瞬时转染HBx基因到人正常胆管上皮细胞并观测其对hTERTmRNA的表达影响

目的通过研究HBx基因转染到人正常胆管上皮(HBECs)后对人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的转录调节作用，以阐明HBV感染在胆管癌发生中的作用机制。方法瞬时转染HBx基因到体外培养的HBECs，同时转染含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的克隆载体以判定转染率；RT-PCR分析转染后HBECs内hTERT mRNA的表达变化；并通过细胞免疫组化技术了解转染细胞内HBx蛋白的表达。结果经EGFP判定的转染率约为15％；未经转染或转染空载体的HBECs不表达hTERT mRNA，而转染HBx基因的HBECs可表达明显的hTERT mRNA；只有在转染了HBx基因的HBECs可检测到HBx蛋白表达。结论HBx基因转染能激活hTERT mRNA的转录表达，这种顺式调节作用可能是胆管上皮增殖、分化并恶化的主要机制。     

反义RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株基质金属蛋白酶－2的抑制作用

目的 观察反义RhoC基因对胆管癌QBC939细胞株的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)表达的影响.方法 将反义RhoC真核表达载体转染人胆管癌细胞株QBC939,逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测MMP-2在QBC939细胞、转染空载体的QBC939细胞(QBC939-V)、转染反义RhoC的QBC939细胞(QBC939-AS)的mRNA和蛋白相对表达量.结果 QBC939细胞MMP－2 mRNA吸光度相对值为0.588±0.074,QBC939-V细胞为0.629±0.061,两者差异无统计学意义(P＞0.05),QBC939-AS细胞MMP-2 mRNA吸光度相对值为0.286±0.097;与QBC939及QBC939－V比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 反义RhoC基因能够抑制QBC939细胞株的MMP-2表达.     

突变型ⅠkBα转染对肝门部胆管癌多药耐药基因的调控作用

目的 探讨阻断核转录因子-kB(NF-kB)活性对肝门部胆管癌细胞多药耐药基因(MDR-1)表达的影响。方法用突变核转录因子-kB抑制蛋白αⅠkBα质粒(mⅠ-kBa)转染肝门部胆管癌细胞株(QBC939)及稳定表达丙型肝炎病毒核心蛋白(HCVC)的QBC939(QBC939HCVC )，凝胶迁移率电泳(EMSA)检测mⅠkBa质粒转染的QBC939和QBC939HCVC 细胞中NF-kB DNA结合活性；逆转录-多聚酶链反应(RT—PCR)检测转染m-Ⅰ kBa质粒对肝门部胆管癌细胞中MDR-1基因及其表达产物(P—GP)表达的影响。结果 转染mⅠkBa质粒组的QBC939和QBC939HCVC 细胞放射性浓聚影明显淡于非转染组，密度计成对扫描显示，转染组和非转染组相对信号密度有明显差异；转染突变型ⅠkBa质粒的QBC939和QBC939HCVC 细胞中MDR-1mRNA和蛋白的表达水平明显低于非转染组。结论 转染mⅠkBa能明显逆转肝门部胆管癌细胞多药耐药性。阻断NF—kB活性有望成为肝门部胆管癌基因治疗新策略的“靶位”。     

丙型肝炎病毒核心蛋白激活肝门部胆管癌细胞血管内皮生长因子的表达

目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白对肝门部胆管癌生长和转移的影响。方法 首先构建表达HCV核心蛋白的真核表达载体pcDNA3-HCVcore,再将含有 pcDNA3-HCVcore的载体和不含 pcDNA3-HCV core的空载体分别导入肝门部胆管癌细胞株 QBC939中,RT-PCR和免疫组织化学检测 VEGF mRNA和蛋白表达。结果 重组质粒 pcDNA3-HCVcore在 QBC939细胞中有稳定表达;表达 HCV核心蛋白的细胞QBC939的 VEGF在蛋白水平和 mRNA水平较转染空载体的细胞QBC939明显升高。结论 HCV核心蛋白能激活VEGF表达,可能对肝门部胆管癌的生长和转移具有促进作用。     

rhNIS基因转导胆管癌细胞介导125Ⅰ摄取的研究

目的 探讨人钠/碘同向转运体(hNIS)基因cDNA转导至胆管癌细胞系QBC939细胞后的表达水平及其对介导125Ⅰ摄取的影响.方法 将扩增出的hNIS基因cDNA序列克隆至pMD18-T载体;筛选后的亚克隆hNIS编码至真核表达型载体PDC316中,经脂质体途径导入胆管癌细胞(QBC939),建立新细胞系(QBC939-A).同时设立空质粒(QBC939-B)转染和空白(QBC939-C)对照组.在体外培养条件下采用半定量RT-PCR检测各组2,3,6 d细胞内hNIS.mRNA表达水平和1,2,3,6 d的125Ⅰ摄取情况.结果 建立了能稳定表达hNIS摹因的新型细胞系QBC939-A.hNIS-mRNA表达水平检测显示,Q13C939-A于3 d表达量达高峰,与QBC939-B和QBC939-C比较,有显著性差异(P＜0.05).且QBC939-A细胞的摄碘能力在转染后3 d达高峰,较QBC939-C高14倍,较QBC939-B高16倍.结论 rhNIS基因转导至胆管癌细胞足以在短期内介导125Ⅰ的摄取,为介导125Ⅰ靶向治疗胆管癌的研究奠定了基础.     

切割bcl-2核酶对人胆管癌细胞致瘤性的影响

目的研究切割bcl-2mRNA核酶对人胆管癌细胞致瘤性的影响。方法将合成的切割bcl-2mRNA核酶(ribozyme,RZ)基因定向插入到真核细胞表达载体pDOR-neo内,并用重组后的载体转染人胆管癌细胞QBC939,再将经转染核酶基因的胆管癌细胞5×10     

RNA干扰诱导型一氧化氮合酶基因表达对人胆管癌细胞生长的影响

目的:探讨RNA干扰诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因的表达对人胆管癌细胞生长的影响。方法:针对iNOS设计并合成3种iNOS-siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及阴性对照siRNA序列后,分别转染人胆管癌细胞QBC939细胞,用荧光显微镜下观察转染效率,通过iNOS mRNA与蛋白的变化分析干扰效果,选择干扰效果最为明显的iNOS-siRNA序列,观察其干扰后QBC939细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡的变化。实验以无处理的QBC939细胞为空白对照。结果:合成的3种iNOS-siRNA序列均可有效转染人胆管癌QBC939细胞,且转染后均能明显降低QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达(均P0.05),其中siRNA2对iNOS的抑制作用最为明显,阴性对照siRNA序列对QBC939细胞中iNOS mRNA与蛋白的表达无明显影响(均P0.05)。转染siRNA2后,QBC939细胞增值明显降低、出现明显的G0/G1期阻滞、凋亡率明显增加(均P0.05);转染阴性对照siRNA序列的QBC939细胞无上述改变(均P0.05)。结论:RNA干扰能有效降低iNOS基因在胆管癌细胞中的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖,并促进其凋亡。     

能稳定表达外源抑癌基因PTEN的胆管癌细胞系QBC939的建立

目的：为研究抑癌基因PTEN对胆管癌细胞生物学行为的影响，建立能稳定表达外源PTEN的胆管癌细胞系。方法：将野生型、突变型PTEN质粒和空载体质粒分别转化细菌，提取纯化后，脂质体介导法转染体外培养的胆管癌细胞系QBC939;嘌呤霉素筛选抗性克隆;Western blot 检测标签蛋白HA的表达;RT-PCR， Western blot和免疫细胞化学法分析目的基因PTEN的表达。结果：野生型、突变型PTEN和空载体转染细胞株均获得嘌呤霉素抗性;野生型和突变型PTEN转染细胞株均检测到ＨＡ的表达，而空载体转染细胞株和未转染细胞株均未检测到ＨＡ的表达;野生型及突变型PTEN转染细胞株中目的基因PTEN在mRNA和蛋白质表达水平上均较空载体转染细胞株和未转染细胞株增强。结论：成功构建了分别能稳定表达外源野生型PTEN，突变型PTEN或空载体pBP的胆管癌细胞系。     

神经生长因子对人胆管癌细胞体外侵袭力影响的研究

目的 探讨神经生长因子对人胆管癌细胞株QBC939体外侵袭力的影响。方法 构建β-NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF,经酶切鉴定后,采用脂质体Lipofectamine转染人胆管癌细胞株QBC939,Western blot检测蛋白的表达情况,Transwell小室检测转染前后细胞侵袭力的变化情况。结果 成功构建β-NGF的真核表达载体pcDNA3．0-NGF,转染QBC939细胞后,能够稳定表达β-NGF蛋白,且表达强度随转染质粒浓度增强而增强,与对照组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）,Transwell小室检测转染后胆管癌细胞侵袭力增强,与空白对照组和转染空质粒组相比,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论 NGF具有增强胆管癌细胞株QBC939体外侵袭力的作用,可能导致胆管癌的神经浸润与转移。     

反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌细胞MBD1基因表达的影响

目的：探讨反义MBD1基因真核表达载体转染对人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因表达的影响，为进一步研究该基因的作用提供依据。方法：构建反义MBD1基因真核表达载体，通过脂质体转染入人胆管癌细胞株QBC 939中，以G418进行筛选得到稳定转染细胞株，用PCR鉴定外源性neoR基因在转染细胞中的表达以确定转染成功。半定量RT PCR观察转染前后MBD1基因mRNA水平的变化，流式细胞术检测转染前后MBD1蛋白的变化。 结果：人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的mRNA水平从0.912±0.022降低至0.215±0.017，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)；MBD1蛋白水平从(80.19±5.05)％降低到(35.11±4.05)％，转染前后的差异有显著性(P＜0.01)。 结论：反义MBD1基因转染能降低人胆管癌QBC 939细胞中MBD1基因的表达水平，提示MBD1基因在胆管癌的发生发展中具有重要作用，反义MBD1基因转染有可能成为胆管癌治疗的一种新方法。     

RNA干扰降低环氧化酶2基因表达对人胆管癌QBC939细胞的体外作用

目的研究小干扰RNA（siRNA）降低环氧化酶2（COX-2）基因对胆管癌QBC939细胞凋亡及凋亡蛋白caspase-3蛋白表达的影响。方法采用RNA干扰的方法,将胆管癌细胞株QBC939细胞分为4组：COX-2 siRNA干预组、阴性对照siRNA组、空脂质体、空白对照组。将COX-2 siRNA转染入QBC939细胞;流式细胞仪检测siRNA降低COX-2基因表达对凋亡的作用,WesternBlot法检测siRNA降低COX-2基因表达对caspase-3表达变化的影响。结果 RNA干扰后QBC939细胞COX-2表达下降至空白对照组的42%,流式细胞仪检测结果显示COX-2 siRNA干预组细胞的凋亡率以及凋亡蛋白caspase-3的表达明显高于其他3个对照组。结论 RNA干扰可抑制细胞COX-2蛋白的表达,促使胆管癌QBC939细胞的凋亡,caspase-3途径可能是其调控通路之     

腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究

目的探讨凋亡素基因转染对人胆管癌细胞凋亡的影响,为胆管癌的治疗探索新方法。方法采用含凋亡素基因的重组腺病毒感染胆管癌细胞株QBC939,在确定其感染复数后通过光镜、荧光观察其凋亡情况,同时通过TUNEL染色统计凋亡率。结果胆管癌细胞株QBC939的重组腺病毒的感染复数为65,在感染后第3天凋亡素基因能引发胆管癌细胞株QBC939的凋亡,并且随着时间的推移其作用越明显,在第7天凋亡率达到61.9%。结论凋亡素能明显引发人胆管癌细胞的凋亡,在胆管癌的治疗上具有较大潜力。     

E2F1的siRNA真核表达载体转染对胆管癌细胞的作用

目的:探讨E2F1蛋白信号的转导通路对胆管癌细胞凋亡的影响中的作用。方法:根据E2F1基因cDNA序列，设计针对目的基因的4个siRNA靶序列，将其插入U6启动子下游，克隆到真核表达载体pGsensil中，通过酶切鉴定和DNA测序鉴定。采用脂质体介导法将构建好的4个siRNA表达载体分别转染于QBC939细胞中；以RT-PCR检测E2F1基因在转染前后的表达，流式细胞术检测转染后对细胞凋亡率的影响。结果:重组质粒酶切后呈线性化，酶切鉴定及DNA测序结果显示插入片断正确。转染48h后，4个siRNA表达载体均抑制了E2F1 mRNA的表达，沉默E2F1基因后细胞的凋亡率显著增加。结论:E2F1的siRNA真核表达载体转染QBC939细胞后，该表达载体具有抑制E2F1基因表达、促进细胞凋亡的功能，可以用于后续胆管癌的实验研究。     

WWOX表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其机制

目的 探讨含有WW结构域的氧化还原酶基因(WWOX)表达对胆管癌QBC939细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 用脂质体转染法将WWOX重组真核表达质粒转染QBC939细胞;采用荧光定量逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR)和Westem blot法鉴定WWOX在QBC939细胞中的表达;流式细胞仪(FCM)法检测转染前后各细胞凋亡率的变化;JC-l染色法检测细胞线粒体膜电位(△Ψm)变化;荧光定量RT-PCR和Western blot法检测胆管癌细胞bcl-2表达的变化;将未转染和转染空质粒的细胞作为对照组接种到裸鼠皮下以检测荷瘤,TUNEL方法原位检测移植瘤的凋亡.结果 建立了稳定表达WWOX基因的QBC939/WWOX细胞株,mRNA及蛋白表达明显增加.FCM显示QBC939/WWOX组的细胞凋亡率明显增高[(1.24±0.35)％比(1.73±0.48)％比(21.40±2.35)％,P＜O.01],JC-l显示转染组的线粒体膜电位下降[(4.27±0.64)％比(4.96±0.52)％比(28.60±3.94)％,P＜O.01],bcl-2 mRNA及蛋白的表达均显著降低(P＜0.05).转染组的皮下肿瘤较对照组生长速度明显减慢(P＜0.05),TUNEL实验证实转染组的皮下肿瘤凋亡指数为(13.6±1.5)％,较对照组明显增高,差异有统计学意义(P＜0.O1).结论 WWOX基因能促进胆管癌细胞的凋亡,其机制可能与下调bcl-2的表达,激活线粒体凋亡通路有关.     

靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响

目的：探讨靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响。方法：合成具有互补序列的能够编码短发卡RNA（shRNA）的双链寡核苷酸并构建pSilencer2．1真核表达质粒,经稳定转染QBC939细胞后对转基因后胆管癌细胞的生物学行为进行观察。结果：neo基因稳定表达于转染阳性质粒及阴性对照质粒的QBC939细胞中。通过RT—PCR及westernblot检测证实shRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin表达率分别达68固％和613％。细胞计数及平板克隆形成实验显示转染细胞生长速度及细胞克隆明显减缓（P〈O．01）。流式细胞术测定细胞周期显示转染细胞G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少。DNAladder、透射电镜观察及流式细胞定量研究显示转染细胞凋亡明显增多。结论：靶向survivin的shRNA能有效抑制目的基因的表达,通过增加细胞凋亡在体外抑制人胆管癌细胞的生长,为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础。