问号钩端螺旋体T和B细胞表位联合基因的原核表达及其产物免疫性分析

目的 构建问号钩端螺旋体(简称钩体)LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T-和B-细胞联合表位融合基因及其原核表达系统,并对表达产物的免疫原性进行鉴定.方法 人工合成多表位联合基因并构建其原核表达系统.采用SDS-PAGE检测重组蛋白;采用MAT检测重组蛋白兔抗血清与我国钩体标准参考株的凝集效价;Western blot和ELISA检测重组蛋白的免疫原性.结果 获得了多表位融合基因并构建了原核表达系统.表达产物的相对分子质量约为23×103,且主要以可溶性形式存在;重组蛋白兔抗血清免疫双扩散效价为1∶8,该抗血清能与我国15群的钩体标准参考株发生凝集反应,ELISA证明该重组蛋白能检测不同群型钩体感染患者血清中的抗钩体抗体.结论 成功构建了包含钩体LipL32、OmpL1和LipL21蛋白的优势T和B细胞联合表位基因及其原核表达系统,表达产物具有良好的抗原性和交叉免疫反应性,可作为研制通用型问号钩体基因工程疫苗及血清学检测的抗原.     

我国主要问号钩端螺旋体血清群lipL21基因序列及其产物免疫反应性分析

目的 分析我国15群15型问号钩端螺旋体（简称钩体）参考标准株外膜脂蛋白lipL21基因序列，构建该基因原核表达系统并鉴定表达产物的免疫原性，了解lipL21基因自然表达状况。方法 高保真PCR扩增上述问号钩体株及双曲钩体Paloc型PalocⅠ株基因组DNA中全长lipL21基因片段，T-A克隆后测序并构建其原核表达系统。分别用钩体TR/PatocⅠ和rLipL21兔抗血清为一抗的Western blot鉴定目的重组蛋白rLipL21的免疫原性，显微镜凝集试验（MAT）检测rLipL21兔抗血清的交叉凝集效价。以盐变-去垢剂处理法提取钩体外膜蛋白，用SDS-PAGE和免疫印迹法检测上述钩体株lipL21基因自然表达情况。结果 上述钩体株均存在序列高度保守的lipL21基因，其核苷酸和氨基酸序列相似性分别为98．75％～99．82％和99．46％～100％。rLipL21能与TR/PatocⅠ及rLipL21兔抗血清发生结合反应。rLipL21免疫家兔能产生抗体，该抗体对上述15株问号钩体MAT效价为1：16～1：128。问号钩体外膜标本中均可检出LipL21，双曲钩体则否。结论 我国钩体群参考标准株均含有序列保守的lipL21基因并自然表达于外膜，双曲钩体PatocⅠ株虽含有lipL21基因但未表达。rLipL21具有良好的抗原性和免疫反应性，有可能作为新型钩体疫苗或检测试剂盒的候选属特异性表面抗原之一。     

问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21抗原表位预测及鉴定

目的 筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21有效T和B细胞联合抗原表位,为研制多抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP)疫苗提供基础.方法 采用生物信息学方法预测OmpL1和LipL21分子中T和B细胞联合抗原表位.采用PCR扩增候选联合抗原表位片段并分别构建其噬菌体展示系统.分别以rOmpL1或rLipL21、黄疸出血群赖株、钩体患者抗血清为一抗,采用Western blot检测各抗血清与目的表位的免疫反应性及其强度.结果 通过抗原表位预测,选择了高分值的4个OmpLl和2个LipL21联合表位.经扩增获得了预期的各抗原表位片段,各目的表位序列均准确插入噬菌体PⅢ蛋白N端并有效表达.各抗血清均能识别上述6个联合表位.其中LipL21的97～112和176-184表位对任一抗血清均显示相似强度的杂交条带.综合4个OmpL1表位对3种抗血清的不同Western blot结果及其实际意义,杂交信号从强到弱依次为173～191、87～98、297～320和59～78表位.结论 所研究的6个联合表位均分别为LipL21和OmpL1的有效抗原表位,其中LipL21的97～112、176～184和OmpL1的87～98、173～191表位可应用于钩体MAP疫苗研制.     

钩端螺旋体属特异性外膜蛋白抗原的分析

致病性问号钩端螺旋体(简称钩体)血清群众多,各群间交叉保护作用较弱或无,目前国内外均采用当地流行的钩体血清群来制备多价钩体疫苗,但对疫苗中未包含钩体血清群感染的保护作用极其有限,易造成钩体病的暴发流行。已知80℃灭活、生理盐水回收的腐生性双曲钩体PatocⅠ株全细胞抗原(TR PatocⅠ)能与所有钩体病人血清发生凝集反应,但其抗血清能否凝集不同血清群的问号钩端螺旋体尚不清楚。本研究中,我们采用TR PatocⅠ免疫的兔抗血清与我国15群17型问号钩体参考标准株、2群2型双曲钩体国际标准株进行了显微镜凝集试验(MAT) ,发现该抗血清能…     

丙型肝炎病毒多表位抗原重组体免疫原性分析

目的：研究丙型肝炎病毒(HCV)多表位抗原重组体在大肠杆菌中的非融合表达及其免疫原性分析。方法：利用DNA重组技术将构建的HCV多表位抗原重组体克隆入原核表达载体pBV220并在BL-21中表达，非融合表达蛋白经SDS-PAGE检测，排阻层析纯化，利用ELISA和免疫印迹分析其抗原反应性。免疫昆明鼠和猕猴，并检测其抗体和特异性CTL(Cyto-toxic T lymphocyte)，在抗体转阴后再次用HCV病人血清攻击以检测其免疫应答能力。结果：HCV多表位重组体在pBV220／BL-21中表达量占菌体总蛋白量的15％。Western-blot和ELISA分析表明HCV多表位抗原能与HCV病人血清特异性结合，抗体水平和特异性CTL检测结果显示该抗原肽能诱导小鼠和猕猴产生较好的抗体水平和特异性CTL效应。用病人血清再次攻击后受试动物的抗体迅速阳转。结论：表达的多表位重组体具有特异的抗原反应性和免疫原性。     

问号钩端螺旋体ompA基因分析及其重组表达产物的免疫学鉴定

目的 了解我国15群15株问号钩端螺旋体(简称问号钩体)参考标准株携带ompA基因情况,重组表达OmpA(rOmpA)并鉴定rOmpA的免疫原性和免疫保护性.方法 采用酚-氯仿法提取问号钩体基因组DNA,PCR扩增全长ompA基因,T-A克隆后测序.构建问号钩体黄疸出血群赖型56601株ompA基因的原核表达系统,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝胶}冬{像分析系统检测rOmpA表达情况及其产鼍.rOmpA免疫家兔以获得抗血清,采用免疫扩散试验检测抗血清效价.采用Western blot检测rOmpA与其抗血清和问号钩体56601株全菌抗血清的免疫反应性,显微镜凝集试验(MAT)检测rOmpA抗血清对15株问号钩体的交叉凝集情况.分别采用问号钩体黏附J774A.1细胞模型和豚鼠感染模型,了解rOmpA兔抗血清黏附阻断及rOmpA免疫保护作用.结果 15株问号钩体均含有序列保守的ompA基因,双曲钩体Patocl株则否.rOmpA表达量约占细菌总蛋白的20%.rOmpA能诱导家兔产生抗体,其抗血清免疫扩散效价为1:4.兔抗血清及问号钩体56601株全菌抗血清均能与rOmpA产生阳性Western blot信号.rOmpA抗血清对15株问号钩体的MAT效价为1:20～1:320.1:10～1:160稀释的rOmpA抗血清均能阻断问号钩体黏附J774A.1细胞,100μg和200μg rOmpA对豚鼠的免疫保护率分别为50.0%和75.0%.结论 ompA基因仅存在于不同血清群致病性问号钩体基因组中.rOmpA具有较好的抗原性,多种免疫学方法 检测显示,有可能作为通用型问号钩体基因上程疫苗的候选抗原.     

问号钩端螺旋体铁离子调节蛋白A的免疫原性及保守性研究

目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体（L．interrogans，简称钩体）黄疸出血群赖型赖株中铁离子调节蛋白A（IRPA），研究IRPA的免疫原性和在不同钩体菌种中的保守性，探讨其在致病和疫苗研究中的意义。方法生物信息学软件分析预测IRPA的特征。构建原核表达质粒pQE31-IRPA，经IPTC诱导后用SDS-PAGE及Western blot鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB／c小鼠，Western blot检测其免疫原性和在不同血清型钩体中的保守性。ELISA和Western blot检测钩体全菌兔抗血清中的IRPA抗体。结果生物信息学预测结果显示，IRPA是可能位于外膜的脂蛋白，在钩体内有多个蛋白可能与之相互作用。成功克隆表达了重组质粒pQE31-IRPA，重组蛋白能刺激BALB／c小鼠产生抗体（效价为1：32000），并能与相应抗体反应，具有良好的免疫原性。在15株不同血清型的问号钩体及1株双曲钩体（L．biflex）中均可检测到重组蛋白的表达，并在钩体全菌兔抗血清中检测到其抗体。结论IRPA具有良好的免疫原性和保守性，为进一步研究其在钩体病中的作用机制及其作为候选基因疫苗的研究奠定了基础。     

B族链球菌C5a肽酶蛋白表位的克隆、表达和免疫学分析

目的应用生物信息学方法预测B族链球菌C5a肽酶蛋白表位，结合基因工程手段进行表位重组、表达和免疫原性分析。方法用预测程序ProPred和ANTIGENIC预测B族链球菌C5a肽酶蛋白的表位，应用PCR技术扩增出编码该表位基因片段，克隆PCR产物构建重组质粒，测序验证。在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达融合蛋白。表达的蛋白经质谱分析和Western blot鉴定。纯化该融合蛋白并免疫C57／BL小鼠，萃取GBS表面蛋白，双向琼脂扩散试验检测抗体水平。结果在SCPB中预测到1个既具有MHC结合肽特性又具有B细胞表位特征的肽段。重组和表达了这一肽段，质谱得出与SCPB蛋白的相似性分数为79，Western-blot证实能与抗SCPB的抗体反应，纯化后融合蛋白纯度〉90％。动物实验证实融合蛋白能产生特异性的抗GBS抗体。结论重组表位具有一定免疫原性。为相关蛋白的毒力机制研究和亚单位疫苗等方面的研究打下了良好的基础。     

问号钩端螺旋体血清群LipL32基因型分析及其重组蛋白的免疫学鉴定

目的　探讨 15群 15型问号钩端螺旋体 (简称钩体 )中国参考标准株及 2群 2型双曲钩体国际参考标准株是否均存在主要外膜蛋白 (MOMP)基因 (LipL32 ) ,克隆并构建该基因的原核表达系统 ,鉴定表达产物的免疫性。方法　常规酚 氯仿法提取上述钩体株基因组DNA ,高保真PCR扩增全长LipL32基因片段 ,T A克隆后测定核苷酸序列并构建表达系统 ,不同浓度IPTG诱导后用SDS PAGE检测rMOMP表达情况。分别用兔抗TR patocⅠ钩体全菌抗血清、rMOMPs免疫兔血清的Westernblot鉴定其免疫反应性和免疫原性 ,显微镜凝集试验 (MAT)检测rMOMPs免疫兔血清的交叉凝集效价 ,钩体细胞黏附模型检测抗体阻断效果。结果　上述 17株钩体均有LipL32基因 ,但可分LipL32 1和LipL32 2两种基因型。 13个LipL32 1和 4个Li pL32 2基因型之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 95 .12 %～ 96 .6 0 %和 97.79%～ 98.16 %。IPTG诱导后rMOMP1和rMOMP2表达量分别占细菌总蛋白的 4 0 %和 10 %。rMOMP1和rMOMP2均能与兔抗钩体TR patocⅠ血清发生结合反应 ,免疫家兔可对上述 17株钩体产生 1∶2～ 1∶6 4MAT效价的凝集抗体。 1∶2～ 1∶16稀释的兔抗rMOMP1和rMOMP2血清均能有效地阻断钩体的黏附。结论　所有检测的钩体具有LipL32 1或LipL32 2基因。所     

人类肝素酶B细胞表位的预测和免疫原性鉴定

目的 预测并鉴定肝素酶(heparanase)蛋白B细胞表位免疫原性.方法 以肝素酶蛋白的氨基酸序列为基础,采用DNAStar分析软件以及Bcepred在线二级结构分析工具分析其蛋白二级结构并预测B细胞表位.根据预测结果 ,采用8分支多抗原肽结构合成针对该表位的抗原肽,将后者与通用型T辅助表位人IL-1β线性短肽(VQGEESNDK,氨基酸163～171)联合免疫日本白毛黑眼兔,检测免疫血清效价,鉴定其特异性和免疫原性.结果 软件预测显示,肝素酶蛋白大亚基的第1～15位(MAP1)、第279～293位(MAP2)及175～189位(MAP3)氨基酸序列最可能为其优势B细胞表位.间接酶联免疫吸附试验、免疫印迹及免疫组化分析,证实MAP1、MAP2及MAP3均能诱导机体产生高滴度抗体,但仅MAP1、MAP2抗体具有高特异性,MAP2抗体与肝癌组织的结合力最强.结论 肝素酶大亚基的第1～15位、第279～293位氨基酸为其优势B细胞表位,其中第279～293位氨基酸的免疫原性最强,这为肝素酶多肽抗体及B细胞优势短肽疫苗研制提供了理论依据.     

甲壳类动物4种过敏原的序列分析、抗原表位预测及三维结构建模

目的探明甲壳类动物各种过敏原之间是否存在相似性,以期深入研究甲壳类食品过敏原的构效关系。方法应用生物信息学方法,分析预测了甲壳类动物的4种过敏原—原肌球蛋白(TM)、精氨酸激酶(AK)、肌球蛋白轻链(MLC)和肌质钙结合蛋白(SCP)的二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、表面可及性、线性抗原表位和三维结构等。结果 TM为超螺旋结构,而AK、MLC和SCP均为复合蛋白,含有较多的Turn和Coil结构;TM、AK、MLC和SCP 4种过敏原的亲水性区域均在60%以上,可塑性区域约为50%,抗原性区域均在60%以上。TM、AK、MLC和SCP分别有11、10、4和4个线性抗原表位。TM、AK、MLC和SCP的三维结构建模结果与相应的二级结构预测结果一致,基本能够反映此4种过敏原的空间构象。结论通过生物信息学方法分析,同时获得了甲壳类动物4种过敏原TM、AK、MLC和SCP的分子特征、抗原表位及部分三维结构,可望为进一步采用实验方法研究其构效关系奠定理论基础。     

人重组白细胞介素-13在毕氏酵母中的表达及其体外诱导DC分化作用的研究

目的：在毕氏酵母中表达重组人IL-13并探讨其对DC的诱导作用。方法：用基因工程的方法人工合成IL-13的全长片段，并转化至毕氏酵母菌株GS115中，筛选后获得表达量相对较高且分泌稳定的rhIL-l3基因工程菌株，用rhIL-l3来替代IL-4体外诱导DC。结果：得到表达量达25mg/L且分泌稳定的rhIL-l3基因工程菌株；rhIL-l3具有rhIL-4同样的体外诱导外周血单核细胞向比增殖分化的作用,MHCII、CDlα、CD80、CD80、CD86等DC表型分析和混合淋巴细胞反应刺激T细胞增殖的作用与IL-4诱导得到的成熟DC并无显著差别，其所诱导的末成熟DC具有很强的摄取抗原能力。结论：获得表达量相对较高且分泌稳定的rhIL-l3基因工程菌株，rhIL-l3在体外可有效地诱导外周血单核细胞向DC分化。     

Intracellular processing and presentation of T cell epitopes,expressed by recombinant Escherichia coli and Salmonella typhimurium,to human T cells

Vaccines based on recombinant attenuated bacteria represent a potentially safe and effective immunization strategy. A carrier system was developed to analyze in vitro whether foreign T cell epitopes, inserted in the outer membrane protein PhoE of Escherichia coli and expressed by recombinant bacteria, are efficiently processed and presented via human leukocyte antigen (HLA) class I and II molecules by bacterial infected human macrophages. A well-defined HLA-B27-restricted cytotoxic T cell (CTL) epitope and an HLA-DR53 restricted T helper (T_h) epitope of the fusion protein of measles virus were genetically inserted in a surface-exposed region of PhoE, and the chimeric proteins were expressed in E. coli and Salmonella typhimurium. Macrophages infected with both recombinant bacteria presented the T_h epitope to the specific CD4⁺ T cell clone, but failed to present the CTL epitope to the specific CD8⁺ T cell clone. Presentation of the T_h epitope by the infected macrophages was inhibited by cytochalasin D, indicating that phagocytic processing of intact bacteria within infected macrophages was essential for antigen presentation via HLA class II. Presentation of the T_h epitope to the CD4⁺ T cell clone by infected macrophages was blocked by brefeldin A and cycloheximide, indicating the requirement of nascent HLA class II molecules for presentation. The efficiency of macrophages to process and present the inserted T_h epitope was similar for both the recombinant E. coli and S. typhimurium strains.     

重组人IL-11的原核表达、纯化和鉴定

以本实验室构建的pET24a-hrIL-11表达载体为模板,PCR扩增重组人白细胞介素11(hrIL-11)的基因,克隆入pET21a表达载体,转化BL-21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生hrIL-11/His融合蛋白,并经Western blot实验确认。原核表达的hrIL-11/His融合蛋白经变性后,利用亲和层析纯化,目的蛋白纯度达95%以上。纯化后蛋白经尿素梯度复性后,比活达到1×106 IU/mg。研究结果为进一步研究该蛋白在促进血小板增殖等方面的作用奠定了基础。     

重组人卵透明带蛋白3的制备及其免疫学活性分析

目的:纯化制备rhuZP3,并分析其免疫学活性.方法:在含重组质粒pGEX4T-1/ huZP3 的大肠杆菌 BL21中,经IPTG诱导表达出GST-融合蛋白,蛋白经过一系列的纯化,然后SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度.rhuZP3免疫小鼠,ELISA法检测抗血清对rhZP3的抗体反应.结果:表达出了可溶性融合蛋白,纯化后的rhuZP3纯度达95%.而且它在ELISA 鉴定实验中能被抗rhuZP3抗体识别.结论:通过原核表达系统制备的rhuZP3及其抗体具有免疫学活性.     

破伤风毒素C片段的基因克隆、表达、纯化及免疫原性分析

目的　对破伤风毒素C片段进行基因克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性分析。方法　应用PCR技术直接从破伤风梭状芽孢杆菌的质粒DNA中扩增出 1370bp的破伤风毒素C片段(简称TTC)基因 ,将此基因片段插入到表达载体pET 2 2b( )中 ,并在大肠杆菌BL2 1(DE3)中表达。用阴离子交换层析和金属离子螯合亲和层析方法进行蛋白纯化后 ,参照《中国生物制品规程 2 0 0 0年版》的免疫攻击实验方法测定其效价。结果　经SDS PAGE分析 ,重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的15 %。免疫印迹实验证实该重组蛋白是破伤风毒素C片段抗原。纯化得到纯度为 96 .5 %的重组蛋白 ,纯化回收率达 4 0 %。免疫攻击实验测定其效价为 18.70 6IU/mg,ED50 为 2 0 μg。经加强免疫 ,1μg免疫剂量即能产生足够的抗体保护动物免受破伤风毒素的攻击。结论　所获得的重组蛋白具有良好的免疫原性 ,为开发基因工程疫苗奠定了基础     

EV71型vP1蛋白表达、纯化及免疫原性的初步评价

目的运用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达新肠道病毒EV71 vP1蛋白(EV71vP1),并对EV71 vP1蛋白的免疫原性进行初步评价。方法利用RT-PCR技术获得EV71 vP1基因,将基因序列克隆到载体pFastBac HTA,通过转座反应,与Bacmid DNA重组,重组后转染Sf9昆虫细胞。采用透射电镜观察法、SDS-PAGE、Western-blot方法对vP1蛋白进行验证,利用ELISA、微量中和抗体方法对蛋白的免疫原性进行初步评价。结果 EV71 vP1蛋白相对分子量约为33KD,表达量约10mg/L;ELISA抗体效价为1∶900;中和抗体效价1∶800。结论利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功的表达了EV71 vP1蛋白,并对其免疫原性做了初步评价,为今后EV71 vP1亚单位疫苗的研究提供参考。     

戊型肝炎病毒Ⅳ型的ORF3及ORF2蛋白的分片段表达、纯化及抗原性分析

目的：对戊型肝炎病毒（HEV）Ⅳ型ORF3的全长基因片段和4个覆盖全长ORF2的互相重叠的基因片段进行了表达，对表达产物进行了纯化及抗原性分析。方法：将O3、FB5、E4、F2－2和E5基因片段分别连接到融合性表达质粒pThioHis，用IPTG进行诱导表达，并用反向、分子筛、离子交换和亲和层析方法进行纯化，用纯化的蛋白分别制备检测抗HEV IgG的诊断试剂，用该试剂检测急性散发性的戊肝病人和非戊肝病人血清。结果：位于ORF2－N端的FB5蛋白在急性期的戊肝病人血清中具有最强的反应性；而且仍有部分被HEV I型或／和Ⅱ型的诊断试剂排除的急性非戊肝病人血清对HEV Ⅳ型的多肽吴阳性反应。结论：为早期诊断戊肝病毒的感染，其诊断试剂应含有HEVⅣ型的ORF2N－端的蛋白片段。