经存在或变异产生的新的病毒株。近期世界范围流行的SARS是同一来源的病原体引起的，认为S蛋白氨基酸序列是SARS冠状病毒的主要抗原。     

丙型肝炎病毒E2及preS融合蛋白在哺乳动物细胞中的表达

丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）Ｃ基因与ｐｒｅＳ２基因嵌合，嵌合基因免疫小鼠能产生抗ＨＣＶＣ蛋白的抗体，而单独接种ＨＣＶＣ基因则不能诱导小鼠产生抗Ｃ蛋白的抗体［１］。为研究ｐｒｅＳ能否增加ＨＣＶＥ２蛋白的免疫原性提供物质基础，我们在哺乳动物细胞稳定表达了Ｅ２?..     

SARS相关冠状病毒S1融合蛋白的原核表达与纯化

目的：克隆严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV)S1蛋白编码DNA，构建原核表达质粒pGEX-5T／S1，并诱导表达谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白。方法：采用PCR方法扩增合成S1片段，并克隆入载体中，经双酶切鉴定和测序后把S1序列定向插入原核表达载体pGEX-5T的多克隆位点，转化大肠杆菌K802，将纯化后的融合蛋白用于SARS—CoV抗体阳性血清的检测。结果：GST—S1融合蛋白以可溶形式表达，纯化后的蛋白用ELISA法检测，结果与对照相符。结论：成功诱导原核表达并纬化出融合蛋白S1，为将其应用于SARS—CoV的特异性检测和亚单位疫苗研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备

目的: 表达SARS冠状病毒S蛋白片段,并制备特异性单克隆抗体(mAb).方法: 原核表达SARS冠状病毒S蛋白片段,从SARS病毒cDNA中扩增S蛋白(N端205至419aa)基因片段,测序结果正确.将该基因片段插入pQE-30中,构建重组质粒pQE-30-S1m,以重组质粒转化E.coli M15诱导表达His-S1m蛋白.纯化后免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选制备特异性mAb.结果: 表达并纯化了重组蛋白His-S1m,获得1株抗His-S蛋白的mAb1H2.Ig亚类鉴定为IgG1a,轻链为κ型.经Western blotting检测,mAb1H2与S蛋白发生特异性反应,而与His蛋白无交叉反应.结论: 成功表达了重组S蛋白并制备了特异性mAb,为SARS-CoV的早期诊断及进一步研究S蛋白的功能奠定了基础.     

间隙连接蛋白connexin43基因在真核细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43 cDNA的真核表达载体,建立connexin43蛋白高表达细胞株。方法：connexin43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pEN4,转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,用甲氨喋呤（MTX）筛选得到connexin43基因高表达细胞。结果：酶切电泳结果显示载体pED4-Cx43按设计构建。经MTX筛选得到不同抗性的CHO细胞,免疫组织化学方法显示有connexin43蛋白的表达,但表达量有限。细胞间染料传递实验证实不同MTX抗性的CHO细胞间传递小相对分子质量物质的能力有差异。结论：利用载体pED4可以使connexin43基因在真核细胞内表达。     

SARS相关病毒基因组序列的研究

严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)是由SARS相关病毒(SARS—CoV)引起的一种新的烈性呼吸道传染病。SARS—CoV是一种新的冠状病毒，基因组结构符合典型的冠状病毒特征，编码基因从5′端起分别为：RNA依赖的RNA聚合酶、突起蛋白、包膜蛋白、膜蛋白，3′端为核衣壳蛋白。对14株SARS—CoV的4个变异点分析，可将14株病毒分成两个基因型，即第9404、19084、22222、27827位的T：T：T：T／C：G：C：C两型。对SARS—CoV的基因组的全面了解不仅为疾病的发病机理研究提供主要线索，而且将为SARS的诊断、预防和治疗提供帮助。     

SARS冠状病毒S蛋白抗原表位串联基因的设计和表达

目的:表达严重急性呼吸综合征(SARS)冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,为研制新型的SARS病毒疫苗提供新思路。方法:应用生物信息学分析软件分析SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列,设计全新的抗原表位编码基因序列,构建表达载体并在大肠杆菌中表达该基因。结果:设计并合成了SARS冠状病毒S蛋白的抗原表位序列的新基因序列,在大肠杆菌中实现了该基因的高表达。结论:可以重新设计新基因产生新型候选重组疫苗。     

社区老年与青年人SARS认知状况与应对行为的对比分析

严重急性呼吸道综合征(SARS)是一种由冠状病毒引起的、主要以近距离空气飞沫和密切接触传播的呼吸道传染病.     

社区老年与青年人SARS认知状况与应对行为的对比分析

严重急性呼吸道综合征 (SARS)是一种由冠状病毒引起的、主要以近距离空气飞沫和密切接触传播的呼吸道传染病。自 2 0 0 2年 11月份广东省发生第 1例SARS以后 ,到 2 0 0 3年 4月 ,中国和其他国家发生了局部流行[1,2 ] 。作为一场突如其来的灾难 ,SARS同时给人们带来了精神压力 ,并产生了紧张和焦虑情绪。为了解社区老年人对SARS的认知和应对行为特征 ,探讨预防干预措施 ,自 2 0 0 3年 5月 1～ 9日对济宁市部分社区居民开展SARS的认知和应对行为调查。对象与方法一、调查对象 :济宁市市中区古槐办事处 3个社区重点人群 ,老年人 (>60岁…     

严重急性呼吸综合征冠状病毒在肺组织内各种类型细胞中的表达

目的:了解肺组织内被严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome -associated coronavirus, SARS-CoV)感染的靶细胞类型, 并对SARS诱发的肺损伤发病机制进行探讨.方法: 运用SARS-CoV基因组序列合成的地高辛标记cDNA探针,对北京市7例及安徽省1例确诊的SARS死亡病例的肺组织进行原位杂交检测,在原位杂交基础上,进一步运用免疫组织化学方法显示SARS-CoV感染的靶细胞类型,如Cytokeratin(CK)标记上皮细胞,CD34标记血管内皮细胞,CD68标记巨噬细胞,Vimentin标记纤维母细胞, CD3标记全T细胞. 结果:原位杂交检测显示,8例患者肺组织中都表达SARS-CoV RNA,阳性信号位于靶细胞胞浆内,呈紫蓝色(NBT-BCIP).原位杂交和免疫组化结果显示:支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、纤维母细胞及T淋巴细胞在所有SARS病例中都受到了病毒感染.原位杂交阳性(紫蓝色,NBT-BCIP)和免疫组化阳性(红棕色,AEC)信号同时表达于靶细胞胞浆中而呈紫红色.结论:通过对SARS患者肺组织原位杂交和免疫组织化学双重标记研究表明,肺组织内支气管上皮细胞、Ⅱ型肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞及纤维母细胞等多种细胞成分广泛受到了SARS-CoV攻击,肺组织内多种细胞成分弥漫性受损以及所释放的炎性介质在肺损伤的发病过程中起着重要作用.     

重组人白细胞介素21真核表达载体的构建及体外药效学研究

目的构建人的真核表达载体pVAX/IL-21,并进行体外细胞转染实验的鉴定研究。方法采用PCR扩增技术扩增含有白细胞介素21（interleukin21,IL-21）的基因,亚克隆于真核表达载体pVAX1,并进行酶切和测序分析;将所构建的质粒转染COS-7细胞检测其表达情况。结果酶谱和测序分析表明,构建的质粒pVAX/IL-21（pIL-21）基因片段的方向、序列完全正确;ELISA法定量检测双质粒转染COS-7细胞后24h、48h、72h、96h均检测到目的基因的蛋白表达,其中转染48h的表达水平较高,达到45ng/ml。结论成功构建了人IL-21的整合表达质粒pIL-21,并具有较强的体外细胞转染活性,为进一步研究IL-21的生物学功能如抗肿瘤活性等提供了实验基础。     

广州地区严重急性呼吸综合征170例临床特点分析

目的探讨当前流行的严重急性呼吸综合征(SARS)的流行病学临床表现、血常规及X线表现等特点.方法回顾性分析该院于2003年2～4月收治的170例SARS的临床资料.结果170例SARS患者的年龄2～89岁,平均(41.2±18.1)岁.男72例,女98例.该病的潜伏期为2～14 d,平均(7.1±3.9)d.主要临床表现有发热(100%)、咳嗽(55.3%)、乏力(21.8%)、气促(能.2%)、腹泻(7.1%)、头痛(24.7%)、肌肉酸痛(33.5%);热程多为3～23d,平均热程(9.4±3.7)d;外周血白细胞正常(71.8%),降低(22.4%),淋巴细胞计数减少者占(24.7%),嗜酸性粒细胞(EOS)降低(83.8%);全部患者均有胸片影像学改变.治疗以综合治疗为主,对症支持治疗,经验性使用抗生素、糖皮质激素对改善中毒症状、阻止病情有一定疗效.结论SARS有强传染性,发热、咳嗽、胸片示肺部炎症表现,外周血白细胞正常式降低,淋巴细胞降低,嗜酸粒细胞降低为主要表现.     

重症SARS的X线影像表现

目的探讨重症严重急性呼吸综合征(SARS)的X线表现.方法回顾性分析37例重症SARS患者的一系列X线胸片变化规律.结果重症SARS患者胸片表现为两肺阴影迅速进展,大部分区域受累.有3种表现类型:①19例表现为弥漫大片云雾状影,病灶无明显分界,肺纹理显示不清;②13例表现为弥漫棉团状密影,边缘模糊,肺纹理增粗;③5例表现为多发大团块密影,边缘模糊,可见支气管气相.如无合并症发生,对症治疗有效,1个月左右肺部阴影消失.6例肺部合并G-杆菌感染,5例合并纵隔气肿,出现合并症时,肺部阴影延迟吸收.结论重症SARS患者的X线影像为肺部密影快速进展至两肺大部分区域,易合并纵隔气肿及肺部感染.     

传染性非典型肺炎的临床与X线表现

目的分析传染性非典型肺炎临床特征与肺部病灶X线演变.方法将非典型肺炎患者病程分4期,早期、进展期、高峰期和缓解期,观察103例患者的临床表现与不同时期内肺部病灶的分布、范围、X线形态特征及进展状况.结果入院腋下体温36.0～39.5℃,平均(37.6±0.8)℃.在非典型肺炎早期,病灶位于下肺所占比例明显多于其他肺叶(P＜0.05),进展期和高峰期病灶大多数累及两个以上肺叶(P＜0.05);非典型肺炎早期病灶形态以斑片状分布为主(P＜0.05),部分呈网格样,进展期病灶大多数云雾状、毛玻璃样变为主(P＜0.05);高峰期以毛玻璃样变为主;吸收期以云雾状、斑片为主(P＜0.05),少部分残留有纤维条索阴影.结论胸部X线可动态观察患者不同时期内肺部病灶的分布、范围、进展状况,对临床治疗有很大指导意义.     

骨形态发生蛋白3基因转染成纤维细胞诱导成骨的实验研究

目的 通过基因转染方法，使成纤维细胞NIH－3T3细胞具有合成及分泌骨形态发生蛋白（BMP）、体内诱导新骨生成的能力。方法 定向克隆法将BMP3基因构建于PcDNA3表达载体，脂质体介导法转染NIH－3T3细胞，G418筛选获得稳定转化体，Northern印迹法检测转染细胞有无BMP3基因表达，免疫组织化学检测转染细胞内的BMP3蛋白合成，钙钴法染色不同时相的转染细胞碱性磷酸酶并作图像分析。将转染细胞注入裸鼠肌袋，观察注射后第4周诱导新骨生成情况。结果 转染细胞体外培养6周Northern印迹法检测到有明显的BMP3基因表达，免疫组织化学染色见转染细胞培养筛选5－8周后细胞浆内有染成黄色的BMP3蛋白质颗粒出现，图像分析蛋白质生成在转染后第6周达高峰。钙钴法碱性磷酸酶染色及图像分析示转染细胞内碱性磷酸酶明显高于同期对照组，两组间有显著性差异（P＜0．01）。被转染NIH－3T3细胞裸鼠肌袋诱导成骨实验见注射后4周注射部位有大量软骨细胞出现，并伴有骨小梁生成。结论 通过基因转染方法可以使NIH－3T3细胞具有合成及分泌内源性BMP的能力，合成及分泌的BMP具有良好的生物活性，肌袋实验具有诱导成骨作用。但是，由于基因治疗的某些不可控性因素，其安全性仍有待于进一步研究。     

丙型肝炎病毒核心区截短型基因真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的：建立截短的丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白的真核表达载体，并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中瞬时表达：方法：应用多聚酶链反应（PCR），以HCV-H株全长cDNA序列为模板，扩增获得C区羧基端部分缺失的基因片段，克隆人真核表达载体pcDNA3．1（-），并通过脂质体转染至CHO细胞。结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1-Ct，成功转染CHO细胞，间接免疫荧光和RT-PCR证实pcDNA3．1-Ct在CHO细胞中表达截短型的C蛋白。结论：成功构建羧基端部分缺失的HCVC区基因的真核表达载体，瞬时转染CHO细胞，为进一步基因免疫和构建多表位卡介苗（BCG）活载体疫苗奠定基础。     

严重急性呼吸综合征患者康复期肺功能评价

目的研究严重急性呼吸综合征(SARS)患者康复期的肺功能动态变化状态。方法对68例康复期SARS患者在出院1、2、3及6个月进行随访,了解其症状、体征和基础疾病,测定肺功能、T淋巴细胞亚群、SARS病毒抗体IgG、血气分析,作胸部高分辨CT。对肺功能各项指标与其他指标作相关性分析。结果所有患者的SARS病毒抗体IgG为阳性。出院1个月时44例有肺功能异常(674%),43例为轻、中度异常(632%),41例有弥散障碍(603%),其中单纯弥散障碍31例(456%),6个月后仍有16例(235%)存在弥散障碍。出院3个月的TLCO较出院1个月明显好转(P<005),出院3个月与6个月的TLCO差异无显著性(P>005)。出院1个月的患者中有35例(515%)胸部CT表现异常,出院3个月的CT变化较出院1个月明显好转(P<005),出院3个月与6个月时的CT变化无显著性差异(P>005)。多元逐步回归分析显示,TLCO与CT异常改变有明显相关性。结论SARS患者康复早期存在不同程度的肺功能损害,但多数为轻、中度异常,肺功能损害以弥散下降为主。出院3个月肺功能明显好转,出院6个月与出院3个月比较肺功能改善无明显差异。     

83例SARS病人并发其他脏器损害的临床特点

目的　探讨重症急性呼吸综合征 (SARS)并发其他脏器损害的临床特点 ,并分析可能引起的原因。方法　收集 2 0 0 3年 3月 11日～2 0 0 3年 5月 15日在北京佑安医院收治的SARS病人 83例 ,观察流行病学史、临床表现、进行肝功能、肾功能、心肌酶、血糖等的检测。结果　在肝损害方面 ,第 1周有 18 9%的病人ALT (谷丙转氨酶 )升高 ,14 9%的病人AST (谷草转氨酶 )升高 ,有少部分病人出现黄疸 ;在第 2周、第 3周SARS病人的肝损害明显上升 ,其中以ALT单项增高为主 (分别为 5 0 7%和 6 7 2 % )。同时有近 5 0 0 %的病人出现白蛋白降低 ,第 1周有显著差异。至第4周及第 5周开始逐渐恢复正常 ,但有个别SARS病人恢复后 ,肝功能仍不正常 ,在心肌损害方面 ,主要以心肌酶升高为主 ,以第 1周及恢复期 (第 4周及第 5周 )升高明显 ,而在急性期升高不明显 (P <0 0 5 )。肾损害方面只出现在第1周 ,以尿素氮 (BUN)升高为主。在胰腺损害方面 ,表现为血糖升高 ,而无明显的症状。结论　SARS病毒不仅引起肺脏的损伤 ,而且还可以造成多器官的损伤