缺血预处理预防肝细胞分离过程中的缺血再灌注损伤

背景:缺血预处理能否减轻肝细胞分离过程中的缺血再灌注损伤及改善供体残留肝脏功能? 经检索国内外罕见这方面的研究.目的:探讨缺血预处理对分离肝细胞及供鼠残肝缺血再灌注损伤的防治作用.方法:12 只SD大鼠随机分为2组:单纯肝部分切除组和缺血预处理组,各6只.采用改良四步胶原酶灌注法分离上述切除肝脏肝细胞,同时收集术前和术后1 d大鼠的血清.结果与结论:缺血预处理组切除肝脏分离肝细胞成活率、增殖活性及白蛋白合成、超氧化物歧化酶水平显著高于单纯肝部分切除组(P < 0.05),而乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、丙二醛水平显著减少(P < 0.05);与单纯肝部分切除组比较,缺血预处理组大鼠血清白蛋白、乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、超氧化物歧化酶、丙二醛水平差异无显著性意义(P均> 0.05).结果表明缺血预处理能减轻肝细胞分离过程中的缺血再灌注损伤,其机制可能与其自身缺血性预适应、抗氧化、清除氧自由基的能力相关,但对供鼠肝部分切除后残肝功能的影响不明显.     

传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果的比较

目的:比较传统及改良冻存法对人胎肝细胞保护效果,建立一种适合于人胎肝细胞冷冻保存的方法。方法:实验于2006-07/11在广州医学院进行。①人胎肝组织取自中期终止妊娠胎儿(20周,经胎儿亲属知情同意及医院伦理委员会批准)。冷冻保护液包括A液(DMEM培养液含1.5mol/L乙二醇 体积分数为0.2胎牛血清);B液(A液 0.1mol/L蔗糖)两部分。②传统冻存法:用0.025%Ⅰ型胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞。胎肝细胞在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏培养观察。③改良冻存法:胎肝组织在A液、B液中分别渗透平衡20min后,在冷冻保护液B液中经液氮蒸汽冷平衡5min后迅速入液氮冻存,1周后复苏,入DMEM培养液37℃孵育1h,胶原酶消化胎肝组织,分离、收集消化后的胎肝细胞培养观察。④新鲜分离的胎肝细胞做为对照组。⑤复苏后分离所得胎肝细胞用锥虫兰染色评估细胞活率,并记录贴壁时间,观察集落生长情况。结果:①锥虫兰染色结果显示传统冻存法复温后的胎肝细胞活率为(73.8±2.2)%,明显低于新鲜分离的胎肝细胞活率(89.2±3.6)%及改良冻存法所得胎肝细胞活率(82.5±4.2)%(P<0.01)。②贴壁情况观察发现新鲜胎肝细胞与改良冻存法胎肝细胞于培养24h开始贴壁,而传统冻存法胎肝细胞贴壁时间滞后48h。③新鲜胎肝细胞及改良冻存法胎肝细胞于第3天出现生长集落(细胞数>10为一个集落),传统冻存法胎肝细胞在第5天出现生长集落,集落的数量低于改良冻存法及对照组(P<0.01)。结论:改良冻存法可避免冻存前损伤,提高细胞对冷冻的耐受性和冻存复温后细胞的活率。     

缺血预处理预防肝细胞分离过程中的缺血再灌注损伤

背景：缺血预处理能否减轻肝细胞分离过程中的缺血再灌注损伤及改善供体残留肝脏功能？经检索国内外罕见这方面的研究。目的：探讨缺血预处理对分离肝细胞及供鼠残肝缺血再灌注损伤的防治作用。方法：12只SD大鼠随机分为2组：单纯肝部分切除组和缺血预处理组,各6只。采用改良四步胶原酶灌注法分离上述切除肝脏肝细胞,同时收集术前和术后1d大鼠的血清。结果与结论：缺血预处理组切除肝脏分离肝细胞成活率、增殖活性及白蛋白合成、超氧化物歧化酶水平显著高于单纯肝部分切除组（P〈0.05）,而乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、丙二醛水平显著减少（P〈0.05）;与单纯肝部分切除组比较,缺血预处理组大鼠血清白蛋白、乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、超氧化物歧化酶、丙二醛水平差异无显著性意义（P均〉0.05）。结果表明缺血预处理能减轻肝细胞分离过程中的缺血再灌注损伤,其机制可能与其自身缺血性预适应、抗氧化、清除氧自由基的能力相关,但对供鼠肝部分切除后残肝功能的影响不明显。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较(英文)

背景:通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的:对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法:①预损伤法:预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法:直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论:预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P>0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5～7d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义（P〉0.05）。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

供肝的不同灌注方法在大鼠肝移植中的应用

目的:探讨大鼠肝移植时供肝的不同灌注方法对大鼠的影响.方法:80只大鼠随机分为供、受体两组(各40只),供体组再随机均分为经腹主动脉灌注组(A组)和经门静脉灌注组(B组)以获取供肝,应用改良二袖套法进行大鼠原位肝移植.检测两组供肝切取时间,热缺血时间,术后第1、4、7、10天的肝功能,术后一般情况及生存率等.结果:A组和B组的供肝切取时间分别为(30.0±3.0)min和(27.0±3.0)min,热缺血时间分别为(2.0±0.5)min和(1.0±0.5)min;A组术后第1天的丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、总胆红素等均较B组高,而术后第7天的结果却相反.结论:对于非肝动脉化的大鼠肝移植手术供肝采用经门静脉灌注的方法操作较简单,供肝切取时间较短,热缺血时间短,术后早期肝功能的损害较小,但恢复速度相对较慢.     

成年大鼠心肌细胞分离方法的改良

背景:目前多采用酶解法分离成年大鼠心肌细胞,但在灌流装置、灌流液体和灌流方法等方面的差异较大,且多以单个细胞的急性分离为目的,仅适于进行电生理研究.目的:建立稳定的改良成年SD大鼠心肌细胞分离方法,使之适于进行原代培养和研究.设计、时间及地点:细胞学体外实验,于2008-03/09在华中科技大学同济医学院附属同济医院分子心脏病中心完成.材料:8～10周龄雄性SD大鼠30只,由同济医学院实验动物中心提供,Ⅱ型胶原酶、蛋白酶和不含脂肪酸的牛血清白蛋白分别为美国Worthington公司、美国Sigma公司和德国Merck公司产品.方法:SD大鼠麻醉后,快速取出心脏,采用改良的Langendorff灌流装置行主动脉逆行灌注,无钙Krebs-Henseleit缓冲液(KH液)非循环灌流4 min,0.6 g/L Worthington 2型胶原酶联合0.03 g/L蛋白酶消化约15 min,剪下心室组织于消化液和10 g/L牛血清白蛋白的混合液中,剪碎后于37℃振摇孵育10min,200 μm尼龙网过滤,500 g离心1 min,梯度复钙,自然沉降.主要观察指标:心肌细胞的形态、活力和产量.结果:复钙后的杆状存活心肌细胞得率为(73±5.6)%(n=30),其中90%以上的杆状心肌无明显搏动,横纹清晰.每只大鼠心脏的平均存活心肌细胞产量为(4.2±0.4)×106.结论:经过改良的Langendorff逆行主动脉灌流酶解法分离成年大鼠心肌细胞,可稳定获得高比例的存活心肌细胞并用于原代培养和细胞,分子生物学研究.     

原代肝细胞的分离和移植

背景:肝细胞移植可以作为一种桥梁作用,帮助肝功能衰竭患者渡过肝衰期,并提高患者生存率和预后。目的:采用Seglen改良的原位灌注探讨SD大鼠原代肝细胞分离的影响因素和方法的改进,同时分析原代肝细胞治疗急性肝功能衰竭大鼠的疗效。方法:两步法分离大鼠肝细胞。D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭,24h后分2组:细胞移植组经脾脏移植约2×107个肝细胞;对照组经脾脏注射0.4mLHank’s液。观察不同时间点大鼠的生存率和血清中转氨酶、总胆红素变化情况、脾内白蛋白分泌作用及脾内肝细胞分布情况。结果与结论:大鼠肝细胞分离存活率达85%～95%。细胞移植组14d存活率(75%)显著高于对照组组(30%)(P=0.01),且肝功能改善情况明显优于对照组。移植30d后,脾内有肝细胞白蛋白绿色荧光信号;移植15d后,可以看到肝细胞在脾脏红髓中簇集在一起并定植。结果说明胶原酶、pH值、灌注液、灌注方法等均是影响肝细胞分离存活率的因素;经脾脏移植的肝细胞能提高急性肝衰竭大鼠的生存率和改善肝功能。     

三种供体阴茎灌注方法的特点比较

目的:比较供体阴茎腹主动脉灌注、髂总动脉灌注和髂内动脉灌注法的临床观察指标,试图寻找最佳的尸体阴茎灌注方法。方法:广州军区广州总医院于2004-03/2005-09采用腹主动脉灌注法、髂总动脉灌注法和髂内动脉灌注法取得供体阴茎各15例,共获取供体阴茎45个。①腹主动脉灌注法:于腹主动脉分叉上方6cm处做切口,切口近端插管灌注肝、肾,切口远端套入一粗线,插入20F气囊导尿管,深约5cm。②髂总动脉灌注法:分别于腹主动脉与髂总分叉处套入一粗线,上提粗线,剪开髂总动脉前壁,插入自制12F硅胶管,深约4cm。③髂内动脉灌注法:分别于髂总动脉与髂内动脉分叉处套入一粗线,上提粗线,剪开髂内动脉前壁,插入自制10F硅胶管,深约3cm。分析45例供体阴茎灌注临床资料,比较3种灌注方法切取供体阴茎的手术时间、热缺血时间、灌注液用量和灌注不良率。结果:①手术时间方面,腹主动脉灌注法短于髂总动脉灌注法[(3.28±1.02,4.96±1.84)min(P<0.05)],髂总动脉灌注法短于髂内动脉灌注法(6.02±2.25)min(P<0.05)。②热缺血时间方面,腹主动脉灌注法热缺血时间短于髂总动脉灌注法[(1.08±0.85,3.08±1.12)min(P<0.05)],髂总动脉灌注法热缺血时间短于髂内动脉灌注法(4.14±1.81)min(P<0.05)。③灌注不良率方面,腹主动脉灌注法明显低于髂总动脉灌注法[0,10.25%(P<0.05)],髂总动脉灌注法低于髂内动脉灌注法(15.23%)(P<0.05)。④3组灌注方法的灌注液用量差异无显著性意义(P>0.05)。结论:腹主动脉灌注法切取供体阴茎操作简单,手术时间和热缺血时间均较短,灌注不良发生率低,优于髂总动脉和髂内动脉灌注法。     

胶原酶消化时间及质量浓度对大鼠胰岛细胞分离的影响

背景:胶原酶消化方法是胰岛细胞分离技术中关键的第1步,其成败关系到胰岛细胞移植的存活与功能.目的:针对不同质量浓度和同一质量浓度条件下不同时间点胶原酶分离纯化所获得胰岛细胞的效果进行对比,以确定理想的胶原酶分离胰岛细胞的标准化方案.设计、时间及地点:单一样本观察,细胞学体外观察,于2006-09/2007-05在解放车总医院第二附属医院全军器官移植实验室完成.材料:胰岛细胞供体为SD大鼠.将32只大鼠按随机数字表法分为4组,即胶原酶0.5 g/L,1.0 g/L,1.5 g/L及2.0 g/L组,每组8只.方法:每组前4只动物.采用0.5,1.0,1.5,2.0 9/L 4种质量浓度的胶原酶对胰腺进行分离,消化过程中每隔10 min为1个时间点,双硫腙染色观察分离情况,分析结果并确定最适合获取胰岛量最多的时间点.随后每组另外4只动物按照确定时间点停止消化,应用间断密度梯度离心法纯化胰岛,双硫腙和丫啶橙-碘丙啶荧光染色分析移植物形态和存活率,确定分离所需胶原酶的最佳浓度.主要观察指标:调整胶原酶的质量浓度与消化时间,荧光显微镜下胰岛细胞计数,评估胶原酶最佳质量浓度及消化时间.结果:分忻后确定各组胰岛细胞最佳获取时间,胶原酶0.5 g/L组50 min,胶原酶1.0 g/L组40 min,胶原酶1.5 g/L及2.0 g/L组均为30minm.胶原酶0.5 g/L组分离并纯化后胰岛细胞收获量显著低于其他3组(P<0.01),胶原酶1.0 g/L.1.5 g/L及2.0 g/L组两两比较差异无显著性意义(P>0.05).胶原酶2.0g/L组胰岛细胞平均存活率显著低于其他3组(P<0.01),胶原酶0.5 g/L,1.0 g/L及1.5 g/L组两两比较差异无显著性意义(P>0.05).结论:在胰腺灌注良好情况下,胶原酶消化条件控制在质量浓度1.5g/L,时间30min进行水浴振荡可获得很好的分离效果.