日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3的纯化及抗体制备

目的制备日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白Sj14-3-3的多克隆抗体与单克隆抗体。方法将合Sj14-3-3重组蛋白的凝胶条带冻干磨粉,免疫家兔,制备抗Sj14-3-3多克隆抗血请;用电洗脱纯化的Sj14-3-3免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗Sj14-3-3单克隆抗体。测定所得抗体效价及特异性鉴定。结果获得大量纯化的表达产物;制备的多克隆抗血清双扩效价达1:8～1:64。获得1株能稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞株4D9,单抗亚类为IgG1。此株单抗能与重组Sj14-3-3蛋白发生特异性反应。结论获得了高度敏感、特异的抗Sj14-3-3多克隆抗血清及稳定分泌抗Sj14-3-3单抗的杂交瘤细胞。     

抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体,并鉴定抗体性质。方法以重组表达纯化的日本血吸虫信号蛋白14-3-3为抗原免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对获得的单克隆抗体进行类和亚类、效价、浓度、纯度、亲和常数、特异性和检测灵敏度的测定与鉴定。结果共获得6株针对日本血吸虫信号蛋白14-3-3的单克隆抗体,分别为5G9、3F1、3F7、5C6、5D1和1G6,抗体类型分别为IgG1、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG1和IgG1。对其中的单克隆抗体5G9分析显示,制备的腹水抗体效价为1∶1.28×105,亲和层析纯化后的浓度为5.3 mg/ml,纯度95%,亲和常数为5.1×107mol/L。免疫印迹试验结果表明,该单克隆抗体可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原特异性反应,而与大肠埃希菌、健康人血清和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。HRP标记的单克隆抗体5G9检测14-3-3蛋白的灵敏度为31.25 ng/ml。结论本研究获得了6株能稳定分泌抗日本血吸虫14-3-3蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,为建立新的日本血吸虫活动性感染检测方法奠定了良好的基础。     

猪带绦虫Tsl4-3-3.6蛋白多克隆抗体制备及在不同发育阶段的表达北大核心CSCD

目的制备猪带绦虫Ts14-3-3.6蛋白多克隆抗体,并检测Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫及囊尾蚴阶段的表达情况。方法合成Ts14-3-3.6基因全长,然后克隆至pCznI原核表达质粒,转化至大肠埃希菌ArctieEx-press中并诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析,通过Ni柱亲和纯化获得Ts14-3-3.6重组蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰兔,制备抗Ts14-3-3.6多克隆抗体,以此为一抗采用Western blot检测Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的表达。结果pCznI一Ts14-3-3.6重组表达质粒构建成功,诱导表达的Ts14-3-3.6重组蛋白存在于包涵体中,相对分子质量约29.43X102。Western blot检测纯化带有His标签的Ts14-3-3.6重组蛋白能被His标签抗体识别;用该蛋白免疫新西兰兔获得效价为1:512000的多克隆抗体;分别以提取的猪带绦虫成虫和囊尾蚴总蛋白为抗原进行Westernblot,均出现与Ts14-3-3.6多克隆抗体、囊虫病人血清及囊虫病猪血清反应条带,即均有该蛋白的表达。结论成功制备猪带绦虫Ts14-3-3.6重组蛋白并获得较高纯度的特异性高效价多克隆抗体。Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。     

日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3的制备及其特性分析

目的制备可溶性重组日本血吸虫信号传导蛋白14-3-3（rSj14-3-3）,并研究其免疫学特性。方法采用反转录聚合酶链反应方法从日本血吸虫成虫mRNA中制备Sj14-3-3基因cDNA片段,将此cDNA片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-3的谷胱甘肽还原酶的基因下游,构建重组表达质粒Sj14-3-3/pGEX-4T-3。重组质粒转化大肠埃希菌BL21,转化子细菌采用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）进行诱导,表达产物经SDS-PAGE以观察重组GST-Sj14-3-3表达情况。GST-rSj14-3-3经凝血酶消化后,经过Glutathione Sepharose-4B胶亲和层析制备纯化的rSj14-3-3。rSj14-3-3免疫家兔制备免疫兔血清,经免疫印迹试验分析rSj14-3-3免疫原性和反应性。结果日本血吸虫江苏株Sj14-3-3蛋白基因编码序列被成功克隆,开放阅读框的DNA序列与基因库中的登录序列同源性为99.08%。构建的含Sj14-3-3蛋白基因的重组表达质粒经IPTG诱导能表达分子量约为55 kDa的融合蛋白,融合蛋白经凝血酶切割和亲和层析获得纯化的rSj14-3-3。rSj14-3-3能诱导家兔产生高效价的特异性抗体,该抗体可识别重组和天然的14-3-3蛋白。结论本研究成功制备了可溶性rSj14-3-3,其具有良好的免疫原性与反应性。     

猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

目的 建立猪带绦虫Ts14-3-3.3蛋白原核表达系统并制备兔多克隆抗体。方法 通过逆转录PCR(RT-PCR)技术将猪囊尾蚴总RNA反转录为cDNA,利用特异性引物扩增猪带绦虫Ts14-3-3.3基因,将其克隆至原核表达质粒pCznⅠ中,在大肠杆菌Arctic Express中用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达产物,用HisLink亲和层析柱进行纯化,免疫印迹(Western blot)法鉴定纯化后的Ts14-3-3.3重组蛋白。将纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,制备Ts14-3-3.3多克隆抗体,Western blot和免疫组化法检测Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴的分布。结果 成功构建猪带绦虫重组表达质粒pCznⅠ-Ts14-3-3.3,经IPTG诱导表达,获得可溶性形式高效表达的Ts14-3-3.3重组蛋白,分子质量约29.31 kD,纯化后带有His标签的Ts14-3-3.3重组蛋白能被抗血清所识别。用纯化的Ts14-3-3.3重组蛋白免疫新西兰兔,获得了Ts14-3-3.3多克隆抗体,其效价为1∶512 000。Western blot和免疫组化结果显示,Ts14-3-3.3天然蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴中均有表达。结论 成功制备猪带绦虫重组Ts14-3-3.3蛋白,并获得了高纯度、高效价的兔多克隆抗体。     

依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠脑红蛋白和14-3-3γ蛋白的影响

目的探索依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠脑红蛋白(Ngb)和14-3-3γ蛋白的影响。方法采用大脑中动脉闭塞法建立大鼠脑缺血再灌注模型,将48只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组和依达拉奉预处理组;采用酶联免疫吸附法检测血清Ngb和14-3-3γ水平,采用蛋白免疫印迹、免疫组化检测脑组织中Ngb和14-3-3γ表达。结果模型组大脑和血清的Ngb和14-3-3γ水平均高于假手术组(P<0.05),依达拉奉预处理组大脑和血清的Ngb和14-3-3γ水平均高于模型组(P<0.05)。结论依达拉奉能通过上调脑缺血再灌注大鼠血清和脑组织中Ngb和14-3-3γ水平发挥脑保护作用。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其单克隆抗体用于诊断的价值

目的探讨纯化的日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)及其相应单克隆抗体对日本血吸虫病的诊断价值。方法利用纯化的rSj14-3-3抗原和可溶性虫卵抗原(SEA)间接ELISA方法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清中特异性抗体;以纯化的抗rSj14-3-3单克隆抗体包板,以兔抗rSj14-3-3多抗和酶标羊抗兔多抗为检测系统的酶标夹心法检测患者血清中的循环抗原。结果用rSj14-3-3检测急、慢性血吸虫病患者血清中特异性抗体的阳性率分别为100%和933%,用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原的阳性率分别为100%和956%,两者联合检测的总阳性率分别为100%和978%;经治疗后2、4、6、12个月,抗体转阴率分别为387%、548%、75%、90%,血清循环抗原转阴率分别为177%、419%、55%、85%,两者联合检测的总转阴率分别为452%、63%、85%、90%;对正常人血清的检测未见假阳性反应,与华支睾吸虫病和钩虫病患者血清出现轻微的交叉反应;用SEA检测抗体的阳性率分别为978%和956%,与正常人及华支睾吸虫病和钩虫病患者血清均有不同程度的交叉反应,治疗后2、4、6、12个月阴转率分别为32%、65%、125%、15%。结论rSj14-3-3检测急慢性血吸虫病患者血清中的特异性抗体和利用抗rSj14-3-3单克隆抗体检测循环抗原具有高度的特异性和敏感性,抗原和单抗可规模化     

6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体的鉴定及初步应用

目的对6株抗日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3单克隆抗体生物学特性进行鉴定,并探讨其在血吸虫病诊断中的应用价值。方法采用酶联免疫吸附试验及免疫印迹法对6株单克隆抗体的类和亚类、腹水效价、亲和常数、检测灵敏度和特异性进行测定与鉴定。建立检测日本血吸虫感染兔血清14-3-3蛋白的Dot-ELISA方法,对感染兔吡喹酮治疗前、后不同时间的配对血清中14-3-3蛋白含量的动态变化进行观察,并通过对一批血吸虫感染兔血清样本进行检测,以评价该方法的诊断价值。结果 6株抗日本血吸虫信号蛋白14-3-3单克隆抗体3F1、3F7、5C6、5D1、5G9、1G6的抗体亚类分别为IgG1、IgG2 a、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1;腹水单克隆抗体效价分别为1∶6.4×105、1∶8.0×105、1∶6.4×105、1∶3.2×105、1∶4.8×105和1∶2.0×104;亲和常数分别为8.82×108、4.93×108、1.56×108、5.12×108、1.41×108mol/L和2.30×107mol/L;Dot-ELISA方法检测14-3-3蛋白的灵敏度分别为1、10、100、10、10 ng和100 ng。免疫印迹试验结果表明,6株单克隆抗体均可与体外重组表达纯化的日本血吸虫14-3-3蛋白特异性结合,同时也能与日本血吸虫可溶性虫卵抗原、成虫排泄分泌抗原和成虫抗原中的天然14-3-3蛋白特异性反应,而与大肠埃希菌和华支睾吸虫抗原均无明显交叉反应。以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法检测日本血吸虫感染兔治疗前、后不同时间点血清,发现随着感染时间的延长,兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐增加,吡喹酮治疗后兔血清中14-3-3蛋白含量逐渐降低。采用此Dot-ELISA方法检测42份血吸虫感染兔血清,41份阳性,敏感性为97.6%;10份健康兔血清均为阴性,特异性为100%。结论 6株单克隆抗体均能有效识别天然的日本血吸虫信号蛋白14-3-3,初步证明以单抗3F1和5D1为检测抗体建立的Dot-ELISA方法具有一定的日本血吸虫活动性感染诊断及潜在的疗效考核价值。     

日本血吸虫大陆株14-3-3信号转导蛋白epsilon 亚型基因的表达及鉴定

目的　构建日本血吸虫大陆株 14 3 3信号转导蛋白epsilon亚型基因真核表达重组质粒pBK Sj14 3 3 ,并进一步在大肠杆菌中表达和鉴定 ,为其进一步保护性免疫的研究提供条件。　方法　根据日本血吸虫 14 3 3蛋白的核苷酸序列 ,设计合成 1对引物 ,以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板 ,用RT PCR法合成日本血吸虫大陆株 14 3 3蛋白epsilon亚型基因cDNA片段。将其克隆入pGEM T载体 ,经双酶切及PCR鉴定后 ,再亚克隆入 pBK CMV真核表达质粒 ,构建重组质粒pBK Sj14 3 3 ,转染到大肠杆菌BL2 1,双酶切鉴定后 ,通过IPTG的诱导在大肠杆菌BL2 1中进行表达及Western blot鉴定。　结果　RT PCR产物、pGEM T Sj14 3 3及pBK Sj14 3 3分别经双酶切均获得一特异性基因片段 ,其表达产物经SDS PAGE及Western blot鉴定后其分子质量为 3 2ku ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。　结论真核表达重组质粒 pBK Sj14 3 3在大肠杆菌中的表达产物是一分子质量为 3 2ku融合蛋白 ,并能被抗 14 3 3多克隆抗体识别。     

细粒棘球蚴重组14-3-3基因的表达、纯化及免疫学鉴定

目的 构建细粒棘球蚴14-3—3基因的重组质粒并原核表达、纯化该重组蛋白，对其免疫学特性进行初步鉴定。方法 从重组质粒pGEM—T／Eg14-3—3中获取14—3—3基因，亚克隆于表达载体pET28a构建基因丁程菌株，并表达、纯化重组蛋白，经Westernblot、ELISA对该蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果 成功构建含目的片段14—33的基因工程菌株；ELISA检测显示，用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠，诱导产生了特异性抗体，Westernblot鉴定该抗体能识别重组抗原及原头蚴、囊液、囊壁抗原。结论构建的pET28a／Eg14—3—3菌株能高效表达14—3—3蛋白，初步鉴定该重组蛋白具有较好的抗原性和免疫原性。     

猪带绦虫Ts14-3-3.6蛋白多克隆抗体制备及在不同发育阶段的表达

目的制备猪带绦虫Ts14-3-3.6蛋白多克隆抗体,并检测Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫及囊尾蚴阶段的表达情况。方法合成Ts14-3-3.6基因全长,然后克隆至pCznI原核表达质粒,转化至大肠埃希菌Arctic Express中并诱导表达,采用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行分析,通过Ni柱亲和纯化获得Ts14-3-3.6重组蛋白。将该重组蛋白免疫新西兰兔,制备抗Ts14-3-3.6多克隆抗体,以此为一抗采用Western blot检测Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段的表达。结果 pCznI-Ts14-3-3.6重组表达质粒构建成功,诱导表达的Ts14-3-3.6重组蛋白存在于包涵体中,相对分子质量约29.43×10~3。Western blot检测纯化带有His标签的Ts14-3-3.6重组蛋白能被His标签抗体识别;用该蛋白免疫新西兰兔获得效价为1∶512 000的多克隆抗体;分别以提取的猪带绦虫成虫和囊尾蚴总蛋白为抗原进行Western blot,均出现与Ts14-3-3.6多克隆抗体、囊虫病人血清及囊虫病猪血清反应条带,即均有该蛋白的表达。结论成功制备猪带绦虫Ts14-3-3.6重组蛋白并获得较高纯度的特异性高效价多克隆抗体。Ts14-3-3.6蛋白在猪带绦虫成虫和囊尾蚴阶段均有表达。     

丁苯酞对脑缺血再灌注大鼠脑红蛋白和14-3-3γ蛋白的影响

目的探讨丁苯酞对脑缺血再灌注大鼠脑组织和血清脑红蛋白(Ngb)和14-3-3γ蛋白水平的影响。方法将30只雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组和丁苯酞组,建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型;24 h后采集大脑和血清,苏木素-伊红(HE)染色观察梗死灶周围的细胞损伤,采用免疫组化、酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测大脑和血清Ngb和14-3-3γ水平。结果 HE染色显示丁苯酞组梗死灶周围细胞损害较缺血再灌注组显著减轻,缺血再灌注组脑组织和血清14-3-3γ和Ngb表达均显著高于假手术组(P0.05),而丁苯酞组脑组织和血清14-3-3γ和Ngb水平均显著高于缺血再灌注组(P0.05)。结论丁苯酞减轻脑缺血再灌注大鼠脑梗死灶周围再灌注损害,其作用机制之一是上调脑组织和血清14-3-3γ和Ngb水平。     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的初步探讨重组信号蛋白14-3-3及14-3-3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。方法用rSj14-3-3和rSj14-3-3／SjGST免疫BALB／c小鼠，日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染，收集实验组与对照组成虫和虫卵，计算减虫率和减卵率；间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化；显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小，观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。结果上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为31．93％和34．39％；每克肝组织减卵率分别为53．24％和60．06％，每对成虫减卵率分别为33．39％和40．48％；免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性，免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组；实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降35．23％和46．13％。结论信号蛋白14-3-3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用，复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究

目的　初步探讨重组信号蛋白 14 3 3及 14 3 3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。　方法　用rSj14 3 3和rSj14 3 3 /SjGST免疫BALB/c小鼠 ,日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染 ,收集实验组与对照组成虫和虫卵 ,计算减虫率和减卵率 ;间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化 ;显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小 ,观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。　结果　上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为 3 1.93 %和 3 4.3 9% ;每克肝组织减卵率分别为 5 3 .2 4%和 60 .0 6% ,每对成虫减卵率分别为 3 3 .3 9%和 40 .48% ;免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性 ,免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组 ;实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降3 5 .2 3 %和 46.13 %。　结论　信号蛋白 14 3 3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用 ,复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。     

日本血吸虫信号蛋白14-3-3在毕赤酵母菌中的分泌表达及其抗原性分析

目的 在毕赤酵母菌（Pichia pastoris）表达系统中表达日本血吸虫信号蛋白14-3-3（Sj14-3-3），并与原核表达rSj14-3-3比较其抗原性。 方法 以重组质粒pET28a-rSj14-3-3为模板，PCR扩增Sj14-3-3基因，将特异片段连接到pMD18-T载体, DNA序列分析后，亚克隆目的片段Sj14-3-3至酵母菌分泌表达载体pPICZαB。测序正确后，重组质粒经电转化转染至毕赤酵母菌X-33菌株，经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达，取诱导上清进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 和蛋白质印迹法(Western blotting) 分析。 用间接ELISA法比较毕赤酵母菌表达的rSj14-3-3和原核表达rSj14-3-3检测血吸虫病患者血清抗体的特异性和敏感性。 结果 目的基因已在酵母菌基因组中得到整合, PCR扩增得到约1 300 bp的片段。 经甲醇诱导，Sj14-3-3表达并分泌到培养上清中。 表达产物经SDS-PAGE 测定为 Mr 35 000。Western blotting 结果显示，Mr 35 000 蛋白可被Sj14-3-3单克隆抗体识别，表明该真核表达产物具有免疫反应性。间接ELISA检测结果表明，该重组蛋白检测36份急性血吸虫病患者血清rSj14-3-3抗体，阳性率为81％。与12份华支睪吸虫感染者血清未见交叉反应, 32份健康人血清假阳性反应率为9.3％。以原核表达的rSj14-3-3为抗原，间接ELISA检测，36份急性血吸虫病患者血清的 rSj14-3-3 抗体阳性率为88.9％；与12份华支睪吸虫感染者的交叉反应率为16.7％, 32份健康人血清假阳性反应率为12.5％，其差异均无统计学意义（P＞0.05）。 结论 在毕赤酵母菌中成功表达了Sj14-3-3，培养上清中产物丰度较高，且免疫反应性良好。     

日本血吸虫14-3-3抗原编码基因的扩增和克隆

目的克隆日本血吸虫14-3-3抗原的编码基因,以研究其用于血吸虫病免疫诊断和免疫预防效果.方法以日本血吸虫成虫RAN为模板逆转录合成cDNA链,设计合成引物,用PCR法扩增14-3-3抗原基因编码序列,将其克隆入pGEM-T载体,并用双酶切和以质粒为模板的PCR进行鉴定.结果RT-PCR扩增出一条约780bp大小的特异性条带,重组质粒的双酶切和以质粒为模板的PCR均获得了一条与RT-PCR扩增出大小相同带.结论日本血吸虫14-3-3抗原重组pGEM-T克隆载体的成功构建,为进一步的研究提供了条件.     

人14-3-3γ基因转移对帕金森病大鼠多巴胺能神经元的保护作用

目的 探讨14-3-3γ转基因疗法对帕金森病模型大鼠的治疗作用及可能机制. 方法 用携带人14-3-3γ基因的重组腺病毒(Ad)感染帕金森病大鼠模型纹状体后,采用免疫组化方法检测纹状体与黑质酪氨酸羟化酶(TH)的表达、免疫印迹技术检测Caspase 3及14-3-3γ蛋白的表达、高效液相色谱法检测纹状体DA及其代谢产物DOPAC含量变化,并对PD大鼠的旋转行为进行评分. 结果 Ad/14-3-3γ注射PD大鼠纹状体后14-3-3 γmRNA及蛋白均能过表达.Ad/14-3-3γ组黑质TH免疫反应阳性的细胞数和纹状体TH免疫反应阳性的神经纤维光密度值与正常对照侧的比值(0.47±0.12和0.61±0.14)显著高于PBS组(0.16±0.13和0.25±0.12)和LacZ组(0.15±0.09和0.27±0.11)(均P＜0.01).Ad/14-3-3 γ组注射侧大鼠纹状体区DA含量与对侧比值为0.37±0.14,显著高于PBS组(0.15±0.08,P=0.006)和LacZ组(0.19±0.11,P=0.007);其代谢产物DOPAC含量与对侧比值Ad/14-3-3γ组(0.34±0.12)也高于对照组(PBS组为0.13±0.10,LacZ组为0.16±0.09,均P=0.00).Ad/14-3-3γ组注射侧纹状体中Caspase-3的表达与对侧相比显著降低.行为学评估结果显示Ad/14-3-3γ组大鼠平均旋转次数在第2次注射后的第1周、第2周和第6周均低于PBS组和LacZ组(均P＜0.01);而PBS组和LacZ组相比,两组的旋转次数在上述三个时间点均差异无统计学意义(P=0.764,0.779和0.742). 结论 14-3-3γ对PD模型大鼠的多巴胺能神经元有保护作用,是PD基因治疗中非常有前景的候选基因.     

阴道毛滴虫14-3-3基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆阴道毛滴虫14-3-3基因并进行原核表达。方法根据阴道毛滴虫14-3-3基因序列设计特异性引物,以阴道毛滴虫cDNA为模板通过PCR扩增获得目的片段,与pMD-18-T连接,构建克隆载体pMD-Tv-14-3-3,经双酶切后回收目的片段,进行测序鉴定,然后与表达载体pGEX-T连接,构建原核表达载体pGEX-T-Tv-14-3-3,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE及Western blot鉴定表达产物。结果成功构建了阴道毛滴虫14-3-3基因原核表达载体pGEX-T-Tv-14-3-3;SDS-PAGE电泳检测显示,在IPTG诱导下,阳性菌高效表达分子质量单位为27ku的蛋白质;Western blot显示表达产物可被抗阴道毛滴虫多克隆血清识别。结论成功构建了阴道毛滴虫14-3-3基因原核表达载体,并在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达。     

日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3DNA免疫保护作用的观察

目的　研究日本血吸虫 (中国大陆株 )重组信号蛋白 14 - 3- 3(rSj14 - 3- 3)DNA作为血吸虫病疫苗候选分子的潜能。方法　碱裂解法大量制备rSj14 - 3- 3和rSjGSTDNA ,将两种DNA分别免疫BALB/c小鼠进行攻击感染实验。 结果　在尾蚴攻击感染 6w后 ,剖杀小鼠计算各组的减虫率 ,rSj14 - 3- 3DNA组为 34 2 0 % ,rSj14 - 3- 3+rSjGSTDNA组为32 4 0 % ;减卵率为 (按以上组序 ) 5 0 74 %和 5 5 2 3%。结论　重组Sj14 - 3- 3DNA具有一定的抗血吸虫病潜能 ,有可能作为日本血吸虫病的候选疫苗 ,但未见Sj14 - 3- 3、SjGST两种重组DNA的协同作用。     

rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响

目的　探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法　用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果　免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论　重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。