空肠弯曲菌Pen:19 cadF基因真核表达重组质粒的构建与表达

目的：构建空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒，并证实其能在COS-7细胞中表达。方法：以含有KpnI和EcoRI酶切位点的同一对引物行PCR反应，获得空肠弯曲菌Pen：2、Pen：8、Pen：19和Pen：21cadF基因DNA片段。并选择与格林-巴利综合征最为相关的空肠弯曲菌Pen：19PCR产物为目的基因片段，插入到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中，以构建重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF。重组质粒经双酶切、PCR反应鉴定和DNA双向测序确认后转染至COS-7细胞。运用RT-PCR方法检测重组质粒在细胞mRNA水平的表达。结果：双酶切反应、PCR反应和DNA双向测序证实cadF基因插入成功。采用RT-PCR方法能够从重组质粒转染的COS-7细胞中扩增出与目的基因大小一致的DNA片段。结论：空肠弯曲菌Pen：19cadF基因真核表达重组质粒pcDNA3．1（＋）-cadF构建成功，并能在COS-7细胞中表达。为空肠弯曲菌DNA疫苗的研究奠定了良好的基础。     

LHR真核表达载体构建及表达

目的构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR的乳腺癌细胞株。方法KpnI／Hpa工双酶切LHR-cDNA质粒载体获得目的基因,定向克隆构建pcDNA3．1（4-）真核表达载体,酶切图谱和序列分析鉴定;重组质粒载体经脂质体转染MCF-7乳腺癌细胞,G418筛选,RT-PCR、细胞内cAMP测定,筛选鉴定高表达LHRMCF-7细胞。结果重组质粒pcDNA3．1（4-）-LHR酶切图谱分析结果、序列分析证明pcDNA3．1（4-）-LHR载体中LHR序列与GenBank的LHR基因序列完全相符。RT-PCR检测MCF-7细胞LHRmRNA,MCF-7细胞内cAMP浓度测定,证实MCF-7细胞高表达LHR。结论构建并转染pcDNA3．1（4-）-LHR真核表达载体,在MCF-7细胞中稳定表达,为探讨hCG对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。     

携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达

目的 构建携EGFP的人低氧诱导因子（HIF-1α）真核表达载体，为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法 采用分子克隆技术，KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3．1／V5-Hin—HIF-1仅获得HIF-1仅cDNA，克隆到质粒pcDNA3．1（＋），得到质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1α，以KpnⅠ，ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3．1（＋）-HIF-1仅获得HIF-1α cDNA，克隆到质粒pEGFP—c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞，用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α 在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功。荧光显微镜和Westom blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论 成功构建重组真核表达载体pEGFP—HIF-1α—c1并在HEK293细胞表达，为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。     

MAGE-1基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建MAGE-1基因重组真核表达质粒并在细胞系NIH-3T3中高效表达。方法用RT-PCR方法从人肝细胞肝癌（HCC）组织全RNA中扩增出MAGE-1基因cDNA序列,克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）,构建pcDNA3．1-MAGE-1重组质粒．重组质耗用脂质体转染NIH-3T3细胞,经RT-PCR和Western-blot鉴定转化细胞中MAGE-1的表达。结果RT-PCR获得长度为927bp的MAGE-1基因,经T载体和pcDNA3．1（＋）真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后,证实重组质粒构建正确,并存转化细胞中检测到了MAGE-1的表达。结论 真核表达质粒pcDNA3．1-MAGE-1构建成功,并建立了稳定表达人MAGE-1的NIH-3T3细胞株。     

人Fn14基因真核重组质粒的构建及其表达

目的构建人成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14（fibroblast growth factor—inducible 14，Fn14）基因真核重组质粒及其表达。方法从人肝细胞癌组织抽取总RNA，RT—PCR扩增出Fn14基因全长cDNA，经测序正确后，核酸内切酶EcoR I、Xba I酶切PCR产物，亚克隆人pcDNA3．1-Myc载体，重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经酶切及测序鉴定正确后转染COS-7细胞，通过免疫组织化学DAB法检测Myc—Fn14融合蛋白的表达。结果重组质粒pcDNA3．1-Myc—Fn14经EcoR I、Xba I酶切及测序鉴定正确，重组质粒包含人Fn14基因完整编码区。免疫组织化学检测结果显示，重组质粒转染COS-7细胞后成功表达Myc—Fn14融合蛋白，转染空载体pcD—NA3．1-Myc的COS-7细胞未见Myc—Fn14融合蛋白表达。结论构建了人Fn14基因真核表达载体，该重组质粒可表达含Myc-Fn14的融合蛋白，为研究Fn14功能奠定了基础。     

葡萄糖激酶基因真核表达载体构建及在COS-7细胞中的表达

目的构建葡萄糖激酶（GK）基因真核表达载体并于COS-7细胞内表达，为体外构建具有葡萄糖刺激性胰岛素分泌能力的基因工程细胞奠定基础。方法质粒pCMV4-GKZ1以EcoRI、BamHI双酶切，获得GK cDNA，与同样酶切的pcDNA3．1载体连接，建成重组载体pcDNA3．1-GKZ1，经酶切与测序鉴定。Lipofectamine2000介导pcDNA3．1-GKZ1转COS-7细胞。分别以RT—PCR及Western-blot对COS-7／GKZ1细胞中GKZ1基因的转录及表达进行检测。结果构建的pcDNA3．1-GKZ1重组载体经酶切有1450bp的GKZ1 cDNA，序列经测序证实。COS-7／GKZ1细胞RT—PCR扩增出498bp的目的片段，Western—blot可见54kDa的特异性条带，而COS-7／pcDNA3．1细胞上述各项检测结果均为阴性。结论成功构建GK基因真核表达载体pcDNA3．1-GKZ1，并于COS-7细胞中成功转录与表达。     

抗肿瘤血管生成VEGFR2 DNA疫苗的构建

目的 构建一种新的抗肿瘤血管生成DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4）．方法 采用RT-PCR技术，从BALB／c胎鼠组织中扩增出鼠血管内皮生长因子受体flk-1胞外区1-4个袢的cDNA片段，并将其插入真核表达载体质粒pcDNA3．1＋中，构建成重组质粒pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4），经DNA序列分析证实后，将重组质粒经脂质体法转染真核表达系统COS-7细胞，通过Western blot实验检测重组质粒在真核表达系统COS一7细胞中蛋白的表达．结果 RT-PCR扩增产物为1248bp大小的基因片段，经过DNA序列分析证明与GeneBank所公布的flk-1胞外区1-4结构域碱基一致，成功构建了重组质粒pcDNA3．1＋／ilk-1（nl-4），并且该重组质粒在真核表达系统COS-7细胞中成功得到表达．结论 成功地制备了抗肿瘤血管生成DNA疫苗pcDNA3．1＋／flk-1（nl-4），为进一步开展有关抗肿瘤血管生成的动物实验和临床应用奠定了基础。     

L型电压门控钙通道α1C亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channels,L-VGCCs)α1C亚基羧基末端肽段(CT,1587-2169)的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法 采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1;采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA,克隆至重组体pcDNA3.1-CT,EGFP位于CT的羧基末端;采用脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达.结果 扩增了CT和EGFP的cDNA;构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光,免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带.结论 成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到表达.     

人HSP 40基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建人热休克蛋白40（HSP40）的2种同源物HDJ-1和HDJ-2基因真核表达载体，观察其在人成神经细胞瘤细胞株（SK-N-SH）中的表达。方法 从流产胚胎脑组织中抽提总RNA，RT-PCR扩增HDJ-1和HDJ-2 cDNA，经限制性内切酶双酶切后，克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）和pEGFP-N1质粒中。HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对，序列正确的重组质粒用脂质体转染SK-N-SH细胞，Western blot和荧光显微镜观察基因表达情况。结果 HDJ-1和HDJ-2基因测序结果与基因库登录序列比对显示完全一致。Westernblot证实pcDNA3．1（＋）／HDJ-1转染SK-N-SH细胞24h后有HDJ-1的过表达，至少持续72h；pEGFP-N1／HDJ-1和pEGFP-N1／HDJ-2转染的细胞有HDJ-1／GFP和HDJ-2／GFP融合蛋白的表达，至少持续72h。荧光显微镜观察到pEGFP-N1／HDJ-1和pEGFP-N1／HDJ-2转染的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。结论 本实验成功构建pcDNA3．1（＋）／HDJ-1、pEGFP-N1／HDJ-1和pEGFP-N1／HDJ-2真核表达质粒，并在SK-N-SH细胞中表达。     

突变型MYOC基因真核表达质粒的构建及在COS-7细胞中表达

目的构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His（-）mMYOC,并在COS-7细胞中表达Pro370Leu突变型MYOC蛋白。方法以pGEM-T-MYOC质粒中MYOC为模板,用PCR介导的定点突变技术,得到Pro370Leu突变型MYOC基因（mMYOC）,并定向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His（-）B上,得到pcDNA3.1/myc-His（-）mMYOC重组表达质粒,再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定,最后用脂质体包埋转染法转染COS-7细胞,用特异性引物对转染的COS-7细胞的总RNA进行RT-PCR扩增,检测mMYOC基因表达,用抗标签基因His表达产物的特异性抗体,进行Western blot法检测蛋白分泌情况。结果经酶切和DNA序列测定,证实重组质粒构建成功,mMYOC基因能在COS-7细胞中表达,并且mMYOC蛋白不能分泌到培养液中。结论成功构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His（-）mMYOC,mMYOC蛋白不能分泌到细胞外。