RSK2沉默对肝癌细胞化疗药物敏感性的影响

目的:探讨RSK2在肝细胞癌(HCC)中的表达与化疗药物耐药的关系。方法:将HepG2细胞分为RSK2干扰组(PGCsi3.0-RSK2 siRNA转染细胞),5-FU处理组(10μg/mL 5-FU处理细胞24 h),5-FU处理+RSK2干扰组及空白对照组,采用MTT方法检测各组细胞增殖情况;用Western blot方法检测5-FU处理组和5-FU处理+RSK2干扰组细胞RSK2,c-Jun,Bcl-2,LKB1蛋白表达。结果:与空白对照组比较,沉默RSK2蛋白与5-FU干预均可明显抑制HepG2细胞增殖(均P<0.05),且其联合作用大于两者单独的作用(均P<0.05);与RSK2干扰组比较,5-FU处理+RSK2干扰组细胞RSK2,c-Jun,Bcl-2表达上调,LKB1表达下调(均P<0.05)。结论:抑制RSK2表达可以增强肝癌细胞对化疗药物5-FU的敏感性,机制作用可能与其调节c-Jun,Bcl-2,LKB1蛋白的表达有关。     

小干扰RNA沉默多药耐药相关蛋白基因2对人肝癌细胞HepG2多药耐药的逆转作用

目的 检测小干扰RNA(siRNA)对肝癌耐药细胞株HepG2/阿霉素(ADM)多药耐药相关蛋白基因2(MRP2)及其蛋白产物的抑制作用,观察对多药耐药性的影响.方法 使用浓度梯度法制作HepG2耐ADM细胞株(HepG2/ADM),ADM浓度从0.1～2.0 m/L:设计合成针对MRP2的siRNA小片段,转染HepG2/ADM耐药细胞,24 h后通过实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blot检测siRNA对MRP2基因mRNA和蛋白的抑制效果;噻唑蓝(MTT)比色法观察抑制MRP2基因表达后,HepG2/ADM细胞对化疗药物的敏感性变化,并计算各药物的半数抑制浓度(IC50).结果 HepG2/ADM对ADM、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、长春新碱和奥沙利铂的IC50值分别为0.3204、3.8002、0.2014和0.1221;siRNA明显抑制了HepG2/ADM细胞MRP2基因mRNA和蛋白的表达(P＜0.05);转染MRP2-siRNA后,HepG2/ADM细胞对ADM、5-Fu、长春新碱和奥沙利铂的IC50值明显减小,分别为0.1023、1.4417、0.0452和0.0268.结论 用siRNA沉默MRP2基因能够逆转HepG2/ADM细胞对化疗药物的耐药性,MRP2基因与HepG2/ADM肝癌细胞的多药耐药性相关,可通过沉默MRP2基因提高耐药细胞对化疗药物的敏感性.     

复方丹参注射液对体外循环后大鼠肺组织Bcl-2和Bax表达的影响

目的探讨复方丹参注射液对体外循环（CPB）后大鼠肺组织凋亡调控基因Bcl-2和Bax表达的影响。方法成年健康雄性SD大鼠24只,年龄12～16周龄,体重400～450 g,随机分为3组（n=8）：对照组、CPB组和丹参组。对照组行假手术,CPB组和丹参组建立体外循环,丹参组在停机前5 min经储血器加入复方丹参注射液1 ml/kg。CPB结束后60 min取肺组织提取总RNA,用RT-PCR方法测定凋亡调控基因Bcl-2、Bax的mRNA表达。取肺组织用多聚甲醛固定,制作石蜡切片,用免疫组织化学方法测定肺组织中Bcl-2、Bax的蛋白表达。结果与对照组相比,CPB组和丹参组肺组织Bcl-2和Bax的mRNA和蛋白表达均增加（P＜0．05或0．01）,CPB组Bax/Bcl-2比值升高（P＜0．05）。与CPB组相比,丹参组肺组织Bax的mRNA表达及Bax/Bcl-2比值均降低（P＜0．05）,肺组织Bcl-2蛋白表达增高,Bax蛋白表达降低（P＜0．01）。结论体外循环可上调凋亡调控基因的表达,复方丹参注射液能下调促凋亡基因Bax的表达,抑制大鼠肺组织的细胞凋亡因而可减轻肺损伤。     

miR-26b对肝癌HepG2奥沙利铂耐药细胞的增敏作用研究

目的:构建肝癌HepG2奥沙利铂耐药细胞,观察miR-26b在其耐药机制中的作用。方法:使用浓度梯度法构建肝癌奥沙利铂耐药细胞株(HepG2/L-OHP)。miR-26b mimic转染HepG2/L-OHP细胞,CCK-8法检测细胞增殖,Real-time PCR定量检测miR-26b表达,Western blot检测蛋白表达。结果:HepG2细胞miR-26b的2-△△Ct值为0.206±0.024,显著高于HepG2/L-OHP细胞的0.152±0.017(P0.01)。奥沙利铂对HepG2、HepG2/L-OHP和转染miR-26b mimic的HepG2/L-OHP细胞的IC_(50)值分别为22.15±3.26、48.56±6.47和36.73±5.18μmol/L,各组间差异有统计学意义(P0.01)。HepG2、HepG2/L-OHP和转染miR-26b mimic的HepG2/L-OHP细胞的LC3-Ⅱ/Ⅰ比值为2.27±0.24、9.45±1.54和6.32±1.13,各组间差异有统计学意义(P0.01)。结论:miR-26b可以抑制肝癌奥沙利铂耐药细胞自噬激活,逆转肝癌细胞对奥沙利铂耐药。     

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子抑制氟尿嘧啶诱导的胃癌细胞凋亡增强耐药性的实验研究

目的通过检测粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）对氟尿嘧啶（5-FU）诱导后胃癌细胞凋亡的影响,初步探讨GM-CSF参与胃癌细胞耐药性的相关机制。 方法体外培养胃癌SGC7901细胞,MTT法检测5-FU作用于胃癌细胞的半致死剂量;将GM-CSF添加到5-FU处理的胃癌细胞中,MTT法和平板克隆实验检测其对细胞活性和克隆增殖的影响,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡情况。Western blotting检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达差异。 结果5-FU对胃癌细胞的半致死剂量为（16±0.4）mg/L。5-FU对胃癌细胞的活性和增殖能力有明显的抑制作用,GM-CSF能有效减弱5-FU的抑制效果（P<0.05）。5-FU能显著诱导胃癌细胞凋亡,Bax/Bcl-2比值显著升高,而加入GM-CSF后,5-FU诱导的凋亡被抵抗,Bax/Bcl-2比值升高趋势被抑制（P<0.05）。 结论GM-CSF能够促进胃癌细胞增殖并有效抑制5-FU诱导的胃癌细胞凋亡,在增强胃癌细胞化疗耐药性方面具有重要作用。     

刺参黏多糖诱导人肝癌细胞凋亡的实验研究

目的 观察刺参酸性黏多糖(SJAMP)体外诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的情况,并初步探讨SJAMP对HepG2细胞中Bcl-2和nm23-H1表达有何作用,为其能否应用于肝癌的临床治疗提供理论依据和可行性评估.方法 体外培养人肝癌细胞HepG2,用不同浓度的刺参黏多糖(0.25、0.5、1.0、2.0、4.0g/L)培养人肝癌细胞HepG2.采用细胞毒试验(MTT法)检测HepG2细胞抑制率,蛋白印迹法(western blot)检测相关蛋白Bcl-2和nm23-H1 的变化. 结果 (1)MTT细胞毒试验证实SJAMP能明显抑制人肝癌细胞HepG2细胞的生长,且呈时间和浓度依赖性.(2)western blot试验中,与空白组相比,SJAMP处理组、对照组(5-FU)及共同作用组HepG2细胞中Bcl-2蛋白表达均明显降低(P<0.05),nm23-H1蛋白的表达则明显升高(P<0.05). 结论 (1)SJAMP可通过抑制细胞增生并诱导凋亡来抑制人肝癌细胞HepG2的生长;(2)SJAMP可诱导人HepG2细胞中Bcl-2和nm23-H1蛋白含量的改变来发挥其抗肿瘤作用.     

缬沙坦联合CXCL16对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的机制研究

目的:探讨缬沙坦(Valsartan, Val)联合CXCL16对高糖诱导的小鼠足细胞损伤的机制研究。方法:将MPC-5细胞分为正常对照组(NG)、高糖组(HG)、高糖+缬沙坦低、中、高剂量组(HG+Val-L、HG+Val-M、HG+Val-H)、高糖+缬沙坦+pcDNA组、高糖+缬沙坦+CXCL16组(HG+Val+pcDNA、HG+Val+CXCL16)。通过CCK8检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot检测Bcl-2、Bax、活化的Cleaved cas9和CXCL16蛋白表达;ELISA检测ROS、MDA、GSH-Px、SOD的表达。结果:HG组能够抑制细胞的活力、GSH-Px、SOD表达,促进细胞凋亡、ROS、MDA表达,上调Bax、Cleaved cas9、CXCL16蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达;HG+Val-L组、HG+Val-M组、HG+Val-H组可以促进细胞的活力、GSH-Px、SOD表达,抑制细胞凋亡、ROS、MDA表达,下调Bax、Cleaved cas9、CXCL16蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达。过表达CXCL16可以部分回...     

小干扰RNA逆转Wnt/β-catenin通路对肝癌耐药细胞株HepG2/ADM的影响研究

目的 了解沉默β-catenin基因对肝癌耐药细胞HepG2的影响。方法 实验分为5组：正常肝细胞（LO2）组、HepG2组、HepG2/ADM组、SiNC-HepG2/ADM阴性转染组和Siβ-catenin-HepG2/ADM转染组；细胞免疫荧光技术检测各组β-catenin的表达情况；设计并筛选出抑制效率最高的Siβ-catenin；Western-blot及RT-PCR技术检测各组β-catenin、P-gp、MRP1的mRNA和蛋白的表达水平；MTT法观察各组对阿霉素（ADM）、氟尿嘧啶（5-FU）、环磷腺苷（VCR）和奥沙利铂（OHP）的敏感性；流式细胞仪检测各组细胞凋亡。结果 50 mol/L的ctnnb1-001在HepG2/ADM中抑制效率最高：78.86%（P<0.05），选其为Si-β-catenin；细胞免疫荧光显示HepG2/ADM中β-catenin荧光最强，转染Si-β-catenin后荧光显著减弱；β-catenin、P-gp和MRP1 mRNA和蛋白在HepG2/ADM组表达较高，mRNA表达分别为：0.92±0.03、7.98±0.43和4.56±0.12（P<0.05），蛋白表达分别为：1.128±0.214、1.678±0.344和1.405±0.212（P<0.05）；转染Siβ-catenin至HepG2/ADM中，β-catenin、P-gp和MRP1在mRNA及蛋白水平均不同程度表达减少，mRNA表达分别为：0.47±0.03、0.66±0.054和0.74±0.03（P<0.05），蛋白表达分别为：0.787±0.032、0.797±0.055和1.390±0.050（P<0.05）；Siβ-catenin-HepG2/ADM转染组较HepG2/ADM组对ADM、5-FU、VCR和OHP的耐药系数（RI）分别为0.61、0.55、0.30、0.55，对化疗药物敏感性显著增强（P<0.05）；Siβ-catenin-HepG2/ADM转染组凋亡率（28.05±0.35）%，较其他组明显增加（P<0.05）。结论 Wnt/β-catenin通路在HepG2中异常激活，其中β-catenin可能正性调控肝癌耐药基因P-gp和MRP1，Si-β-catenin能一定程度阻断Wnt通路，并能一定程度逆转肝癌细胞株HepG2的耐药性和增强化疗敏感性，增加凋亡。     

化疗药物对胃癌CD133+细胞亚群的作用及其对相关凋亡基因表达的影响

目的 研究常规化疗药物对纯化的胃癌CD133+细胞亚群的作用及对相关凋亡基因Bcl-2和BAX的mRNA表达的影响,进而探讨胃癌耐药的作用机制.方法 采用免疫磁珠分选术分离纯化KATO-Ⅲ细胞株中CD133+和CD133细胞亚群.采用CCK-8法分析两种亚群细胞对不同化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂及依托泊苷(VP-16)敏感性的差别.行半定量聚合酶链反应分析化疗药物诱导后相关凋亡基因表达产物的表达差异.结果 KATO-Ⅲ细胞磁珠分选纯化后,经流式细胞仪分析结果显示:分选后CDI33+组所得细胞CD133+表达率为90％.5-FU、顺铂及VP-16分别作用12h后,CD133+组及CD133-组均开始出现凋亡的形态学改变.CCK-8检测发现CD133+组细胞生长抑制比率较CD133-组有一定程度的下降[5-FU组为:(30.56±1.99)％ ～ (88.60±1.95)％ vs(32.81±2.67)％ ～ (35.55±3.23)％,P =0.045;顺铂组为:(45.89±3.64)％ ～ (81.20±1.18)％ vs(50.21 ±3.22)％ ～(90.46±1.89)％,P=0.043; VP-16组为:(37.21±3.80)％ ～ (78.49±3.22)％ vs (35.55±3.23)％ ～ (89.32±3.54)％,P=0.048].3种化疗药物干预后,两组亚群细胞中均呈现凋亡抑制因子Bcl-2 mRNA表达降低,凋亡因子BAXmRNA表达升高.这些变化在CD133+组中较CD133组中更为明显.结论 胃癌CD133+细胞亚群对5-FU、顺铂及VP-16具有一定耐药潜能.可能是由于BAX基因上调及Bcl-2基因下调进而诱导胃癌CD133+细胞亚群凋亡,并由此而获得对肿瘤药物的抵抗性.     

细胞外信号调节激酶通路在乙肝病毒X基因改变肝癌细胞化疗敏感性中的作用

目的 观察细胞外信号调节激酶(ERK)信号传导通路在乙肝病毒X基因(HBx)改变肝癌细胞HepG2对顺铂敏感性中的作用.方法 采用聚合酶链反应(PCR)法从pCP10质粒中扩增482 bp HBx的开放读码框(ORF),构建表达载体pcDNA3-HBx并进行酶切及测序鉴定.应用脂质体将其转染HepG2,50 mg/L G418筛选阳性克隆,抽提mRNA,逆转录(RT)-PCR鉴定是否稳定表达HBx.Western blot法检测转染前后44×103及42×103磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的表达.噻唑蓝(MTT)法检测转染空脂质体组、空载体组HepG2、HBx+ HepG2对2 mg/L顺铂敏感性的差异,以及顺铂联合ERK通路特异性抑制剂PD98059对HBx+HepG2抑制率的改变.结果 从pCP10中扩增得到482 bp HBx-ORF片段.将其与pcDNA3连接后经酶切及测序鉴定,成功构建HBx-ORF表达载体.从G418抗性细胞克隆中成功扩增出482 bp HBx-ORF,表明转染后的HepG2细胞稳定表达目的片段.经Western blot及灰度扫描鉴定,HBx+细胞中p-ERK蛋白表达是空脂质体组的1.97倍,是空载体组的1.67倍.MTT法检测2 mg/L顺铂作用24 h,对HBx+ HepG2的抑制率为19.56％,明显低于对空脂质体组和空载体组HepG2的抑制率(35.21％和30.18％).而先以100 μmol/L PD98059孵育2h的HBx+ HepG2,顺铂对其抑制率上升至31.20％,与未加PD98059时比较有显著提高(P＜0.05).结论 ERK信号传导通路的激活在抑制HBx+的肝癌细胞的化疗敏感性方面起重要作用,对该通路的特异性抑制有助于提高HBx+肝癌的化疗效果.     

Bcl-2家族蛋白在Ad．mda-7介导HepG2细胞凋亡中的变化

目的 观察Bcl-2家族蛋白在Ad．mda-7介导HepG2细胞凋亡中的变化，初步探讨Ad．mda-7介导肝癌细胞的凋亡机制。方法将携带人MDA-7／IL-24基因的腺病毒转染HepG2和ID2，通过四甲基偶氮哩蓝染色法（MTr）及Hoechst染色观察MDA-7／IL-24对肝癌细胞HepG2和正常肝胚细胞ID2的生长抑制和杀伤作用。AnnexinV和PI双染后流式细胞仪检测细胞的凋亡。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测Bcl-2家族蛋白的变化。结果Ad．mda-7能明显抑制肝癌细胞HepG2的生长，但对正常肝胚细胞ID2没有明显抑制增殖作用。Hoechst染色和流式细胞仪提示Ad．mda-7能明显诱导肝癌细胞HepG2细胞的凋亡，但对正常肝胚细胞ID2没有明显毒副作用。Westernblot说明抑制凋亡的蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达在HepG2明显下降，在ID2中则没有变化；而促凋亡蛋白Bax在HepG2和ID2都升高。结论Ad．mda-7转染HepG2后，促凋亡（Bax）与抑凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-xl）的比率发生改变，进而发生凋亡。     

促红细胞生成素抑制过氧化氢诱导的肾小管细胞凋亡

目的探讨促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是否可以抑制过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激和细胞凋亡及其抑制凋亡的相关机制。方法传代培养大鼠近端肾小管上皮细胞（NRK-52E）,分为正常对照组（NC组）、H1组（1mmol／L H2O2）、H2组（5mmol／LH2O2、E组（H2U＋EPO组）。细胞免疫荧光检测NRK-52E细胞是否表达EPO受体（erythropoietin receptor,EPOR）。荧光探针氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯（CM—H2DCFDA）标记检测细胞内活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平。流式细胞仪AnnexinV-FITC／PI双染法检测细胞凋亡指数。RTPCR检测凋亡相关基因B细胞淋巴瘤／白血病-2（B-cell lymphoma／L eukemia-2,Bcl-2）家族中Bcl-2和BaxmRNA的表达。结果NRK52E细胞表达EPOR。H2O2引起NRK-52E细胞内ROS水平升高,上调BaxmRNA表达、下凋Bcl-2mRNA表达,诱导NRK-52E细胞凋亡。EPO可以抑制H2O2诱导的ROS水平升高、Bcl2mRNA表达下调、BaxmRNA表达上调及NRK-52E细胞凋亡。结论EPO可以缓解H2O2诱导的氧化应激、上调Bcl-2mRNA表达、下调BaxmRNA表达,抑制H2O2诱导的NRK52E细胞凋亡,发挥肾小管细胞保护效应。     

5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡机制影响的初步探讨

目的拟观察5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞Smad7和β转化生长因子（transforming growth factor-β,TGF-β）Ⅰ型受体以及细胞凋亡相关基因Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法（1）瘢痕疙瘩组织成纤维细胞原代培养,取4～6代传代细胞加入5个不同浓度（10,20,40,80,160μmol／L）5-氟尿嘧啶干预24,48,72h。（2）利用四甲基偶氮唑盐法（MTT）测定瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖能力。（3）应用蛋白免疫印迹法（Western-blot）检测各组瘢痕疙瘩成纤维细胞中Smad7和TGF-βI型受体的表达及对Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果（1）MTT实验中,当5-氟尿嘧啶浓度为10,20μmol／L作用24h时,未发现成纤维细胞死亡,与空白对照组相比差异无统计学意义（P〉0．05）;其他浓度下作用各组成纤维细胞死亡现象差异均有统计学意义（P〈0．01）。（2）免疫印迹法实验结果如下：①与空白对照组相比,TGF-βI组Smad7表达明显减弱,TGF-βI型受体表达则显著增强,差异有统计学意义（P〈0．01）。②加入5-氟尿嘧啶干预后可显著增强Smad7的表达,差异有统计学意义（P〈0．01）。③经不同浓度5-氟尿嘧啶干预后,实验组Bcl-2蛋白表达均低于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）。但实验组Bax蛋白表达均高于对照组（P〈0．05）,TGF-βI型受体表达无明显影响,差异均无统计学意义（P〉O．05）。结论5-氟尿嘧啶对瘢痕疙瘩成纤维细胞具有抑制增殖和诱导凋亡的作用。     

邻-氨基酚去甲表鬼臼毒素抗骨肉瘤SOSP-9607细胞作用及机理研究

目的：研究邻-氨基酚去甲表鬼臼毒素（ODE）抗骨肉瘤SOSP-9607细胞作用及机理。方法：采用MTT比色法测定体外抗骨肉瘤SOSP-9607细胞作用,透射电子显微镜观察细胞凋亡形态学;采用激光共聚焦显微镜测定SOSP-9607细胞内Ca^2＋、Mg^2＋．pH值和线粒体膜电位（MMP）的荧光强度;免疫细胞化学技术检测细胞内Bcl-2和Bax表达。结果：ODE时间、浓度依赖性地抑制SOSP-9607细胞生长,诱导细胞凋亡具有典型的凋亡形态特征如细胞膜表面微绒毛消失、核固缩、核碎裂等;剂量依赖性地增加SOSP-9607细胞内Ca^2＋,Mg^2＋浓度而降低细胞内pH值和线粒体膜电位;使SOSP-9607细胞内Bcl-2蛋白表达下降而Bax蛋白表达增加。结论：邻-氨基酚去甲表鬼臼毒素在体外实验中能明显抑制骨肉瘤SOSP-9607细胞生长,其作用机制可能与改变细胞内环境稳态及Bcl-2和Bax蛋白表达而诱导细胞凋亡有关。     

环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对膀胱癌T24细胞杀伤作用的研究

目的：体外观察塞来昔布对人膀胱癌T24细胞株的抑制作用,并探讨其可能的机制。方法i采用MTT法检测塞来昔布对T24细胞的生长抑制作用;采用Hoechst 33258染色观察细胞凋亡形态;采用Western印迹法检测塞来昔布作用前后T24细胞COX-2蛋白的表达变化;采用RT—PCR法检测塞来昔布作用前后T24细胞Bcl-2及Bax基因的表达变化。结果：塞来昔布（≥100μmol／L）作用24h及48h后能明显抑制T24细胞的生长并诱导凋亡;塞来昔布100μmol／L作用,24h及48h后,T24细胞COX-2蛋白表达量下降,Bcl-2基因表达亦下调,而Bax基因在塞来昔布作用24h后变化不明显,48h后表达上调。结论：塞来昔布能抑制T24细胞增殖并诱导其凋亡,可能与下调Bcl-2、上调Bax基因表达有关。     

姜黄素抑制肾癌ACHN细胞增殖及促凋亡的实验研究

目的观察姜黄素对人肾癌ACHN细胞株增殖及细胞凋亡的影响,探讨姜黄素诱导ACHN细胞株凋亡的作用机制。方法不同浓度姜黄素作用人肾癌ACHN细胞24 h后,应用MTT比色法检测姜黄素对人肾癌ACHN细胞的增殖抑制率;流式细胞术检测姜黄素诱导细胞的凋亡率;RT-PCR检测姜黄素对ACHN细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65 mRNA表达的影响;Western blot方法检测其对细胞Bcl-2、Bax、NF-κBP65I、κB蛋白表达的影响。结果姜黄素对人肾癌ACHN细胞有明显的抑制作用,可引起细胞凋亡,并且存在剂量和时间依赖;不同浓度姜黄素作用细胞24 h后,Bcl-2、NF-κBP65 mRNA水平下降,Bax mRNA水平升高(P0.05),Bcl-2、NF-κBP65蛋白表达量下降,BaxI、κB蛋白表达量升高(P0.05)。结论姜黄素通过上调IκB,下调NF-κB活性,调控凋亡基因Bcl-2/Bax的表达,抑制人肾癌ACHN细胞的增殖,诱导人肾癌ACHN细胞的凋亡。     

小干扰RNA逆转Wnt/β-catenin通路对肝癌耐药细胞株HepG2/ADM的影响研究

目的 了解沉默β-catenin基因对肝癌耐药细胞HepG2的影响。方法 实验分为5组：正常肝细胞（LO2）组、HepG2组、HepG2/ADM组、SiNC-HepG2/ADM阴性转染组和Siβ-catenin-HepG2/ADM转染组;细胞免疫荧光技术检测各组β-catenin的表达情况;设计并筛选出抑制效率最高的Siβ-catenin;Western-blot及RT-PCR技术检测各组β-catenin、P-gp、MRP1的mRNA和蛋白的表达水平;MTT法观察各组对阿霉素（ADM）、氟尿嘧啶（5-FU）、环磷腺苷（VCR）和奥沙利铂（OHP）的敏感性;流式细胞仪检测各组细胞凋亡。结果 50 mol/L的ctnnb1-001在HepG2/ADM中抑制效率最高：78.86%（P<0.05）,选其为Si-β-catenin;细胞免疫荧光显示HepG2/ADM中β-catenin荧光最强,转染Si-β-catenin后荧光显著减弱;β-catenin、P-gp和MRP1 mRNA和蛋白在HepG2/ADM组表达较高,mRNA表达分别为：0.92±0.03、7.98±0.43和4.56±0.12（P<0.05）,蛋白表达分别为：1.128±0.214、1.678±0.344和1.405±0.212（P<0.05）;转染Siβ-catenin至HepG2/ADM中,β-catenin、P-gp和MRP1在mRNA及蛋白水平均不同程度表达减少,mRNA表达分别为：0.47±0.03、0.66±0.054和0.74±0.03（P<0.05）,蛋白表达分别为：0.787±0.032、0.797±0.055和1.390±0.050（P<0.05）;Siβ-catenin-HepG2/ADM转染组较HepG2/ADM组对ADM、5-FU、VCR和OHP的耐药系数（RI）分别为0.61、0.55、0.30、0.55,对化疗药物敏感性显著增强（P<0.05）;Siβ-catenin-HepG2/ADM转染组凋亡率（28.05±0.35）%,较其他组明显增加（P<0.05）。结论 Wnt/β-catenin通路在HepG2中异常激活,其中β-catenin可能正性调控肝癌耐药基因P-gp和MRP1,Si-β-catenin能一定程度阻断Wnt通路,并能一定程度逆转肝癌细胞株HepG2的耐药性和增强化疗敏感性,增加凋亡。     

P38MAPK信号通路抑制剂SB203580对肝细胞缺氧再灌注影响的实验研究

目的 观察P38MAPK抑制剂SB203580在人肝癌细胞系HepG2细胞和人正常细胞系L02细胞缺氧再灌注过程中的作用.方法 实验分为正常对照组、缺氧对照组、SB203580＋正常培养组、SB203580＋缺氧培养组,缺氧培养24h、复氧1h后,分别应用Western Blot、MTT、划痕实验、Transwell实验、AnnexinV-FITC/PI双染实验检测细胞中P38蛋白表达情况和细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的变化.结果 与正常对照组相比,缺氧培养组HepG2细胞的凋亡率、P38MAPK磷酸化水平增加;SB203580＋缺氧培养组HepG2细胞的凋亡率相对于缺氧培养组增加,P38MAPK磷酸化水平降低;划痕实验48 h后,缺氧对照组HepG2细胞明显向划痕的中央迁移,而SB203580＋缺氧培养组HepG2细胞迁移受到抑制;侵袭实验24h后,SB203580＋缺氧培养组HepG2细胞的侵袭能力较缺氧对照组降低（P＜0.05）;AnnexinV-FITC/PI双染实验显示与缺氧对照组相比,L02细胞SB203580＋缺氧培养组凋亡率降低,而HepG2细胞SB203580＋缺氧培养组凋亡率则增加（P ＜0.01）;MTT结果显示实验组HepG2细胞和LO2细胞增殖抑制率受到影响,并出现时间浓度依赖关系.结论 SB203580通过特异性阻断P38MAPK信号转导通路,对缺氧培养的正常肝细胞LO2细胞产生保护作用,同时对缺氧培养的肝癌细胞HepG2具有促进凋亡、抑制增殖以及抑制细胞迁移和降低侵袭能力的作用.     

损伤相关模式分子对人肝癌HepG2细胞增殖能力的影响

目的 观察在DAMPs诱导下人肝癌HepG2细胞增殖能力的变化.方法 将HepG2细胞分为对照组和实验组（10、20、40、80 μl DAMPs处理的HepG2细胞）;MTT比色法检测HepG2细胞的增殖能力;实时荧光定量PCR法检测IL-6 mRNA表达的变化;Western Blot法检测HepG2细胞IL-6蛋白的表达情况.结果 HepG2细胞随着DAMPs剂量的递增及时间的延长增殖能力逐渐增强,呈现明显的量效-时效关系,在剂量40 μl,作用时间36 h时细胞增殖能力达到最强,差异有统计学意义（P〈0.01）;选取作用时间为36 h,随着DAMPs剂量的递增,实时定量PCR法检测到HepG2细胞IL-6 mRNA分别为95.55±4.47,171.80±6.60,453.30±14.47,610.59±12.70,441.04±18.91,差异有统计学意义（P〈0.01）;Western Blot法检测HepG2细胞IL-6蛋白的表达分别为1.47、2.07、2.74、3.44、3.00,差异有统计学意义（P〈0.01）.结论 DAMPs在一定剂量及时间内促进人肝癌HepG2细胞增殖,并且呈现明显的量效-时效关系.