不同电融合条件对小鼠卵丘细胞核移植重组胚融合和早期发育的影响

目的 研究不同电融合条件对来源于小鼠卵丘细胞核移植重组胚的融合和早期发育的影响,寻找最佳电融合参数。方法 将直径10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。在不同电融合条件下诱导两者间的融合,并对重组胚激活以及随后发育的早期阶段包括2细胞、4~8细胞和桑椹胚进行观察和计数。结果 电融合时电场强度或脉冲时间在一定范围内允许波动,变动范围分别是电场强度1000~2000kV/cm和脉冲时程40~160ms。低于容许范围的电融合参数会降低供体核-卵母细胞复合体的融合率,而高于容许范围的参数会导致供体核-卵母细胞复合体溶解乃至死亡。如果电融合参数在容许范围内,供体核-卵母细胞复合体的融合率无统计学差异,并且融合后重组胚的激活,以及发育至2细胞、4~8细胞和桑椹胚阶段的比率也无统计学差异。此外,脉冲重复次数以1~2次为佳。结论 优化的电融合参数是决定供体核-卵母细胞复合体融合与重组胚激活的关键因素。     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法，研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口，首先将第一极体挑出．再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞，去除包含有MⅡ期染色体．纺锤体复合体的最少量细胞质。随后，将直径为10～12mm的C57BL／6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下，构建供体核．卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合．并对重组胚激活。体外培养72h．对重组胚发育到2细胞、4～8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s；Hoechst 33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核；去核成功率为95．5％，注核成功率为76．7％，供体核．卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2％和62.2％；重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4-8细胞和桑椹胚期的比率分别为57．5％、39．1％和27．6％；用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物，扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段，表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法，不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核，去核成功率高，而且操作简便，去核迅速，对卵母细胞损伤小．是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

改进的核移植方法完成小鼠卵丘细胞重组胚的早期发育

目的建立一种快速、简便、有效且损伤小的核移植方法,研究来源于小鼠体细胞重组胚的早期发育。方法用尖锐的去核针在MⅡ期卵母细胞透明带上切开一个25mm左右的小口,首先将第一极体挑出,再轻轻地挤压和负压吸引卵母细胞,去除包含有MⅡ期染色体-纺锤体复合体的最少量细胞质。随后,将直径为10~12mm的C57BL/6j小鼠卵丘细胞核注射到去核卵母细胞透明带下,构建供体核-卵母细胞复合体。用电融合的方法诱导复合体融合,并对重组胚激活。体外培养72h,对重组胚发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期等各阶段进行观察和计数。结果完成一个MⅡ期卵母细胞去核的平均时间为15s;Hoechst33342染色证明可以完全去除MⅡ期卵母细胞细胞核;去核成功率为95.5%,注核成功率为76.7%,供体核-卵母细胞复合体融合和重组胚原核形成率分别为68.2%和62.2%;重组胚体外培养72h内发育到2细胞、4~8细胞和桑椹胚期的比率分别为57.5%、39.1%和27.6%;用2个微卫星位点D7Mit22和D4Mit204引物,扩增不同发育阶段重组胚的DNA片段,表明重组胚来源于供体卵丘细胞。结论应用改进的核移植方法,不仅可以有效地去除卵母细胞细胞核,去核成功率高,而且操作简便,去核迅速,对卵母细胞损伤小,是研究小鼠体细胞核移植的一种简便可行的新方法。     

核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响

目的探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响.方法采用血清饥饿法同步化处理的SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞,常规超排KM小鼠获得卵母细胞,采用盲吸法去核,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎,6-DMAP+CCB+乙醇激活重组胚, CZB培养液中培养.结果电场强度(V/cm)和脉冲(ms)为 1500/30; 1500/40; 1800/30; 1800/40时,融合率为 81.5%; 83.3%; 77.6%; 82.0%.直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为33.1%和28.9%,桑椹胚发育率为17.8%和15.5%.结论电场强度为1500～1800V/cm, 脉冲为30ms或40ms时,都能获得较高的融合率;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高,但统计学分析差异不显著.     

注核方法对大鼠-小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响

目的 :探讨胞质内直接注核法和电融合法对大鼠 -小鼠种间体细胞核移植重组胚发育的影响。方法 :采用血清饥饿法同步化处理的 SD大鼠成纤维细胞作为供体细胞 ,常规超排 KM小鼠获得卵母细胞 ,采用盲吸法去核 ,分别采用直接注核法和电融合法构建重组胚胎 ,6- DMAP+ CCB+乙醇激活重组胚 ,CZB培养液中培养。结果 :电场强度 ( V/cm)和脉冲 ( ms)为 :1 5 0 0 /30 ;1 5 0 0 /40 ;1 80 0 /30 ;1 80 0 /40时 ,融合率为 :81 .5 % ;83.3% ;77.6% ;82 .0 %。直接注核法和电融合法构建重组胚的卵裂率分别为 33.1 %和 2 8.9% ,桑椹胚发育率为 1 7.8%和 1 5 .5 %。结论 :电场强度为 1 5 0 0～ 1 80 0 V/cm,脉冲为 30 ms或 40 ms时 ,都能获得较高的融合率 ;直接注核法构建的核移植重组胚胎的卵裂率要比电融合法略高 ,但统计学分析差异不显著     

小鼠体细胞核移植技术的初步研究

目的 :建立细胞核移植技术 ,为“治疗性克隆”的实验研究和临床应用作准备。方法 :以C5 7鼠的卵丘细胞为核供体细胞 ,去核卵母细胞为核受体进行胚胎的重构。用改良的WAKAYAMA方法 ,分别进行卵丘细胞的分离、分裂中期卵母细胞的去核、供体细胞核的注射、重构胚的电融合以及卵母细胞的活化等研究。结果 :去核卵母细胞的成活率 3 8.4%。成活的小鼠胚胎发育进入二细胞期。盲吸法比半卵法和功能性吸核的效果好。电融合法能够使移植核融入卵母细胞内。结论 :小鼠体细胞核移植技术基本获得成功     

猪体细胞核移植胚的体外发育及其影响因素

以卵丘细胞为核供细胞组成重构胚 ,卵裂率达以5 6 .7% ,发育至桑椹胚达 11.7%、孵化囊胚率为 6 .7% ,显著高于成纤维细胞重构胚 (P<0 .0 5 )。作者还研究了卵母细胞的采集方法、激活程序和卵龄对卵丘细胞核移植重构胚体外发育的影响 ;以血清饥饿法将卵丘细胞诱导至 G0或 G1期 ,抽吸法 /解剖法采集卵母细胞 ,体外培养 33或 4 4 h,将卵丘细胞置于去核卵母细胞的卵周隙中 ,重构胚以钙离子载体 A2 3817或电脉冲结合6 - DMAP激活处理 ,体外培养 6 d,结果表明 ,卵母细胞采集方法、激活液中细胞松弛素 (CB)、激活程序并不影响重构胚的发育 (以…     

Bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体形态学变化

目的研究野生型和bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体显微和超微结构变化。方法用扫描电镜和光镜对诱导排卵后野生型和bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞复合体结构上的变化进行观察。结果 （1）光镜显示,野生型小鼠中,卵丘细胞紧密围绕在卵母细胞周围;bikunin基因敲除小鼠中,卵丘细胞松散地分布在卵母细胞周围。（2）电镜显示,野生型小鼠可见大量的纤维网格状结构,卵丘细胞亦可见;bikunin基因敲除小鼠中,卵丘细胞之间未见有网状结构,卵丘细胞紧密连接少。（3）bikunin基因敲除小鼠卵丘-卵母细胞数明显低于野生型。结论 bikunin基因敲除小鼠卵丘细胞之间、卵丘细胞与卵母细胞之间结构发生变化,卵丘-卵母细胞数明显下降,该现象可能与卵丘-卵母细胞复合体的功能密切相关。     

小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

【目的】观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育。【方法】昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞。成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入，观察其受精和胚胎发育情况。【结果】卵子去核存活率为75．9％(362／477)，注核存活率为39．8％(143／359)，D1存活率为38．4％(138／359)。39．9％(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核，其卵裂率为80．7％(46／57)。大部分重构胚发育到2-3细胞停滞，其中2个分裂至4细胞，无囊胚形成。【结论】将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中，可以诱导极体排出，形成2原核 1极体的重构胚胎。重构胚胎大部分发育到2-3细胞即发生停滞，最多到达4细胞期，发育潜能差。     

小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育

[目的]观察小鼠卵丘细胞核移植到体内成熟卵浆构成的重构卵的发育.[方法]昆明小鼠超排后获取体内成熟卵母细胞及卵丘细胞.成熟卵子去核后用将卵丘细胞核与精子直接注入,观察其受精和胚胎发育情况.[结果]卵子去核存活率为75.9%(362/477),注核存活率为39.8%(143/359),D1存活率为38.4%(138/359).39.9%(57/143)重构卵子成功排出一个极体并形成两原核,其卵裂率为80.7%(46/57).大部分重构胚发育到2～3细胞停滞,其中2个分裂至4细胞,无囊胚形成.[结论]将小鼠卵丘细胞核、精子同时移植到小鼠的体内成熟卵浆中,可以诱导极体排出,形成2原核 1极体的重构胚胎.重构胚胎大部分发育到2～3细胞即发生停滞,最多到达4细胞期,发育潜能差.     

透明质酸对小鼠卵丘细胞外基质的影响

目的 观察透明质酸(HA)对小鼠卵丘细胞外基质的影响。方法 取3～4周龄的雌鼠(含野生型和bikunin基因敲除小鼠)诱导排卵，取卵丘-卵母细胞复合体(COC)，镜下计数诱导排卵后卵母细胞。免疫荧光双重染色后观察HA及血清来源的HA相关蛋白(SHAP)在卵丘细胞外基质的分布。结果 SHAP-HA复合体缺失引起卵丘细胞外基质的变化，并影响到随后的排卵。结论 SHAP-HA参与卵丘细胞外基质的构建．细胞外基质的受损引起卵母细胞功能的破坏。     

小鼠卵丘-卵母细胞复合体CD44和间α胰蛋白酶抑制剂的表达

目的探讨CD44和间α胰蛋白酶抑制剂（ITI）在小鼠卵丘-卵母细胞复合体的表达及两者的相关性.方法应用激光扫描共聚焦显微镜和免疫荧光双重染色技术观察小鼠卵丘-卵母细胞复合体中CD44和ITI的分布.结果ITI在小鼠卵丘细胞外基质之间呈阳性表达,CD44存在于卵丘细胞膜表面.结论CD44和ITI的阳性表达可能在卵丘-卵母细胞复合体成熟中起重要作用.     

人卵母细胞与体细胞的电融合效率

目的 探索适合于人体细胞核移植的电融合参数,并比较不同类型和数目体细胞的电融合效率.方法 首先对体外授精(IVF)后的低评分胚胎行电融合,观察不同电融合参数下胚胎的融合及继续发育情况,确定最适电融合参数;其次将1～2 个颗粒细胞或成纤维细胞置入IVF后未受精卵子的卵周隙(PVS)中,在最适电融合参数下行电融合.结果 在两段交流脉冲间给予200 V、25μs的直流脉冲为本研究的最适电融合参数;颗粒细胞与卵母细胞的电融合效率低于成纤维细胞(P＜0.05);在PVS中加入2个颗粒细胞,其单个颗粒细胞的电融合效率高于加入1个颗粒细胞(P＜0.05),而成纤维细胞则无差异.结论 低融合效率的体细胞与卵母细胞电融合时可通过增加PVS中体细胞的数目来提高融合效率.     

人卵母细胞与体细胞的电融合效率

目的探索适合于人体细胞核移植的电融合参数,并比较不同类型和数目体细胞的电融合效率。方法首先对体外授精(IVF)后的低评分胚胎行电融合,观察不同电融合参数下胚胎的融合及继续发育情况,确定最适电融合参数;其次将1～2个颗粒细胞或成纤维细胞置入IVF后未受精卵子的卵周隙(PVS)中,在最适电融合参数下行电融合。结果在两段交流脉冲间给予200 V、25μs的直流脉冲为本研究的最适电融合参数;颗粒细胞与卵母细胞的电融合效率低于成纤维细胞(P<0.05);在PVS中加入2个颗粒细胞,其单个颗粒细胞的电融合效率高于加入1个颗粒细胞(P<0.05),而成纤维细胞则无差异。结论低融合效率的体细胞与卵母细胞电融合时可通过增加PVS中体细胞的数目来提高融合效率。     

人的重组促黄体生成素对小鼠卵母细胞体外受精的影响

目的探讨人的重组促黄体生成素(r-hLH)对性成熟前的小鼠卵母细胞体外受精(invitrofertilization,IVF)后的分裂、以及IVF胚的体外培养(invitroculture,IVC)过程中发育状况的影响.方法选用性成熟前的清洁级昆明小鼠,分别用r-hFSH(人的重组促卵泡素20IU),r-hFSH+r-hLH(各20IU)或20IUr-hLH对其进行超排处理,通过对从各处理组小鼠卵巢中手工器械分离出来的卵丘-卵母细胞复合体(cumulusenclosedoocyte,CEO)进行体外受精之后,进一步观察这些CEO经IVF后的受精分裂状况,以及IVC后的发育情况.结果r-hFSH+r-hLH处理组小鼠卵母细胞IVF率(72.2%)极显著高于r-hFSH单独处理组(39.9%)或r-hLH单独处理组(37.2%)的相应指标;r-hFSH+r-hLH处理组和r-hFSH单独处理组的IVF胚,发育至8～16细胞阶段的比例(8～16细胞率)趋于一致(25.15%∶27.18%),但是都极显著高于r-hLH处理组的8～16细胞率(17.24%);r-hFSH处理组IVF胚发育至16～32细胞阶段的总比例(16～32细胞率∶33.01%),极显著高于r-hFSH+r-hLH处理组及r-hLH单独处理组的指标(1.75%和0).结论在IVF条件下,r-hLH对小鼠卵母细胞的受精有明显的促进作用,同时却对相应IVF胚的进一步发育产生明显的抑制作用.     

ICR小鼠卵母细胞通过旁分泌机制促进排卵关键过程

目的:利用国内医学研究常用ICR品系小鼠,在构建用于研究卵母细胞-卵丘细胞交互作用培养模型的基础上,研究卵母细胞及其产生的旁分泌因子生长分化因子9(GDF9)和骨形态发生蛋白15(BMP15)对排卵过程中的关键事件——卵丘扩展的调控作用?方法:通过显微手术制备摘除卵母细胞后的卵丘细胞复合体(OOX),并通过与卵母细胞共培养或GDF9和BMP15 处理研究卵母细胞及其特异释放的旁分泌因子对表皮生长因子(EGF)诱导卵丘扩展过程的调控?结果:成功构建了ICR小鼠OOX培养模型,发现卵母细胞及其释放的旁分泌因子GDF9和BMP15为EGF诱导卵丘扩展所必需?结论:ICR小鼠卵母细胞通过旁分泌机制促进排卵关键过程?     

卵丘细胞凋亡预测相应配子及胚泡发育的价值

目的：检测卵丘细胞大量凋亡是否可预测卵母细胞质量及其发育能力下降。设计：前瞻性研究。机构：公立医院及大学。患者：37例患者知情同意自愿参加本次试验并签字。干预：完全分离卵丘卵母细胞复合体，采用TUNEL试剂盒（以末端脱氧核糖核酸转移酶介导的地高辛-三磷酸去氧鸟苷为标记的缺口末端标记技术）分析卵丘细胞悬液。主要观察指标：卵丘细胞凋亡百分比及囊胚形成率。结果：年轻患者（年龄≤35岁）卵丘细胞凋亡百分比显著低于年长患者，所有患者配子成熟度与卵丘细胞凋亡高度相关。受精卵与卵裂期（第1～4天）形态学特征与编程细胞死亡程度无相关性，但根据未分化体细胞凋亡百分比可以预测囊胚发育状况。此外，有一种倾向，即由高质量卵泡发育而来的囊胚细胞凋亡率降低。妊娠率与着床率不受影响。结论：卵泡内的凋亡过程可能影响卵母细胞成熟。虽然尚无形态学证据，但是由未发生凋亡或仅轻度凋亡的卵丘复合物发育形成的配子或受精卵发育为最佳囊胚的机会增多。     

小鼠体细胞核移植的早期研究

目的 建立成熟的小鼠体细胞核移植技术。方法 通过显微操作，以ICR鼠成纤维细胞核和C57鼠的去核卵母细胞进行胚胎的重构。重构胚经化学激活或3种不同脉冲电压融合后再经体外或输卵管体内培养；3d后回收胚胎并进行胚胎的发育鉴定。结果 去核卵母细胞的成活率为71．91％、化学激活率为75．09％；刺激电压为60V(80μs、刺激5次)的融合率比其他几种方式高；经脉冲电压70V(80μs、刺激2次)处理后的胚胎发育潜力比其他几种方式处理后的胚胎发育潜力要好。结论 小鼠体细胞核移植技术基本获得成功。     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。     

卵母细胞体外成熟评价标准的改良研究

目的探讨改良式人未成熟卵母细胞评分标准的可行性和颗粒细胞指标的合理性及其对卵子发育潜能的影响。方法体外培养卵丘-卵母细胞复合体,按改良式人未成熟卵母细胞评分标准,将未成熟卵母细胞分为优质卵和非优质卵,对成熟卵母细胞进行受精,并对胚胎进行评价;用琼脂糖凝胶电泳检测两类卵的颗粒细胞凋亡。结果优质卵的成熟率、卵裂率和优质胚胎率都优于非优质卵,优质卵成熟数和优质胚胎数与非优质卵比较差异有统计学意义（P<0.01）;非优质卵其卵丘细胞DNA凝胶电泳后形成明显DNA 梯带,凋亡程度高于优质卵的卵丘细胞。 结论改良式人未成熟卵母细胞评分标准在临床上具有可行性。