人外周血单核细胞体外诱导树突状细胞及鉴定

目的：建立从人外周血单核细胞体外诱导培养树突状细胞（dendritic cell,DC)的方法。方法：分离人外周血单个核细胞,以细胞因子粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）,白细胞介素－4（IL－4）,肿瘤坏死因子α（TNF－α）诱导培养获得DC,电镜及共聚集显微镜观察其形态,流式细胞术检测细胞表面抗原,体外同种混合淋巴细胞反应检测DC刺激T细胞的增殖活性。结果：从正常外周血分离得到的单核细胞,体外经重且人GM－CSF,IL－4,TNF－α的共同诱导培养,得到大量成熟DC,形态学观察可见典型DC特征,荧光激少在细胞分离器（FACS）检测表明,诱导的DC高表达HLA－DR（96％）,CD83（94．2％）,CDla(94.2%)分子,同时也高表达CD40（97．7％）,CD80（98．2％）分子,同种混合淋巴细胞反应显示,诱导的DC具有很强的激发同种T细胞增殖的能力。结论：人外周血单核细胞体外经细胞因子贯序诱导培养,可以生成大量功能成熟的DC,为进一步开展DC的基础研究和临床应用提供了可能。     

外周血树突细胞亚群与外周血单个核细胞在肺结核中的变化

目的通过对肺结核患者外周血树突细胞（DC）亚群数量和淋巴细胞（LC）、单核细胞（MO）的绝对值的观察,了解DC亚群和LC绝对值、MO绝对值在肺结核病情中的变化情况,以及三者的相关性,探讨DC亚群和LC、MO在肺结核发病机制中的作用及临床意义。方法采用流式细胞术的三色分析法检测70例肺结核患者的DC1及DC2亚群。用全自动血细胞计数五分类法检测外周血LC、Mo的绝对值。结果①肺结核活动期患者外周血DC1/PBM（C外周血单个核细胞）、DC2/PBMC及DC1、DC2的绝对数均明显低于健康正常者（P〈0.05）,DC1/DC2的比值明显高于健康正常者（P〈0.05）;非活动期患者DC1/PBMC、DC2/PBMC及DC1、DC2的绝对数与健康正常者比较均无显著性差异（P〉0.05）,DC1/DC2的比值与健康正常者比较无显著性差异（P〉0.05）;活动期患者DC2的绝对数明显低于非活动期（P〈0.05）。②活动期与非活动期患者的LC绝对值明显低于健康正常者（P〈0.05）;活动期患者外周血的LC绝对值明显高于健康正常者（P〈0.05）;非活动期患者的MO绝对值与健康正常者比较无显著性差异（P〉0.05）。③肺结核活动期患者的DC1绝对数、DC2绝对数与LC、MO、之间作两两相关性分析,均未发现有相关性（P〉0.05）。结论肺结核患者外周血DC1和DC2数均明显降低、LC绝对值减少及MO绝对值增多。研究提示DC、LC、MO在肺结核的免疫发病机制中均发挥一定的作用,外周血树突细胞亚群（DC1、DC2）的检测可了解肺结核患者的免疫功能状态及反映病情变化,有助于阐明肺结核的免疫致病机理,同时也可为肺结核的生物防治提供新线索。     

人脐血CD34+细胞和贴壁细胞体外诱导树突状细胞及其鉴定

目的 从人脐血中不同的前体细胞扩增树突状细胞(DCs)，并对其进行鉴定。方法 用免疫磁珠法分离人脐血CD34^ 细胞，以GM—CSF、TNF-α、FL、SCF和IL-4诱导生成DC；用Ficoll分离脐血单个核细胞，2h贴壁后的细胞，以GM-CSF、IL-4和TNF-α诱导生成DC。观察细胞形态，流式细胞仪分析表面标志(CDla、CD80、HLA-DR)，并检测其刺激同种异体T细胞增殖的能力。结果 人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞体外诱导生成的细胞均具有典型的DC形态特征，表达高水平的DC分化抗原CDla，MHCⅡ类抗原递呈分子HLA—DR和CD80共刺激分子，并具有刺激同种异体T细胞增殖的能力。前者扩增DC的效率更高。结论 从人脐血CD34^ 细胞和贴壁细胞均可诱生出功能性DC，是DC理想的组织来源。     

终末期肾脏病患者外周血树突细胞的数量及活性

目的观察终末期肾脏病(ESRD)患者外周血中树突细胞(DC)数量及活性,为反映细胞免疫功能、评估透析对机体免疫状态的影响及开展ESRD免疫治疗提出可能。方法31例ESRD患者分为尿毒症组(未透析,11例)、腹膜透析组(10例)、血液透析组(10例),另选取23名健康者作为正常对照组。采用DC分类试剂盒检测外周血DC亚群百分率。分离外周血单个核细胞,细胞因子体外诱导培养,采用流式细胞仪检测DC表型分子表达水平。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测第9天DC培养上清液中白介素(IL)-12的含量。采用异体混合淋巴细胞培养评估DC刺激T细胞增殖的能力。结果①DC亚群状况:与正常对照组比较,尿毒症组的外周血DC显著减少(P<0．05),以淋巴系DC(PDC)减少为主(P<0．01);腹膜透析组的外周血DC较尿毒症组显著增多(P<0．01),接近正常对照组(P>0．05);与正常对照组比较,血液透析组的髓系DC(MDCI)明显减少(P<0．01),PDC明显增多(P<0．01),MDC1／PDC降低(P<0．01)。②DC表型分析:与正常对照组比较,尿毒症组的DC表型分子表达均显著减少(P值均<0．01);腹膜透析组DC表达CD40、CD80、CD83显著减少(P值分别<0．05和0．01);血液透析组DC表达CD1a、CD11c、CD40显著减少(P值均<0．01),表达CD123显著增多(P<0．05)。③IL-12:尿毒症、腹膜透析和血液透析组DC分泌IL-12较正常对照组明显减少(P值均<0．05)。④异体混合淋巴细胞反应:与正常对照组比较,尿毒症和腹膜透析组的DC刺激T细胞增殖的能力明显降低(P值均<0．01),血液透析组接近正常(P>0．05)。结论ESRD患者DC数量明显减少且功能明显紊乱,腹膜透析及血液透析不同程度地改善了此现象,为患者的生物免疫治疗提供可能。     

生长激素对脐血来源树突细胞成熟状态的影响

目的 检测生长激素(GH)对脐血来源树突细胞(DC)的免疫表型和功能状态的影响.方法 从新鲜脐带血中分离出单核细胞,应用白细胞介素4(IL-4)和重组人粒-巨细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)诱导刺激单核细胞,以不同浓度的GH作为修饰因子修饰DC诱导过程;观察DC形态、数目、生长状态,流式细胞仪检测DC的免疫表型,酶联免疫吸附试验测定DC上清液中白细胞介素12(IL-12),自体混合淋巴细胞反应测定其功能状态.结果 脐血贴壁的单核细胞在细胞因子和GH诱导下可以分化为成熟DE,不同浓度(5、25、100 ng/ml)GH可显著上调DC CD83(31%±4%、34%±4%、34%±5%)、CD80(26%±4%、29%±6%、30%±6%)和HLA-DR(45%±8%、49%±6%、50%±5%)分子表达的阳性宰(P<0.05),明显提高DC分泌IL-12的能力[分别由第5天的(91±12)、(159±20)、(166±19)pg/ml上升到第9天的(686±58)、(796±61)、(810±67)pg/ml](P<0.05),DC对自体淋巴细胞的激活功能明显增强(P<0.05).结论 GH可明显促进DC的诱导过程,修饰加速DC的成熟并提高细胞表面共刺激分子表达,增强DCIL-12分泌和激发自身淋巴细胞增殖能力;GH的修饰作用与浓度有一定的相关性.     

猪苓多糖经TLR4刺激小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟

目的：研究猪苓多糖（polyporus polysaccharides,PPS）诱导小鼠骨髓树突状细胞（dendriticcell,DC）表型及功能成熟的分子机制。方法：从小鼠骨髓中分离单个核细胞（MNC）,用rmGM-CSF、IL-4培养5 d后将其分为三组：实验组中加入50μg/mL PPS;阳性对照组中加1μg/mL LPS;加等量RPMI 1640培养基作为阴性对照组,继续培养48 h。苏木精-伊红（HE）染色观察细胞形态;流式细胞仪（FACS）分析DC表面CD80、CD86及MHC II（I-A/I-E）表达情况;经20μg/mL Toll-like receptor（TLR）4、TLR2单抗作用1 h后,ELISA法检测培养上清中IL-12 p40含量;混合淋巴细胞反应（MLR）检测DC对T淋巴细胞的刺激能力。结果：PPS处理的DC具有毛刺状突起,呈典型的DC形态;细胞表达MHC II、CD80及CD86增加;对T淋巴细胞刺激能力增强;分泌IL-12增加且可被抗TLR4单抗所阻断。结论：PPS通过TLR4促进体外培养的小鼠骨髓DC表型与功能成熟。     

免疫抑制剂对人外周血CD4+和CD8+T细胞Tim3表达的影响及意义

目的:观察4种免疫抑制剂对正常人外周血中CD4+和CD8+细胞Tim3表达的影响.方法:选取6名正常志愿者外周血各30 ml,分离淋巴细胞,PHA刺激淋巴细胞增殖,按照免疫抑制剂分为CsA、MMF、FK506、RAPA及DMX单因素组和混合干预组,培养3d后,流式细胞仪检测CD4+和CD8+细胞的Tim3表达,并在72...     

脐血与成人外周血单核细胞来源树突状细胞分化和成熟标志物的比较

目的 比较脐血单核细胞(CBMC)来源树突状细胞(DC)和成人外周血单核细胞(PBMC)来源DC在分化和成熟过程中表型的变化,以探讨新生儿免疫功能低下的原因.方法 将重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)和脂多糖(LPS)的不同组合对单核细胞来源DC进行刺激培养,利用流式细胞仪技术检测DC表面CD11c、CD1a、CD80、CD86、CD40、MHC Ⅰ类和MHC Ⅱ类分子的表达.结果 CD11c阳性细胞和MHC Ⅰ类分子在CBMC来源DC和PBMC来源DC的表达率非常接近(P>0.05).CBMC来源的DC上CD40的表达率低于PBMC来源Dc[(34.80±7.77)%vs(54.37±9.57)%](P<0.01).经LPS诱导后,CBMC来源DC上CD80、CD86的表达率都明显低于PBMC来源DC[(3.72±1.63)%vs(7.82±0.81)%、(28.53±4.67)%vs(45.62±5.16)%](均P<0.01).CBMC来源DC上MHC Ⅱ类分子的相对荧光强度(RFI)均低于PBMC来源DC(P<0.01).结论 CBMC来源DC上MHC Ⅱ类分子及协同刺激分子的表达均明显低于PBMC来源DC,可能是造成新生儿免疫功能低下及脐带血移植时移植物抗宿主病发生率较低的原因之一.     

脐血与成人外周血单核细胞来源树突状细胞分化和成熟标志物的比较

目的比较脐血单核细胞(CBMC)来源树突状细胞(DC)和成人外周血单核细胞(PBMC)来源DC在分化和成熟过程中表型的变化,以探讨新生儿免疫功能低下的原因。方法将重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)和脂多糖(LPS)的不同组合对单核细胞来源DC进行刺激培养,利用流式细胞仪技术检测DC表面CD11c、CD1a、CD80、CD86、CD40、MHCⅠ类和MHCⅡ类分子的表达。结果CD11c阳性细胞和MHCⅠ类分子在CBMC来源DC和PBMC来源DC的表达率非常接近(P>0.05)。CBMC来源的DC上CD40的表达率低于PBMC来源DC[(34.80±7.77)%vs(54.37±9.57)%](P<0.01)。经LPS诱导后,CBMC来源DC上CD80、CD86的表达率都明显低于PBMC来源DC[(3.72±1.63)%vs(7.82±0.81)%、(28.53±4.67)%vs(45.62±5.16)%](均P<0.01)。CBMC来源DC上MHCⅡ类分子的相对荧光强度(RFI)均低于PBMC来源DC(P<0.01)。结论CBMC来源DC上MHCⅡ类分子及协同刺激分子的表达均明显低于PBMC来源DC,可能是造成新生儿免疫功能低下及脐带血移植时移植物抗宿主病发生率较低的原因之一。     

诱导体外扩增脐血CD34+细胞分化为树突状细胞的研究

目的应用两步法诱导体外扩增的脐血CD34 细胞分化为树突状细胞,为进一步研究作准备.方法用免疫磁珠法分离人脐血CD34 细胞,先以SCF、FL和TPO体外扩增2周,然后以GM-CSF、TNF-α、FL、SCF、IL-4诱导生成DC,并对细胞观察鉴定.同时观察DC前体细胞冻存后对DC生成的影响.结果人脐血CD34 细胞体外扩增后诱导生成的DC具有典型的DC形态特征,表达高水平的DC分化抗原CDla,MHCⅡ类抗原递呈分子HLA-DR和CD80共刺激分子,具有刺激同种T细胞增殖的能力.该法较直接从CD34 细胞诱生DC获得DC的产量显著提高.冻存DC前体细胞复苏后仍可诱生出具有典型形态和功能的DC.结论脐血CD34 细胞体外扩增后,可诱生出大量具有功能的成熟DC.非程控降温的方法保存DC前体细胞于一80℃冰箱,可以有效的保存其向DC分化的能力.     

CD34+HPC来源的树突状细胞体外扩增和功能研究

目的研究脐血CD34^ HPC体外扩增诱导产生功能性树突状细胞(DCs)的有效方案。方法Ficoll分离脐血获得单个核细胞。免疫磁珠阳性分选CD34^ HPC,^sH^-TdR检测DCs激发异体T细胞增殖的能力。MTT法检测特异性CTL的杀伤能力。结果SCF FL GM—CSF IL-4诱导生成的DCs激发T细胞增殖和特异性CTL的杀伤能力均高于其他组。结论SCF FL GM—CSF IL-4可有效扩增CD34^ HPC并诱导产生功能性DCs。     

沙培林诱导脐血树突状细胞的成熟

目的 改进体外诱导脐血树突状细胞（DC）成熟的方案，为后期制备临床使用的抗肿瘤DC疫苗提供新的技术路线。方法 分离脐血单个核细胞（CBMC）并在含10％同源脐血浆、重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素-4（rhIL-4）的培养体系中诱导培养，部分加入肿瘤冻融抗原和／或沙培林（OK-432）冲击，光镜和电镜下观察细胞形态，流式细胞仪检测培养前后各组细胞表面抗原CD1a和CD83的表达情况。结果培养过程中，细胞形态发生明显变化，呈现典型的DC形态。收集第9天各组DC，细胞表面均高度表达CD1a和CD83，与贴壁分离的CBMC比较有统计学意义，肿瘤冻融抗原冲击后，DC表面CD1a和CD83的表达上调，沙培林进一步刺激后，CD1a和CD83表达率显著升高。结论 诱导脐带血来源的前体细胞分化为未成熟DC的途径相对简便；沙培林能促进肿瘤冻融抗原冲击后的脐血DC进一步成熟。     

宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞的生物学特性观察

【目的】探讨宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞(DC)的生物学特性。【方法】14例Ib期及以上的宫颈癌患者为研究组,24例健康女性为对照组。外周血经密度梯度离心得到单个核细胞,其中附壁成分在含GM-CSF/IL-4的完全淋巴细胞培养液培养。光镜和电镜观察培养细胞的形态变化。培养7d后,计算树突状细胞的产量,流式细胞术分析HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD1a和CD14的表达,同种异体淋巴细胞的混合淋巴反应(MLR)检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力。【结果】经过7d培养,两组均诱导出典型形态和表型的DC。宫颈癌患者单位体积外周血的未成熟DC(ImDC)的产量为67.3×106±33.8×106,较对照组低(P<0.05)。研究组的CD40、CD80和CD1a的平均荧光强度(MFI)分别为18±9,15±6和71±11,均较对照组低(P<0.05);而两组ImDC的HLA-ABC、HLA-DR表达强度相似(P>0.05)。相同PBL/DC比值,研究组ImDC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力下降(P<0.05)。【结论】宫颈癌患者的外周血单个核细胞培养的树突状细胞(ImDC)和健康对照组的ImDC具有免疫学差异,提示在应用树突状细胞进行免疫治疗时应考虑这种差异。     

来源于CD14+的树突细胞分化过程中膜脂分子运动及蛋白质构象的变化

目的：树突细胞（Dendritic Cells,DC）是免疫系统中功能最强大的抗原呈递细胞（Antigen Presenting Cells,APC）,它具有独特的向T细胞呈递抗原的能力.为了研究DC分化过程中细胞膜性质和细胞蛋白质构象的变化,以对其基本生物学特性有更好的理解.方法：用免疫磁珠从人外周血单个核细胞分离得到CD14＋单核细胞,用人GM-CSF和IL-4诱导其分化为未成熟的DC后,加入TNF-α使其成熟.用荧光偏振和傅里叶变换红外光谱技术研究各发育阶段细胞膜流动性及其蛋白二级结构的变化.结果：在CD14＋单核细胞分化为未成熟和成熟DC过程中,细胞膜的流动性和蛋白质的α-螺旋、β-片层、β-弯曲和无规卷曲等二级结构均发生了明显改变.结论：成熟DC的膜脂分子运动比单核细胞和未成熟DC更为活跃,同时蛋白质的构.象的主要成分也显著减少.     

脐血CD34^＋细胞分离方法比较

目的：比较不同方法分离脐血单个核细胞（MNC）及纯化CD34＋细胞效果。方法：采集脐血48份，在室温下保存12、24、48小时，分别用密度离心法和羟乙基淀粉（HES）沉淀法分离脐血MNC，再用免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞，以台盼蓝拒染法检测细胞存活率。结果：脐血在室温下保存48小时分离MNC和CD34^＋细胞数最多．其次为12小时，在24小时分离所得最低（P〈0．05）；HES沉淀法较密度离心法分离所得MNC和CD34^＋细胞数明显增多（P〈0．05）；6组细胞存活率差异无统计学意义（P〉0．05）；免疫磁珠法纯化CD34^＋细胞可达（88±5）％的纯度。结论：HES沉淀法优于密度离心法，且48小时分离为优，免疫磁珠法纯化CD34＋细胞可提高纯度：各种方法对细胞存活率无明显影响。     

体外诱导培养健康成人外周血单核细胞源树突状细胞及鉴定

目的：建立体外从健康成人外周血单核细胞（Mo）诱导培养成熟的树突状细胞（DE）的方法。方法：采用连续贴壁法分离正常人外周血单核细胞,在GM-CSF和IL-4的完全培养基中培养。培养5天后收集细胞,重新铺板后继续在TNF-α的完全培养基中培养48小时后,收集细胞和上清液,采用流式细胞术检测DC表型CD80、CD83、CD40的表达;用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-12的浓度;用倒置显微镜动态观察DC形态变化。结果：采用连续贴壁法和用GM—CSF、IL-4和TNF—α联合培养可以从人外周血诱导培养出大量的树突状细胞,且高表达CD80、CD83、CD40,表达率分别为84．29％、90．73％、92．38％。DC分泌的细胞因子IL-12浓度为38．52±11．34pg／ml。结论：采用连续贴壁法和用GM．CSF、IL-4和TNF-α联合培养可以从人外周血诱导培养大量的树突状细胞,检测表型CD80、CD83、CD40的表达率和细胞因子IL-12浓度可以鉴定树突状细胞。     

人外周血树突细胞的分离与提纯

目的 从人外周血中分离、培养及鉴定树突细胞（ＤＣ）。方法 从正常人外周血分离获得单个核细胞,培养２小时后,取会细胞,在无血清培养基中加入不同的细胞在子,于２的第１,６,８天对形态,表型和功能分擀行测定,并在光镜、电镜下观察ＤＣ的纯度与得率。结果 体外培养６～８天可获得高纯度大量的ＤＣ,较高表达ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８３和ＣＤ８６,能强烈激发同种慢体Ｔ淋巴细胞增殖。结论 上述方法可以从人外周血     

脐血CD34+细胞体外扩增和分化调节的研究

目的：探讨脐血体外扩增的最佳造血生长因子组合及时间。方法：脐血CD34^ 细胞培养于含不同造血生长因子组合的无血清培养液。对其有核细胞数（NC）、表面抗原以及集落形成能力进行监测。结果：同对照组相比，扩增组的NC和CD34^ 细胞均有不同程度的扩增，扩增高峰分别为第10d和第6d；其中含SCF、IL-3、IL-6、TPO、Flt3-L、G-CSF及Epo的E组扩增的细胞数最多。第6d，CD34^ 细胞、NC及CFC总数分别扩增了9.90、101.80和31.18倍，第10d分别累积扩增了3.56、357.42和73.11倍。而D组（含SCF、IL-3、IL-6、TPO及Flt3-L）扩增的细胞中CD34^ 及CD34^ CD38^-含量最高。提示E组细胞分化较D组明显。结论：体外扩增可望解决单份脐血造血干/祖细胞数量不足的问题，但扩增中应注意其过度分化，扩增时间以6-10d为宜。     

外周血来源树突状细胞的体外诱导及鉴定

目的 建立人外周血树突状细胞(dendritic cell,DC)的分离方法,观察其形态学和免疫组织化学的特点,为下一步研究提供DC来源.方法 用重组人GM-CSF、IL-4从人外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测所得细胞的纯度,光镜、电镜观察其形态,SP免疫细胞化学方法检测DC的分子表达.结果 此纯化方法所得细胞纯度可达到80%以上,形态学观察可见纯化细胞具有典型的DC特征,该细胞高表达HLA-DR和S-100分子.结论 此种方法可获得较高纯度典型的DC,为进一步研究及临床应用提供了可能.