骨髓间充质干细胞实验室分离的方法

目的:探讨实验室中简单实用,准确有效的骨髓间充质干细胞的分离方法,为其组织工程的临床应用创造最佳选择。方法:选用1月龄新西兰兔,自胫骨上端抽取骨髓血,分别用Percoll分离液;全血细胞培养法;淋巴细胞分离液以及0.17mol/L氯化铵溶液分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察分离细胞的含量以及生物活性。结果:2周后Percoll分离液法细胞含量明显高于全血细胞培养法,淋巴细胞分离液未分离出骨髓间充质干细胞,0.17mol/L氯化铵溶液12次实验中仅有1次分离出少量细胞。结论:Percoll分离液和全血细胞培养法为有效的骨髓间充质干细胞分离方法。     

骨髓间充质干细胞实验室分离的方法

目的：探讨实验室中简单实用，准确有效的骨髓间充质干细胞的分离方法，为其组织工程的临床应用创造最佳选择。方法：选用1月龄新西兰兔，自胫骨上端抽取骨髓血，分别用Percoll分离液；全血细胞培养法；淋巴细胞分离液以及0．17mol／L氯化铵溶液分离培养兔骨髓间充质干细胞．观察分离细胞的含量以及生物活性。结果：2周后Percoll分离液法细胞含量明显高于全血细胞培养法．淋巴细胞分离液未分离出骨髓间充质干细胞，0．17mol/L氯化铵溶液12次实验中仪有1次分离出少量细胞。结论：Percoll分离液和全血细胞培养法为有效的骨髓间充质干细胞分离方法。     

胚胎组织抑制无关个体混合淋巴细胞反应

为探讨胎儿组织在诱导细胞免疫耐受性中的作用，用治疗性引产胎儿肝、胸腺、脾和肺，制成４种组织的细胞悬液和４种组织浸液，分别加入无关个体混合淋巴细胞培养（ＭＬＣ）体系中测定刺激指数（ＳＩ），与不加胎组织成分的对照组ＳＩ（６．９１６）相比，４种胎组织细胞悬液（０．７４１～１．１４８）和胎肝（１．１５６）、胸腺（３．４４２）和肺（２．２１４）的组织浸液均可显著性的降低ＭＬＣ的ＳＩ，脾浸液组ＳＩ（４．５１０）也有所下降，但无统计学意义。４种胎组织细胞悬液可以明显增加单种淋巴细胞培养的３Ｈ－ＴｄＲ掺入量，４种胎组织浸液对此无明显影响。实验结果表明胚胎组织能降低无关个体混合淋巴细胞反应且此作用并非由于抑制细胞生长增殖所致。     

胚胎组织浸液降低无关个体混合淋巴细胞培养中的HLA基因表达

用3—4月龄的治疗性引产胎儿的肝、胸腺制成二种组织浸液,分别加入无关个体混合淋巴细胞培养(MLC)体系中,培养120小时后掺入~3H-TdR,测CPM值,计算刺激指数(SI);用经PCR生物素掺入的HLA-Ⅰ、Ⅱ类特异性探针进行细胞原位杂交,图像扫描定量。与不含胚胎组织浸液的对照组相比,胎肝、胸腺浸液组MLC的SI明显降低,混合淋巴细胞培养的细胞HLA-Ⅰ、Ⅱ类基因mRNA表达均有显著降低,胎肝浸液作用更明显。     

浓集法检查人血中疟原虫

本文作者采用Percoll连续密度梯度离心法浓集血中疟原虫.其方法为取一份1.5M NaCl加9份Percoll即成100%Percoll混合液,密度近似1.1300g/ml.取8.5份100% Percoll液加1.5份生理盐水混合即成85%(V/V)实验溶液.用一支无菌滴管从含EDTA或肝素抗凝管内吸取1.0ml含疟原虫全血放入含有85%Percoll 9ml 聚乙烯试管内(内径16mm)使成一血液层,30000g10C离心40分钟.离心后血液被分成6层,从上而下分别为S_1(血     

胎儿胸腺发育中DNES细胞的表达及其生物学意义

目的:检测胎儿胸腺中弥散神经内分泌系统(diffuseneuroendocrinesystem,DNES)细胞的表达,初步探讨胎儿胸腺发育中DNES细胞的表达及其生物学意义。方法:18～40周胎儿胸腺组织,共15例,采用免疫组织化学SP法,检测嗜铬素A(chromograninA,CgA)和神经元特异性烯醇化酶(neuronspecificenolase,NSE)在胸腺组织中的表达。结果:CgA和NSE在18～38周胸腺中均表达,27～28周前随胎龄增加表达渐增多,之后则渐减少,39周及40周未见表达。CgA和NSE阳性细胞主要分布于胸腺髓质:髓质胸腺细胞之间的阳性细胞呈圆形或椭圆形;胸腺小体周边的阳性细胞呈圆、椭圆或梭形。NSE阳性神经纤维在髓质形成纤维网,部分绕血管走行,形成血管周围丛。结论:胎儿胸腺中存在DNES细胞,它们可能对胎儿期胸腺细胞的发育、分化及成熟起到一定的调控作用。     

昆明小鼠胰腺干细胞分离培养及特异性标志物巢蛋白的鉴定

探讨胰腺干细胞的分离、培养及其特异性标志物巢蛋白鉴定的基本技术方法。选取新生昆明种小鼠25只,分离胰腺组织,V型胶原酶消化,结合自然沉降技术形成不连续密度梯度离心。分别从磷酸盐缓冲液/1.068g/L Percoll液(第一界面)、1.068g/L Percoll液/1.096g/L Percoll液(第二界面)、1.096g/L Percoll液/1.118g/L Percoll液(第三界面)收集细胞。各界面细胞均加入含体积分数为0.1胎牛血清的DMEM低糖培养基,置于经多聚赖氨酸处理的培养瓶中常规培养。24h后将培养基更换为不含胎牛血清的DMEM低糖培养基,并加入10mg/L的角质细胞生长因子和20μg/L的碱性成纤维细胞生长因子,观察体外培养的各界面细胞的形态学特征。胰腺的内分泌部存在β细胞,双硫腙能与β细胞分泌颗粒中的锌螯合而呈现铁红色。将收集的各界面细胞进行双硫腙染色,检测细胞来源。免疫组织化学法检测各界面巢蛋白的表达。结果第一、二界面细胞65%～90%双硫腙染色呈阳性,来源于胰腺的内分泌部;第三界面细胞双硫腙染色呈阴性,来源于胰腺的外分泌部。从胰腺的内分泌部获得的细胞聚集呈胰岛样细胞团贴壁生长,48～72h后可见许多大、圆、单个核的细胞从胰岛样细胞团中向周围长出,以附壁生长的方式在局部形成细胞集落。从胰腺的外分泌部获得的细胞主要呈上皮样生长,并逐渐汇合成片,在上皮样细胞集落的周围可见大、圆、单个核的细胞生长并形成集落。各界面大、圆、单个核的细胞,巢蛋白均呈阳性表达。提示从胰腺内、外分泌部的组织中能成功获取胰腺干细胞特异性标志Nestin表达阳性的干样细胞。     

胎儿胸腺细胞悬液治疗眼病

根据胸腺细胞调节免疫功能的机理,利用胎儿胸腺细胞治疗再生障碍性贫血、肿瘤及其它一些疾病,临床长期应用无副作用,国内外已有不少报道。我们自1987年5月以来,用胎儿胸腺细胞悬液(TCS)有选择性的治疗某些眼病30例,取得了较好的疗效,现报告如下: 材料与方法一、胎儿胸腺细胞悬液的制备:采用3.5～7个月的水囊引产无畸形胎儿,无菌条件下解剖取胸腺,常规制备单细胞液,调浓度到1×10~6个/ml,冰箱4℃保存备用。存放时间不超过36小时,注射时细胞活度在70％     

用分段Percoll密度梯度法分纯人体T细胞和B细胞

作者报导了一种分离人体外周血中T细胞和B细胞的简单技术。此法是基于细胞在间断的Percoll密度梯度中有不同的移动度而进行的。Percoll是一种新的密度梯度分离液,是由聚乙烯吡咯烷酮包被的胶状硅组成(瑞典Uppsala产)。9份Percoll(比重为1130克/毫升)与1份10倍浓度的PBS混和(100%Percoll浓度),进一步以PBS(正常浓度)稀释成70%、60%、50%和40%的Per coll浓度备用。先以F-H梯度法分离得人外周血单核的细胞,使细胞在含有10%脱补体的胎牛血清的199培养液中保持一定浓度(不超过80×10~6/毫升),置于容量为12毫升的塑料试管中离心,弃去上清后,将每一种不同浓度的Percoll溶液(开始用100%,继而用70%,60%……依次递减)2毫升铺在细胞团     

单克隆抗体鉴定胸腺瘤淋巴细胞亚群

胸腺瘤系一种上皮细胞肿瘤,瘤内常伴有不同程度的淋巴细胞浸润。准确测定胸腺瘤组织中浸润淋巴细胞的数量及不同成熟期细胞亚群是评定胸腺瘤功能的客观依据。而传统的组织学方法难以达到上述目的,故应用能够衡量淋巴细胞成熟标志的OKT 系列单抗检测了16例胸腺瘤患者。按测定的淋巴细胞亚群可将胸腺瘤分为三型:(1)胸腺淋巴细胞型:本型有12例病人,淋巴细胞亚群特征为,OKT_6~+细胞占52～95%,OKT_3     

人胎儿肝脏来源C-kit^＋细胞的特征

背景:在成年动物肝脏中干细胞含量很少,且体外大量扩增并保持未分化状态的问题仍然没有很好的解决,许多科研者预测胚胎肝干细胞可能具有诱人的临床应用价值.近年来C-kit被选择作为研究肝干细胞的共同标志,并发现C-kit抗原参与肝干细胞的生长和发育.目的:对胎儿肝脏来源的C-kit+细胞进行分离培养,观察其体外生长和分化的特征.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2005-10/2008-03在南京大学医学院和国家生物医药技术重点实验室完成.材料:肝脏C-kit+细胞来源于32例流产胎儿,由南京大学医学院附属鼓楼医院提供.Percoll分离液为Pharmacia公司产品,Ficoll分离液为天津灏阳生物制品科技有限责任公司产品,表皮生长因子、肝细胞生长因子为R&D公司产品.方法:无菌状态下取出胎儿肝脏,以胶原酶消化法和机械分离法获得胎儿肝脏来源单细胞悬液,分别采用1.070g/mL Percoll分离液和1.077 g/mL Ficoll分离液进行密度梯度离心,吸取界层细胞,添加含体积分数为0.1 FBS、20 μg/L肝细胞生长因子、40 μg/L表皮,上长因子的DMEM/F12新鲜培养基诱导9 d.主要观察指标:胎儿肝脏中C-kit+细胞计数,界层细胞形态、生长特征、表型及C-kit标志的鉴定,界层细胞诱导分化结果.结果:未经分离的新鲜胎儿肝脏细胞中 C-kit+细胞所占比例仪为1.28%,使用Percoll和Ficoll分离液获取的界层细胞分布在二角形区域内的C-kit+细胞所占比例显著增加,分别为74.21%和72.15%,但绝对数量仍然有限.两种分离液获取的界层细胞在形态、生长状况方面基本相似,免疫细胞化学染色鉴定后大体可分为4类:第1类细胞为C-kit+细胞集落,第2类细胞既呈CD29+、CD90+、CD34+、C-kit(间充质干细胞表型特征),又较弱地表达细胞角蛋白 19(胆管细胞特异性标志),第3类细胞较强地表达细胞角蛋白19,不表达C-kil抗原,第4类细胞高表达CD45,微弱表达CD34、CD90、C-kit.诱导后,界层绌胞角蛋白19呈强阳性表达,不表达C-kit、白蛋白、甲胎蛋白及细胞角蛋白18.结论:胎儿肝脏中的C-kit+细胞数量很少,Percoll和Ficoll分离液均可提高C-kit+细胞的得率.胎儿肝脏中可能存在的一类间充质-胆管细胞的中间态细胞,这种细胞可能有促进C-kit+细胞生长的作用.间充质干细胞可向胆管细胞分化.     

人脐带血间充质干细胞分离培养体系的优化筛选

背景:目前所报道的脐带血间充质干细胞体外培养条件不尽相同,尚缺乏统一标准,且培养效率较低.目的:拟对人脐带血间充质干细胞的分离方法、培养条件进行优化筛选.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2007-05/2008-04在中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院中心实验室完成.材料:35份脐带血标本来源于北京协和医院妇产科顺产或剖宫产胎儿.方法:应用淋巴细胞分离液法、羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法分别从脐带血中获得单个核细胞.细胞接种后,应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12、L-DMEM和MesencultTM不同培养基,在不同体积分数胎牛血清(5%,10%,20%)、不同细胞接种密度(5×106,1×107,5×107,1×108)下进行细胞培养.细胞传至第3代诱导成骨,行Von Kossa染色.主要观察指标:不同分离方法、培养基、胎牛血清浓度、种植密度分离培养细胞的效果,脐带血间充质干细胞表面标记的表达及成骨情况.结果:与淋巴细胞分离液法比较,羟乙基淀粉沉降法、羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法获得的单个核细胞数量明显增多(P＜0.05,P＜0.01),羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法细胞原代培养时间显著短于另2种方法(P＜0.01).应用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或MesencultTM培养基,T25培养瓶中细胞接种密度为5×107时,培养效率高于其余各种条件组合(P＜0.01).贴壁细胞表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45,CD90及CD133,经成骨诱导培养21 d后Von Kossa染色可见黑色矿化结节.结论:应用羟乙基淀粉沉降与淋巴细胞分离液两步分离法可以获得较多数量的脐带血单个核细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12或Mesencult TM培养基、细胞接种密度为5×107时可以提高脐带血间充质干细胞的培养效率.     

胸腺瘤的研究进展

胸腺是由上皮和淋巴细胞组成的免疫器官 ,也是神经免疫内分泌网络中的重要组成部分。胸腺内的上皮细胞和淋巴细胞可以发生多种类型的肿瘤 ,其中胸腺瘤的发病率约占纵隔肿瘤的 15 9% 〔1〕。下面就这方面的相关研究作一回顾。1　胸腺瘤的病理组织学分类传统分类是根据细胞类型将胸腺瘤分为上皮细胞为主型、淋巴细胞为主型、混合细胞型及梭形细胞型〔2〕。 1978年Ｌｅｖｉｎｅ和Ｒｏｓａｉ提出将胸腺瘤分为良恶性。 1985年 ,Ｍ櫣ｌｌｅｒ Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ按胸腺的组织发生学提出了新的分类 (Ｍ Ｈ分类 ) :①良性 :髓质为主型、混合细胞型 …     

什么是免疫活性细胞？

答：免疫活性细胞是指接受抗原刺激后能够发生特异性免疫应答的成熟的T、B淋巴细胞。T细胞是淋巴干细胞经历了前T细胞的分化后，在胸腺内微环境和胸腺激素作用下发育成熟的淋巴细胞，故称胸腺依赖性淋巴细胞简称T细胞。B细胞是由B细胞在禽类法氏囊内或哺乳类动物骨髓中分化成熟的淋巴细胞，故称囊依赖性淋巴细胞或骨髓依赖性淋巴细胞，简称B细胞。T细胞在体内参与细胞免疫，B细胞参与体液免疫。     

上海市M-H培养基抽样调查分析

目的　对所抽查的M H培养基质量进行调查分析。方法　通过对M H培养基作一般性状(厚度、pH值)、无菌试验以及性能检测以判断其质量。结果　所抽查的4种品牌成品培养基(15个批号)的一般性状与无菌试验结果均合格;性能检测中二价阳离子浓度全部全格;有2种品牌4个批号的M H培养基胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷含量不合格。3种品牌(8个批号)的干粉自制培养基除厚度外(厚度<4mm的占18% ),pH值、无菌试验、二价阳离子浓度均合格;胸腺嘧啶或胸腺嘧啶核苷均不合格。结论　所抽的4种品牌成品培养基中只有2种M H培养基质量符合要求,市售3个品牌的水解酪蛋白干粉不适合制备M H培养基。     

人胸腺细胞:用不同种属的未致敏及致敏红细胞形成玫瑰花结能力的研究

本文研究了人胸腺细胞与不同种属未致敏及致敏红细胞形成玫瑰花结的能力.方法胸腺来源于117名非恶性肿瘤患儿.取小块胸腺组织,剪碎,放在含10%小牛血清或10%人血浆及双抗(青霉素100u/ml、链霉素50μg/ml)的RPMI1640营养液中,制成胸腺细胞悬液.用胸腺细胞和未致敏的绵羊红细胞(SRBC)离心后,在4℃孵育2～12小时形成标准Es花结(E玫瑰花结),代表总T细胞.T细胞各亚群的确定是:(1)重力     

人脐血间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的探讨来源于人脐血的间充质干细胞(MSCs)在体外分离、纯化和扩增培养的可行性和条件。方法无菌条件下收集正常足月胎儿的脐带血,经肝素抗凝,用相对密度1.077的淋巴细胞分离液分离脐血的单个核细胞,以偏酸性的M esencu ltTM作为培养基进行培养和纯化扩增,用流式细胞仪检测MSCs的表面标志。结果来源于人脐血的单个核细胞种植于特定的培养基中后,可产生贴壁细胞,主要表现为破骨样细胞和间充质样细胞,传3代后,可得纯化扩增的人脐血MSCs。6.6×105个脐血原代MSCs在体外扩增10代后,获得9.9×108个细胞。流式细胞仪检测结果显示,人脐血MSCs不表达CD34、CD11 a和CD11b,强表达CD29,弱表达CD71,与骨髓MSCs表面抗原特性一致。结论源于人脐血的MSCs在体外可以培养、扩增,可作为干细胞来源之一用于实验研究和临床。     

巨噬细胞量及功能的改变在鉴别渗出液性质中的意义

癌和结核引起的体腔积液临床上最常见。鉴别渗出液的性质采取截然不同的治疗措施极为重要。我们对比检测了癌性和结核性胸腔渗出液，对其中巨噬细胞（M）含量、M产生白细胞介素1（IL—1）的能力以及M对淋巴细胞（Lc）转化率的影响进行了比较。1资料和方法1.1材料：20例经细胞学或组织学确诊的癌性胸水。10例结核性胸水均经肝素（in／ml）抗凝后用于分离M4和LC。C57BL／6纯系小鼠，雄性，6～8周龄。取其胸腺细胞用于检测IL—1活性。1．2LC的分离：胸水细胞悬液用淋巴细胞分离液（上海试剂二厂，比重1．077）按常规法分离单个核细胞。…     

不同明胶浓度及淋巴细胞分离液对人脐血源黏附细胞原代培养的影响

本研究观察不同明胶浓度及淋巴细胞分离液对人脐血源黏附细胞原代培养的影响。采用3％及6％明胶浓度沉降脐血红细胞并观察分离效果；应用Ficoll及Percoll淋巴细胞分离液分离脐血单个核细胞，观察其对人脐血源黏附细胞48小时贴壁率、细胞开始伸展时间、细胞培养成功率的影响，倒置显微镜观察细胞形态及生长状况，用细胞化学、免疫细胞化学进行细胞鉴定。结果显示，6％明胶浓度对红细胞沉降效果明显好于3％的明胶。无论是48小时贴壁率、细胞开始伸展时间、黏附细胞集落开始形成时间、集落数达最高的时间及细胞融合时间，还是细胞培养成功率，Percoll明显优于Ficoll；两种方法分离培养的人脐血源黏附细胞的形态、细胞化学染色及免疫细胞化学染色等生物学特征无差异。结论：6％明胶联合Percoll细胞分离液是理想的人脐血源黏附细胞原代培养分离方法，本研究为人脐血源黏附细胞在临床的早日应用提供了基础信息。     

不同分离方法与培养条件下大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖情况比较

目的:应用贴壁分离法和密度梯度离心法以不同培养条件观察纯化过程中对获得的骨髓间充质干细胞的影响,试图寻找获得高质量、高活性的骨髓间充质干细胞的培养条件。方法:实验于2005-09/2006-01在解放军第四军医大学实验动物中心实验部进行。①SPF级雄性Wistar大鼠18只,贴壁分离培养取12只,根据血清和培养基的不同分为4组:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组,3只/组。密度梯度离心培养实验取剩余6只,以分离液的不同分为Ficoll分离液组、Percoll分离液组,3只/组。②骨髓取材:各组大鼠断颈处死后,无菌取双下肢,剔除股骨、胫骨周围肌肉组织,剪去骨干的两端,暴露骨髓腔,穿刺两侧骨端取出骨髓。③贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组大鼠分别采用相应的血清和培养基冲洗骨髓,制备单细胞悬液,接种于培养瓶中,5d后首次更换培养液,弃去未贴壁细胞,此后每3～4d换液1次。④密度梯度离心法:Ficoll分离液组选用的Ficoll分离液密度为1.077;Percoll分离液组将Percoll分离液与0.1mol/L磷酸盐缓冲液按9∶1比例混匀,密度为1.073。将两组大鼠骨髓置入离心管,离心弃上清,轻轻叠加到相同体积的各自对应分离液上,再次离心收集界面层白色混浊液,采用F12-DMEM培养液重悬细胞,按1×109L-1的密度接种于培养瓶中,培养条件与贴壁分离法相同。⑤指标检测:倒置显微镜下,每天观察贴壁分离、密度梯度离心不同培养条件下细胞的生长情况和活体形态特征。进行锥虫蓝排斥试验,蓝染细胞为死亡细胞,在3min内用计数板分别计数活细胞和死细胞,未被蓝染细胞所占细胞总数的百分比即为初步得到细胞活性的数据。两种分离方法均取生长良好的第3代细胞,以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。结果:18只大鼠均进入结果分析。①细胞形态观察结果:贴壁分离法:采用进口血清培养的两组细胞形态学上都表现为长梭形,细胞活性较高,且给予F12-DMEM培养基的细胞增殖较快,集落融合较早,传代所需时间短;采用国产血清培养的两组细胞中,给予F12-DMEM培养基可以获得梭形细胞,而给予DMEM培养基后则多为类圆形骨髓样细胞,仅见极少梭形细胞。密度梯度离心法:Ficoll分离液组和Percoll分离液组均可培养出梭形骨髓间充质干细胞,细胞活性均高,但集落融合、传代所需的时间均较贴壁分离法长。②细胞活性检测结果:贴壁分离法:进口血清 DMEM组、进口血清 F12-DMEM组、国产血清 DMEM组、国产血清 F12-DMEM组的活细胞率分别为98.3%,98.7%,97.1%,97.7%,组间比较差异无显著性意义(χ2=0.054～0.620,P均>0.05)。密度梯度离心法:Ficoll分离液组活细胞率与Percoll分离液组相似(96.9%,97.1%,t=1.066,P>0.05)。③第3代细胞生长曲线测定结果:不同培养条件下各组第3代细胞生长曲线基本相似,在培养1d时,细胞量稍有减少;4d后细胞数均迅速增长;8d进入平台期,细胞增殖减慢。结论:采用全骨髓贴壁分离法和密度梯度离心法,只要选择合适的培养条件均可获得骨髓间充质干细胞,但选用进口胎牛血清、F12-DMEM培养基效果较好。