用SYBR Green I实时逆转录-聚合酶链反应定量检测人、小鼠精子中CatSper1 mRNA

目的:建立并优化SYBR GreenI实时RT-PCR体系,定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。方法:用TRIzol分别提取人、小鼠成熟精子中的总RNA,逆转录后用SYBR GreenI实时PCR定量检测CatSper1 mRNA。SYBR GreenI实时PCR采用普通PCR试剂,加入SYBR GreenI染料,优化退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例,并在PCR循环时采用四步法以消除引物二聚体的影响。优化完成后用不同浓度的精子cDNA为模板做标准曲线,以检测SYBR GreenI实时PCR的扩增效率。结果:定量检测CatSper1 mRNA的SYBR GreenI实时PCR体系适宜退火温度、Mg2+浓度及上、下游引物比例分别为63℃、3.0mmol/L和1∶1,四步法中采集荧光的温度为88℃。优化后用人和小鼠精子cDNA为模板做标准曲线分别为Y=-3.402log(X)+25.99和Y=-3.409log(X)+24.09,扩增效率分别为96.8%和96.5%,可定量检测人、小鼠成熟精子中的CatSper1 mRNA。结论:用普通的逆转录及PCR系统和试剂,建立了一种方便、廉价、可靠的SYBR GreenI实时荧光定量RT-PCR系统,可用于人、小鼠精子中CatSper1 mRNA定量检测。     

CatSperl在小鼠睾丸发育过程中的动态表达及与人精子活力的关系

目的 研究CatSper1 mRNA在小鼠睾丸发育过程中的动态变化，并探讨CatSper1蛋白表达与精子运动的关系。方法 采用荧光实时逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）相对定量法检测CatSper1mRNA在出生后11、15、18、21、25、28、35、42、56和120d龄C57BL／6小鼠（每天龄3只）睾丸中的表达；分别从4例正常精液标本中用四层密度梯度Percoll（浓度分别为95％、76％、57％和47．5％）离心分离出高活力和低活力精子，用于Western Blot定量检测CatSper1蛋白的表达。结果CatSper1mRNA在18d龄小鼠睾丸开始表达，在25和28d龄表达上调明显，分别为21d龄表达水平的2．95和7．59倍。自42d后上调缓慢，至成年小鼠时达到最高水平。CatSper1蛋白在每例标本高活力精子中的表达量均显著高于低活力精子（P〈0．05）。结论 CatSper1与精子活力特性有关，为进一步研究CatSper家族各成员间的关系和确切功能提供参考依据。     

真核表达CatSper1用于筛选有效siRNA的体外实验研究

目的 构建pEGFP-N1-CatSper1重组质粒,在真核细胞中表达CatSper1,利用化学合成siRNA抑制小鼠CatSper1基因的表达,并筛选抑制效果最佳的siRNA序列. 方法 利用重组PCR克隆小鼠CatSper1全长cDNA,构建到真核表达载体中.生物信息分析软件校正结果,获得三条针对雄性小鼠CatSper1的siRNA序列,合成后分别与重组质粒pEGFP-N1-CatSper1共转染到小鼠成神经瘤N2a细胞株中,通过观察EGFP荧光强度、实时定量聚合酶链反应和WesternBlot等方法,分析干扰效果,筛选能显著降低N2a细胞中外源性CatSper1表达量的siRNA序列. 结果 成功克隆小鼠CatSper1基因的全长cDNA片段（2,061 bp）,并构建到pEGFP-N1表达载体中.三个siRNA干扰组的CatSper1 mRNA和蛋白表达与空白对照组相比均下降,其中以靠近3＇端的siRNA干扰作用更为明显,阴性对照siRNA组未引起CatSper1 mRNA和CatSper1蛋白表达明显变化. 结论 在小鼠神经瘤N2a细胞株中成功表达外源性CatSper1蛋白,并筛选出有效的siRNA,为深入研究CatSper1功能及用于避孕提供参考.     

人精子DNA从头甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的mRNA表达分析

目的 通过体外分离成熟的精子,利用实时荧光定量PCR(qRealTime-PCR)检测其是否表达DNA从头甲基化转移酶(DNMT1/3a/3b)及甲基CpG结合蛋白(MeCP2),为精子中甲基化表观修饰研究提供依据.方法 体外采集健康男性志愿者的精液标本,利用精子上游收集法获得具有活性的成熟精子.通过SYBR Green/PI双染色法,利用流式细胞术(FCM)检测精子样本的质膜完好性及其活性.抽提精子的总RNA,逆转录PCR获得cDNA,利用qRealTime-PCR鉴定精子甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白的mRNA表达情况.结果 SYBR Green/PI双染色和流式细胞仪检测发现,利用上游收集法可以收集SYBR Green /PI-的精子占总精子数的(94.513±1.120)%,表明该方法可以收集到质膜完好且活性强的精子.qRealTime-PCR结果显示,此样本精子中DNA从头甲基化转移酶的表达比较明显,而甲基CpG结合蛋白的表达量相当低.其中DNMT1的mRNA表达量较高(0.272±0.045,P＜0.05),DNMT3a和DNMT3b的表达水平比较弱[(4.930±0.01)E-006,(6.500±1.7)E-005,P＜0.05],而MeCP2几乎不表达[(2.12±0.91)E-006,p＜0.05].结论 利用qRealTime-PCR可以比较快速方便的检测出此次精子样本中DNA从头甲基化转移酶和甲基CpG结合蛋白的mRNA表达水平.     

SYBR green实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA方法的建立

目的：建立SYBR green实时荧光定量PCR检测VEGF mRNA水平的方法，并初步应用于美容相关疾患。方法：构建内参GAPDH质粒，倍比稀释VEGF和GAPDH标准品，建立PCR标准曲线，同时绘制熔解曲线，后应用SYBR Green实时荧光定量PCR检测正常皮肤、烧伤瘢痕、恶性黑素瘤细胞株A2058和WM793 cDNA的VEGF mRNA水平。结果：VEGF、GAPDH的标准曲线，符合线性要求，相关系数r均为1，熔解曲线峰值单一，产物特异度好，四组样本的SYBR green荧光定量PCR结果提示瘢痕组织、A2058、WM793的VEGF mRNA水平明显高于正常皮肤。结论：本研究成功建立了VEGF mRNA水平的SYBR green荧光定量PCR检测方法。     

CatSper1在精索静脉曲张模型大鼠精子中的差异表达及左卡尼汀对其的保护作用

目的:通过制备精索静脉曲张大鼠模型,检测其附睾精子中精子特异性钙通道(CatSper1)的表达,观察左卡尼汀对大鼠精子CatSper1的影响。方法:70只雄性大鼠随机分为7组,每组10只。分别为对照组(A组),精索静脉曲张组(B组),精索静脉曲张+生理盐水组(C组),精索静脉曲张+小、中、大剂量左卡尼汀组(D、E、F组)和F+延长喂养14 d组(G组)。手术结扎部分左肾静脉制备精索静脉曲张大鼠模型,12周后,C组给予生理盐水1 ml/d,D、E、F组分别用左卡尼汀小[0.05 g/(kg·d)]、中[0.1 g/(kg·d)]、大[0.2 g/(kg·d)]剂量灌胃35 d,G组在F组基础上延长灌胃14 d;实验结束后处死大鼠,进行精子参数分析,应用RT-PCR以及Western印迹分别检测精子中CatSper1 mRNA及蛋白表达情况。结果:与A组比较,B组a+b级精子百分率、精子活率及浓度均不同程度下降(P0.01),B组精子CatSper1 mRNA及蛋白相对表达量均明显下降(1.44±0.67 vs 0.71±0.38;1.87±0.67 vs 0.84±0.42,P0.01)。与C组比较,应用左卡尼汀后,各组精子浓度无明显增加, a+b级精子百分率、精子活率以及精子CatSper1 mRNA及蛋白表达含量明显增高,尤其大剂量组F、G组增高更加明显(P0.01)。与F组比较,G组延长应用2周左卡尼汀,精子CatSper1 mRNA及蛋白表达量无明显增加(P0.05)。结论:精索静脉曲张模型大鼠精子中CatSper1表达下降,应用左卡尼汀后,CatSper1的表达量及a+b级精子百分率、精子活率明显增加。     

CatSper基因家族在人和小鼠组织中的表达特征

目的研究CatSper基因家族在人和小鼠组织中的分布特点。方法将不同发育阶段的小鼠睾丸组织cDNA与Affymetrix全基因组芯片探针进行杂交,筛选出差异表达基因CatSper基因家族。RT—PCR验证差异表达基因在不同发育阶段的小鼠睾丸组织的表达特征,及其在人和小鼠不同组织中的分布。结果基因芯片分析发现CatSper1、CatSper2和CatSper3在小鼠睾丸的表达呈阶段特异性。RT-PCR结果表明该基因家族在睾丸的表达丰度明显高于其它组织;CatSper1和CatSper4在人体睾丸组织中特异性表达。结论CatSper基因家族在人和小鼠中呈现睾丸特异性表达或高表达,可能在精子发生中发挥重要功能。     

RCAS1mRNA在肝细胞癌中表达的意义

目的研究RACS1mRNA在原发性肝细胞癌中的表达并探讨其意义。方法应用SYBR GreenⅠ逆转录实时荧光定量PCR技术检测37例肝细胞癌(HCC)及癌旁组织中RCAS1mRNA的相对表达量,研究其表达与各项临床指标间的关系。结果RCAS1mRNA的表达水平与病理分级和临床TNM分期有显著相关性(P<0.05),而与病人的性别、血清AFP水平及肿瘤大小无显著相关性。结论RACS1mRNA可作为判断HCC侵袭性和进展的一个潜在指标。     

双孔钾离子通道TASK-1、TRAAK在弱精子症患者精子中的表达

目的 探讨双孔钾离子通道TASK-1、TRAAK在精子中的表达水平及TASK-1、TRAAK在弱精子症发生机制中的作用。方法 采用非连续密度梯度离心分离、纯化正常对照组精液标本20例和弱精子症组精液标本30例,提取精子总RNA后,采用RT-PCR,SYBR Green实时定量PCR检测精子中TASK-1、TRAAK mRNA的相对表达量。结果 TASK-1、TRAAK mRNA在正常对照组和弱精子症组精子中均有表达;其中,TRAAK在弱精子症患者精子中的表达量明显低于其在正常对照组精子中的表达量,下降2.3倍,两组之间有明显的统计学差异(P0.05),TASK-1在弱精子症患者精子中的表达量与其在正常对照组精子中的表达量没有明显差异(P0.05)。结论 TRAAK基因在弱精子症患者精子中的表达下调可能与精子活力下降有关,提示TRAAK可能成为弱精子症发病机制研究的一个分子靶标。     

PTEN和Survivin在膀胱癌中的表达及临床意义

目的 探讨PTEN mRNA和Survivin mRNA在膀胱移行细胞癌中的表达及其与病理分级、临床分期和复发的关系.方法 采用SYBR Green Ⅱ实时荧光定量逆转录聚合酶链反应试验方法检测43例膀胱癌组织及9例膀胱正常组织中PTEN mRNA和Survivin mRNA的表达情况.结果 膀胱正常组织中PTEN m...     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

深圳市某两所小学流行性腮腺炎突发疫情的流行病学分析

目的：通过对深圳市某两所小学发生的流行性腮腺炎突发疫情的流行病学特点及差异性进行分析,为制定科学、高效的防控策略提供科学依据。方法2013年5～7月深圳市大鹏新区某两所小学爆发流行性腮腺炎,以学校为整体研究对象,分别标记为学校A（24个班,学生1210例）和学校B（27个班,学生1274例）,对比两所小学的疫情流行病学差异性。结果分析发现,学校A流行性腮腺炎发病率为4.30%,发病班级所占比54.17%,均较学校B1.73%和29.63%高,对比差异有统计学意义（P＜0.05）;分析显示学校A学生出现疫病平均年龄为（11.2±1.1）岁,较学校B（9.34±1.0）岁,对比差异明显（P＜0.05）;且两组疫病患儿在接种疫苗率对比上差异无统计学意义（P＞0.05）;但疫情发生时,学校B疫苗紧急接种率明显高于学校A,对比差异有统计学意义（P＜0.05）。结论小学作为流行性腮腺炎爆发的主要场所之一,疫病爆发高峰季节前,针对易感染人群给予相应的疫苗接种等预防控制措施,同时加强流行性腮腺炎的监测,对于降低感染人群数量,减轻、遏制疫情有着积极的意义,值得相关防控部门重视。     

Frequency of complications of manipulation of the spine

Summary A survey of all members of the Swiss Medical Association of Manual Medicine was undertaken for the year 1989. Informative data were given by 425 respondents on the frequency of complications of manipulation as related to the spine. The number of thoraco-lumbar manipulations during 1989 (225 working days) was 805 for each respondent, and the number manipulations of the cervical spine 354. Thus, the total number of thoraco-lumbar manipulations was 342 125, and the total number of cervical manipulations was 150 450. The overall incidence of side-effects of transient complications due to cervical spine manipulation such as disturbance of consciousness or radicular signs was 1: 16716. Seventeen patients (ratio 1: 20 125) after manipulation of the lumbar spine presented, in addition to increased pain, a transient sensorimotor deficit with precise radicular distribution. Nine of the 17 patients (ratio 1: 38013) developed a progressive radicular syndrome with sensorimotor defict and radiologically verified disc herniation and had to be referred for surgery. Side effects and complications of cervical and lumbar spine manipulation are rare. Taking in to account the yearly number of manipulations performed by a single physician in Switzerland and the rate of complications, it can be calculated that a physician practicing manual medicine will encoutner one complication due to manipulation of the cervical spine in 47 years and one complication due to lumbar spine manipulation in 38 years of practice. However, it is important that a careful clinical assessment is carried out to avoid complications due to manipulation carried out on the basis of inappropriate indications. Furthermore, the decision as to which technique is indicated for any particular functional disorder of the spine should be made on the basis of rational criteria resting on a knowledge of clinical biomechanics, functional anatomy and neurophysiology. The authors recommend a prospective morbidity study to be carried out among physicians, chiropractors, osteopaths and physiotherapists, taking into account the different indications and therapeutic techniques in relation to complications.     

Oddi括约肌肌电活动实验模型的建立

目的建立研究Oddi括约肌肌电活动的动物模型和实验方法。方法将双极金属钩状电极通过浆膜层置入Oddi括约肌，记录不同条件干预下家兔的Oddi括约肌肌电活动信号，调整电生理实验参数并经放大、滤波及计算机处理后，对其大小、波形、幅度进行分析。结果不同条件干预下的家兔Oddi括约肌的肌电活动在波形、频率、幅度等方面均有明显的不同，具有明显的规律性。重复实验可得到相似的结果。结论使用双极金属钩状电极配以合理的电生理实验参数调整可以稳定地采集到在体的家兔Oddi括约肌肌电活动信号。这为今后广泛、深入地研究Oddi括约肌肌电活动搭建了一个技术平台。     

骨盆骨折的治疗进展

对于骨盆骨折的治疗 ,传统方法以卧硬板床 ,股骨髁上持续骨牵引 ,骨盆兜等保守治疗为主 ,常常引起下肢不等长 ,骶髋痛 ,步态失常等而严重影响生活质量 ,同时长期卧床易引发肺部感染、褥疮、应激性溃疡、泌尿系统结石等并发症而危及生命。下面就骨盆骨折的治疗进展作一综述。1     

Pathogenesis of carcinoma of the papilla of Vater

Most adenomas and carcinomas of the small intestine and extrahepatic bile ducts arise in the region of the papilla of Vater. In familial adenomatous polyposis (FAP) it is the main location for carcinomas after proctocolectomy. In many cases symptoms due to stenosis lead to diagnosis at an early tumor stage. In about 80%, curative intended resection is possible. Operability is the most relevant prognostic factor. Most ampullary carcinomas resp. carcinomas of the papilla of Vater develop from adenomatous or flat dysplastic precursor lesions. They can be sited in the ampulloduodenal part of the papilla of Vater, which is lined by intestinal mucosa. They also can develop in deeper parts of the ampulla, which are lined by pancreaticobiliary duct mucosa. Intestinal-type adenocarcinoma and pancreaticobiliary-type adenocarcinoma represent the main histological types of ampullary carcinoma. Furthermore, there exist unusual types and undifferentiated carcinomas. Many carcinomas of intestinal type express the immunohistochemical marker profile of intestinal mucosa (keratin 7–, keratin 20+, MUC2+). Carcinomas of pancreaticobiliary type usually show the immunohistochemical profile of pancreaticobiliary duct mucosa (keratin 7+, keratin 20–, MUC2–). Even poorly differentiated carcinomas, as well as unusual histological types, may conserve the marker profile of the mucosa they developed from. These findings underline the concept of histogenetically different carcinomas of the papilla of Vater which develop either from intestinal- or from pancreaticobiliary-type mucosa of the papilla of Vater. Molecular alterations in ampullary carcinomas are similar to those of colorectal as well as pancreatic carcinomas, although they appear at different frequencies. In future studies, molecular alterations in ampullary carcinomas should be correlated closely with the different histologic tumor types. Consequently, the histologic classification should reflect the histogenesis of ampullary tumors from the two different types of papillary mucosa.     

主动脉窦瘤破裂外科治疗的临床研究

目的　探讨主动脉窦瘤破裂局部病理改变及其合并主动脉瓣关闭不全的手术方法。方法　 3 6例主动脉窦瘤破裂 (RASV)合并主动脉瓣关闭不全 (AI) 15例、室间隔缺损 (VSD) 2 6例。补片修补 3 5例 ,其中合并VSD的均以一片法修补 ,合并AI的主动脉瓣置换 (AVR) 6例 ,主动脉瓣成形 4例。手术取材作病理检查 5例。结果　本组 3 6例中手术死亡 2例 ( 5 .6% )。存活的 3 4例病人均经门诊复查或通信随访 0 .3～ 18年 ,其中 2例死亡。病理检查见RASV合并VSD的瘤壁为纤维素样坏死或玻璃样变性。结论　主动脉窦壁纤维素样或玻璃样变性可能是其形成的病理基础。合并主动脉瓣关闭不全时应探查其病变程度 ,酌情一期矫正 ,瓣膜损伤明显时宜行主动脉瓣置换 ,对主动脉瓣环细小的病例 ,可借修补VSD和RASV的补片扩大主动脉瓣环。     

鼻尖、鼻翼缺损修复方法的探讨

１９５７年以来共收治鼻尖、鼻翼缺损１１９例，据情分别采用以下四种方法修复：①全层皮片移植２７例；②游离耳廓复合组织片移植３６例；③鼻唇沟皮瓣移转１２例；④上臂内侧皮管移植４４例，效果较为满意。我们在文章中就选用的原则、手术方法及注意事项等进行了探讨     

食管穿孔83例分析

８３例不同原因引起的食管穿孔，保守治疗５７例；手术２６例，行单纯食管修补术２０例、开胸行纵隔和／或胸腔引流２例、切除贲门肿物行胃食管吻合１例、颈部食管外置２例（其中１例并行二期结肠代食管手术）、１例开胸取异物形成食管瘘后，行二期修补瘘术。全组死亡８例，其中死于纵隔胸腔感染和主动脉破裂出血各４例。总治愈率８５％。并指出异物假牙造成食管穿孔的重要性，对严重的腐蚀性食管灼伤应早期行食管镜检，并针对食管穿孔部位、种类、间隔期、纵隔与胸腔的感染程度及病人具体情况采取相应的治疗措施。     

手部深度烧伤的临床治疗分析

目的 总结手部深度烧伤的临床治疗经验. 方法 46例54只深度烧伤手,其中深Ⅱ度烧伤30例33只手,Ⅲ度烧伤16例21只手.根据伤情不同,早期选择不同手术方式修复创面,术后早期进行功能锻炼. 结果 54只手的修复方式:中厚皮片移植33只手,异体脱细胞真皮与自体薄皮片复合移植12只手,腹部带蒂皮瓣1只手,前臂骨问背动脉逆行皮瓣3只手,股前外侧皮瓣5只手.治疗后,51只手移植皮片、皮瓣均成活,仅3只手移植皮片后有局灶性坏死,创面得到有效覆盖.按关节活动范围( range of motion,ROM)评定,本组优31只手(57.4％),良17只手(31.5％),中4只手(7.4％),差2只手(3.7％). 结论 手部深度烧伤后,选择合适术式,早期手术修复创面及功能锻炼,可取得很好的疗效.