miR-30a-5p启动子区DNA甲基化在同型半胱氨酸致肝损伤中的作用

目的:探讨微小RNA-30a-5p(miR-30a-5p)启动子区DNA甲基化在肝损伤中的作用。方法:随机选取4周龄胱硫醚β-合成酶(CBS)基因正常(CBS+/+)小鼠(n=12)及单基因敲除(CBS+/-)小鼠(n=12),均给予高蛋氨酸饮食8周。HL-7702细胞体外常规培养,分为对照(control)组、同型半胱氨酸(Hcy)组和Hcy+5-氮杂胞苷(AZC)组。全自动生化分析仪检测小鼠血清Hcy、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平;微板法测定肝细胞ALT和AST水平;小鼠肝脏石蜡切片行HE染色观察肝脏损伤情况;细胞活力染色检测肝细胞活力;RT-qPCR法检测小鼠肝脏组织和肝细胞中miR-30a-5p的表达;Pearson相关性分析肝脏miR-30a-5p表达与血清ALT和AST水平的相关性;巢式降落式甲基化特异性PCR(nMS-PCR)检测小鼠肝脏组织以及肝细胞中miR-30a-5p启动子区DNA甲基化水平的变化。结果:与CBS+/+对照组相比,CBS+/-组小鼠血清的Hcy、ALT和AST水平显著升高(P<0.05);HE染色显示肝细胞肿胀,可见核碎裂、溶解;肝脏miR-30a-5p表达明显降低(P<0.01);小鼠肝脏组织中miR-30a-5p的表达与血清ALT和AST的水平呈负相关(r2=0.4557,P=0.0003;r2=0.4626,P=0.0003);miR-30a-5p启动子区DNA的甲基化水平升高(P<0.01)。在细胞水平,与control组相比,Hcy组的ALT和AST水平升高(P<0.05,P<0.01),细胞活力显著降低,肝细胞miR-30a-5p启动子区DNA的甲基化水平升高(P<0.01),而使用AZC后miR-30a-5p启动子区DNA的甲基化水平降低(P<0.05),miR-30a-5p的表达上调(P<0.05)。结论:miR-30a-5p启动子区DNA高甲基化可能在肝损伤中发挥重要作用。     

5-Aza-CdR对人结肠癌Caco-2细胞系P16基因甲基化状态及其生物学表型的影响

目的 观察人结肠癌Caco-2细胞系P16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导高甲基化失活的P16基因重新表达的可能性及其对细胞生长的影响.方法 用不同浓度的5-Aza-CdR处理Caco-2细胞系,MSP法检测用药前后P16基因的甲基化状态,RT-PCR方法检测P16基因mRNA表达.MIT法观察细胞生长速度,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡率.结果 P16基因在人结肠癌细胞系Caco-2中启动子区呈甲基化状态,经过5-Aza-CdR处理后,P16基因启动子区呈去甲基化状态,其mRNA重新表达.CpC岛去甲基化后能明显地抑制细胞的生长,诱导细胞凋亡,影响细胞周期分布,并具有良好的量效依赖关系.结论 5-Aza-CdR能够逆转P16基因甲基化状态,调控P16基因表达并有效地抑制肠癌细胞增殖.     

miR-483-5p通过上调IGF2基因转录促进肝癌细胞生长、迁移与侵袭

目的:探讨miR-483-5p对人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因P3启动子驱动的m RNA(P3 m RNA)表达的影响及其在肝细胞癌发生发展中的作用。方法:(1)采用real-time PCR检测人肝癌细胞株Huh7、Hep3B、Bel-7402、Hep G2和SMMC-7721,人正常肝细胞株HL-7702,83例人肝细胞癌组织和配对的癌旁组织,22例正常肝组织中miR-483-5p和P3 m RNA的表达水平,并应用Pearson相关分析评估P3 m RNA与miR-483-5p表达水平之间的关系。(2)将IGF2基因P3 m RNA的5’端非翻译区(5’UTR)克隆入p GL3启动子载体,构建P3 m RNA 5’UTR野生型(p GL3-P3-5’UTR-WT)及P3 m RNA 5’UTR突变型(p GL3-P3-5’UTR-MUT)重组萤光素酶报告质粒,将其分别与miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor及scrambled control共转染He La、293T及Huh7细胞,采用双萤光素酶报告系统检测萤光素酶活性。(3)分别将miR-483-5p mimic、miR-483-5p inhibitor及scrambled control转染Huh7及Hep3B肝癌细胞,应用real-time PCR检测这2种肝癌细胞P3 m RNA表达水平的变化。(4)应用real-time PCR检测肝癌细胞Huh7及Hep3B的细胞核和细胞质中miR-483-5p的表达水平;应用核连缀实验(nuclear run-on assay)分析miR-483-5p对P3 m RNA转录的影响;应用RNA稳定性实验分析miR-483-5p对P3 m RNA稳定性影响。(5)应用体外细胞功能实验研究miR-483-5p对Huh7肝癌细胞生长、凋亡、迁移与侵袭能力的影响。结果:(1)5种肝癌细胞株miR-483-5p及P3 m RNA表达水平均明显高于正常肝细胞株HL-7702(P0.01),肝细胞癌组织中miR-483-5p及P3 m RNA表达水平均明显高于配对的癌旁组织及正常肝组织(P0.01);线性相关分析显示,在5种肝癌细胞株及肝细胞癌组织中,P3 m RNA表达水平均与miR-483-5p水平呈正相关。(2)萤光素酶实验显示,miR-483-5p与P3m RNA 5’UTR的同源位点互补结合可促进P3 m RNA的表达。(3)瞬时转染实验显示,过表达miR-483-5p呈剂量依赖性促进Hep3B和Huh7肝癌细胞P3 m RNA表达水平的增高。(4)miR-483-5p表达实验显示,成熟miR-483-5p存在于肝癌细胞Hep3B和Huh7的细胞质和细胞核中;核连缀实验显示,miR-483-5p诱导Huh7肝癌细胞核中新生P3 m RNA转录;RNA稳定性实验表明,miR-483-5p不改变Huh7肝癌细胞P3 m RNA稳定性。(5)体外细胞功能实验显示,miR-483-5p促进Huh7肝癌细胞增殖,抑制其凋亡,并增强迁移与侵袭能力。结论:miR-483-5p高表达可部分通过上调IGF2基因P3 m RNA转录促进肝癌细胞生长、迁移与侵袭,进而参与肝细胞癌发生。     

miR-1247-5p对Smad2基因的靶向调控作用

目的利用miR-1247-5p过表达模拟物mimics,研究miR-1247-5p对TGF-β信号通路中关键蛋白Smad2的靶向调控作用。方法合成模拟miR-1247-5p过表达的模拟物mimics,及抑制miR-1247-5p表达的抑制物inhibitors;同时构建与miR-1247-5p互补靶基因Smad2的3'非翻译区,将其克隆到线性化的Report荧光报告载体中。将测序鉴定阳性的report-Smad2 3'-UTR重组质粒,与miR-1247-5p的mimics/inhibitors共转染至HEK-293T细胞,通过relative luciferase activity实验验证靶向关系,并通过Western blot实验进一步检测Smad2蛋白表达水平。结果成功构建report-Smad2 3'-UTR重组质粒,Western blot实验表明转染miR-1247-5p mimics组中Smad2蛋白表达下调(P0.05);而转染miR-1247-5p inhibitors组中,Smad2蛋白表达上调(P0.05)。结论证实miR-1247-5p直接靶向TGF-β信号通路中关键蛋白Smad2的表达,在蛋白水平对其进行调控,为进一步研究miRNA在细胞通路中的调控作用提供了依据。     

5-Aza-CdR对人结肠癌Caco-2细胞系P16基因甲基化状态及其生物学表型的影响

目的 观察人结肠癌Caco-2细胞系P16基因启动子区甲基化状态,并探讨去甲基化制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)诱导高甲基化失活的P16基因重新表达的可能性及其对细胞生长的影响.方法 用不同浓度的5-Aza-CdR处理Caco-2细胞系,MSP法检测用药前后P16基因的甲基化状态,RT-PCR方法检测P...     

miR-15a-5p抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖与迁移

目的:观察高表达的miR-15a-5p对人肝细胞癌SMMC-7721细胞增殖和迁移能力的影响。方法:化学合成加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的miR-15a-5p寡聚核苷酸,并进行测序确认;利用pcDNA6.2-GW/EmGFP质粒构建miR-15a-5p真核表达载体,瞬时转染SMMC-7721细胞,实时荧光定量PCR检测miR-15a-5p的表达;CCK-8法和台盼蓝染色活细胞计数检测SMMC-7721细胞的增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力的变化。结果:设计的miR-15a-5p序列与寡核苷酸测序结果匹配达100%;真核表达质粒瞬转后人肝癌SMMC-7721细胞miR-15a-5p的表达量与对照组相比显著增加(P0.05);miR-15a-5p高表达SMMC-7721细胞的增殖能力与对照组相比均显著下降(P0.05);miR-15a-5p高表达组细胞迁移速度低于对照组。结论:高表达的miR-15a-5p可抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖和迁移能力。     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对胶质瘤细胞系U251凋亡的调节

目的甲基化与胶质瘤的发生和发展关系密切,本研究的目的是探讨去甲基化试剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)对胶质瘤细胞系凋亡的调节。方法将浓度分别为10μM、25μM和50μM的5-氮杂-2'-脱氧胞苷加入胶质瘤细胞系U251细胞中,应用RT-PCR法检测U251细胞系经不同浓度的5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后细胞内胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达,应用流式细胞术(AnnexinV-FITC染色)检测不同药物浓度处理组中U251细胞的凋亡率。结果 5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后,U251细胞内caspase-3的转录水平明显上调(P<0.01),具有较为明显的剂量依赖性。流式细胞术结果显示U251细胞经5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理后细胞的凋亡率显著上调,且具有剂量依赖性。结论 5-氮杂-2'-脱氧胞苷处理具有剂量依赖性上调胶质瘤细胞系U251caspase-3表达,促进细胞凋亡。     

5-aza-2dC诱导白血病细胞分化及对Annexin A1/A2表达和甲基化状态的影响

目的：观察甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2’-脱氧胞苷(5-aza-2’-deoxycitydine, 5-aza-2dC)对人急性髓系白血病细胞系HL-60细胞分化及对膜联蛋白A1/A2(Annexin A1/A2)表达和甲基化状态的影响。 方法：瑞氏染色和流式细胞术检测5-aza-2dC对HL-60细胞分化的影响；RT-PCR法检测药物处理HL-60细胞前后Annexin A1和A2基因mRNA的表达水平；甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR，MSP)检测药物处理HL-60细胞前后Annexin A1和A2基因启动子区域CpG岛的甲基化水平。 结果：5-aza-2dC处理后HL-60细胞的髓系分化抗原CD11b的表达增强，细胞向成熟分化，且在0.5 μmol/L时其促分化作用最明显；Annexin A1和A2基因在HL-60细胞中低表达，0.5 μmol/L 5-aza-2dC处理HL-60细胞72 h后，Annexin A1和A2基因mRNA表达水平明显上调，而其启动子区域CpG岛甲基化水平明显降低。结论：5-aza-2dC具有促进白血病细胞分化的作用，Annexin A1和A2基因启动子去甲基化可能与5-aza-2dC诱导白血病细胞分化有关。     

DNMT1 siRNA 稳定表达载体的构建及其沉默效率的评价

目的构建能在肝癌细胞系SMMC-7721中稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体。方法合成特异性干扰DNMT1的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)分子，并与pSUPER—GFP载体连接。脂质体转染SMMC-7721细胞，并以G418筛选稳定表达细胞系。应用逆转录-聚合酶链反应和Western印迹方法对细胞系中DNMT1的RNA表达水平和蛋白表达水平进行了分析。应用甲基化聚合酶链反应方法分析该细胞系中甲基化的基因E-钙粘着蛋白的甲基化状态。结果转染DNMT1沉默载体的SMMC-7721细胞中DNMT1的mRNA表达量为对照载体pSUPER转染SMMC-7721细胞的43％，而前者中DNMT1蛋白表达水平小于后者的10％。DNMT1的siRNA沉默效率大于90％，所构建的DNMT1的siRNA有较高的沉默效率。DNMT1的表达抑制使E-钙粘着蛋白基因启动子区出现去甲基化。结论成功构建了能稳定表达的高效率DNMT1的RNA干扰载体，但目的基因沉默后其RNA表达水平与蛋白质表达水平表现不一致，评价siRNA干扰作用时应以目的基因相应蛋白质的表达水平为准。     

5-氮杂胞苷对结肠癌细胞CHD5基因表达及细胞增殖活性的影响

目的研究甲基化转移酶抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-氮杂胞苷,AZA)对人肿瘤相关基因CHD5(染色质解旋酶DNA结合蛋白5)在结肠癌细胞中的基因转录的诱导作用以及其对细胞增殖的影响。方法 5μmol/L 5-氮杂胞苷分别作用于Lovo和SW480细胞,连续作用72 h后,用荧光定量PCR(qPCR)检测两种结肠癌细胞系中CHD5mRNA的表达,重亚硫酸盐测序(BSP)法分析启动子区的甲基化状况,MTT法分析5-氮杂胞苷对Lovo和SW480细胞增殖的影响。结果 5μmol/L 5-氮杂胞苷处理Lovo和SW480细胞72 h后,Lovo和SW480细胞中CHD5基因的发生了去甲基化,其mRNA重新表达,细胞生长受到抑制。结论 5-氮杂胞苷能够反转CHD5基因的甲基化状态,调控CHD5 mRNA表达,并能有效地抑制结肠癌细胞的增殖。     

用单抗5C5和5C5—G1筛选的613bp cDNA的核苷酸序列分析

用识别人活化Ｂ细胞分化抗原５Ｃ５的单克隆抗体５Ｃ５和５Ｃ５－Ｇ１的混合物从人扁桃体细胞λｇｔ１１ ｃＤＮＡ文库筛选到３个阳性克隆。其ｃＤＮＡ插入到质粒ｐＵＣ１８，经双链双脱氧测序法作核苷酸序列分析，知其中一个ｃＤＮＡ长６１３ｂｐ，另二个长４６７ｂｐ，后者与前者的前４６７ｂｐ完全重叠。６１３ｂｐ ｃＤＮＡ中有一个开放阅读框架，从１０３ｂｐ到４２９ｂｐ，共３２７ｂｐ。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析显示，此６     

Cross-region reduction in 5-hydroxymethylcytosine in Alzheimer's disease brain

Epigenetic processes play a key role in the central nervous system and altered levels of 5-methylcytosine have been associated with a number of neurologic phenotypes, including Alzheimer's disease (AD). Recently, 3 additional cytosine modifications have been identified (5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine, and 5-carboxylcytosine), which are thought to be intermediate steps in the demethylation of 5-methylcytosine to unmodified cytosine. Little is known about the frequency of these modifications in the human brain during health or disease. In this study, we used immunofluorescence to confirm the presence of each modification in human brain and investigate their cross-tissue abundance in AD patients and elderly control samples. We identify a significant AD-associated decrease in global 5-hydroxymethylcytosine in entorhinal cortex and cerebellum, and differences in 5-formylcytosine levels between brain regions. Our study further implicates a role for epigenetic alterations in AD.     

人分化抗原5C5在原核细胞的表达

为了确证5C5cDNA是全长cDNA并制备抗5C5分化抗原不同表位的功能性单抗,进而研究5C5分化抗原的结构与功能,用Northern-blot检测5C5mRNA在人各种组织的表达,并构建了重组表达质粒pGEX-5X-3-5C5全长和pGEX-5X-3-5C5 N端与pGEX-5X-3-5C5 C端。结果表明：所有检测的组织中均只有一个5C5 mRNA转录本,其大小与5C5 cDNA长度一致,表明所分离到的908bp 5C5cDNA是个全长cDNA。重组表达质粒pGEX-5X-3-5C5 N端与pGEX-5X-3-5C5 C端在大肠杆菌DH5α表达出了可溶性融合蛋白GST-5C5 N端与GST-5C5 C端,分子量各为36kD和35kD。     

5-Hydroxytryptamine (5-HT)-dependent myoclonus in guinea pigs is induced through brainstem 5-HT-1 receptors

The brainstems of 3 cats were transected at the ponto-medullary junction and the cats maintained in stable condition for periods of from 16 to 31 days. After transection, all of these cats had periods in which forebrain sensorimotor cortex, olfactory bulb, hippocampus, eye movement and lateral geniculate recordings exhibited the pattern of activity seen only in REM sleep in the intact cat. We conclude that medullary regions are not required to generate these signs of REM sleep. The pons is necessary for REM sleep and is sufficient to produce REM sleep signs in rostral as well as caudal brain regions. However, the medulla may contribute to regulation of the duration and periodicity of REM sleep.     

5-Hydroxytryptophan (5-HTP)-immunoreactive neurons in the rat brain tissue

We demonstrated the presence of 5-hydroxytryptophan (5-HTP), the immediate precursor of serotonin (5-HT), in the rat brain tissue using a glutaraldehyde-coupled immunohistochemical technique. The immunoreactivity of 5-HTP was intensified in the colchicine-pretreated rat. The distribution of labelled cells was the same as for 5-HT-immunoreactive cells, but they were fewer in number.     

新的识别人活化B细胞分化抗原5C5单克隆抗体（5C5－G＿1）的制备和鉴定

新制备的抗人活化Ｂ细胞分化抗原５Ｃ５单克隆抗体５Ｃ５－Ｇ＿１经Ｗｅｓｔｅｒ印迹分析表明，该分化抗原经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（还原条件下）显示五条带，分子量分别为９２ｋＤ、５２ｋＤ±（两条）、４０ｋＤ和２０ｋＤ。用单抗５Ｃ５和单抗５Ｃ５－Ｇ＿１的混合物，从３Ｄ５细胞的λｇｔｌｌｃＤＮＡ文库中筛选到７个阳性ｃＤＮＡ克隆。     

Partial trisomy 5q and partial monosomy 5q within the same family

The observation of partial trisomy for 5q31-5qter and partial monosomy for the same segment in two offspring within the same family is presented. Their normal mother was a balanced carrier of a reciprocal translocation 46,XX,t(5;10) (q31.3;q26). The trisomic female had craniofacial dysplasia, a short neck, clinodactyly of the 5th fingers, a small umbilical hernia, arhinencephalia, cerebellar hypoplasia, atrial septal defect, an accessory spleen, bifid uterus and vagina, hypoplastic ovaries. Potter syndrome with cystic dysplasia of the left kidney and agenesis of the right, urethral atresia, uterus unicornus with utero-urethral fistula, true hermaphroditism with two ovaries and one testicle were found in her stillborn sister. Analysis of the manifestations of monosomy 5q and trisomy 5q in the same family supports a well known fact that the effects of deletions are more pronounced than those of duplications for the same segments.     

分化抗原5C5在人免疫细胞的表达

目的　明确 5C5蛋白为分化抗原 ,检测其在人免疫细胞的表达 ,以及它的信号传导作用。方法　用 5C5蛋白免疫小鼠 ,制备抗 5C5蛋白的单抗。用反义技术制备 5C5蛋白表达抑制的 3D5细胞。用免疫荧光染色和Western印迹确定 5C5单抗的特异性。用胞膜蛋白免疫沉淀和流式细胞术确定其分化抗原的性质。用双色免疫荧光染色流式细胞术检测 5C5分化抗原在多种人免疫细胞的表达。用Fura 3 AM试剂作探针 ,用激光共聚焦显微镜观察胞内Ca2 + 浓度的变化。结果　制备了抗 5C5蛋白的特异性单抗。用 5C5单抗作探针 ,从 3D5细胞膜免疫沉淀到 1条相对分子质量 (Mr)为 19× 10 3的蛋白带 ,并在活 3D5细胞见阳性免疫荧光染色。 5C5分化抗原在人周围血CD19+ 、CD14 + 、CD4 + 、CD8+ 和CD5 6 + 细胞的表达率分别为 (33.4 7± 7.9) %、(86 .13± 6 .7) %、(15 .79± 7.1) %、(18.11±12 .77) %和 (11.76± 7.4 7) % ,在人免疫细胞株的表达率分别为 5 8.0 % (Nalm6 )、72 .7% (3D5 )、5 3.6 %(BJAB)、6 1.0 % (Daudi)、6 .9% (SKW6 )、6 .3% (Jurkat)、5 .8% (Peer)、2 1.3% (K5 6 2 )和 39.1% (U937)。3D5细胞在 5C5单抗刺激下 ,胞内Ca2 + 浓度逐渐增高 ,可达 2倍左右 ,对照小鼠Ig则无此作用。结论5C5蛋白为一个分化抗原 ,在人周