多重PCR快速检测5种重要致病性弧菌

目的建立一种快速检测霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、拟态弧菌和溶藻弧菌5种重要致病性弧菌的多重PCR方法。方法以霍乱弧菌omp W基因、副溶血性弧菌toxR基因、创伤弧菌vvh A基因、拟态弧菌VMH基因和溶藻弧菌gyr B基因为靶基因设计特异性引物,优化建立多重PCR反应体系,系统评价其特异性和检测下限值。结果成功构建致病性弧菌多重PCR检测方法。评价结果显示其特异性为100%,霍乱弧菌、副溶血性弧菌和拟态弧菌的检测下限值为100 CFU/ml,创伤弧菌和溶藻弧菌的检测下限值为1 000 CFU/ml;多重PCR的弧菌检出率明显高于传统分离培养方法(56%vs 17%)。结论该多重PCR方法快速、灵敏、特异性好,可用于海环境和水产品中致病性弧菌的监测。     

环介导等温核酸扩增法快速检测副溶血性弧菌的研究

目的基于环介导等温核酸扩增法(LAMP)建立副溶血性弧菌tlh基因的快速检测方法。方法以副溶血性弧菌tlh基因为扩增的靶序列分别设计外引物、内引物和环引物各1对,通过引物特异性识别tlh基因上的6个独立区域在恒温条件下扩增靶序列,快速检测副溶血性弧菌。并对该法进行灵敏度、特异度试验,将该方法与荧光定量PCR法检出率进行统计学比较。结果 LAMP法最低检出限为10 fg/μl,灵敏度是荧光定量PCR的10倍;特异度实验中除检出2株副溶血性弧菌外,6株非副溶血性弧菌均未检出;LAMP法与荧光定量PCR法检出率差异无统计学意义(P0.05)。结论 LAMP法具有高特异性、高效性、快速简便易检测等特点,适合现场快速检测,在食物中毒暴发处置中有深远的经济价值。     

副溶血性弧菌MPCR-DHPLC检测方法的建立

目的:建立多重PCR(Multiplex PCR,MPCR)结合变性高效液相色谱(Denaturing High-Performance Liquid Chromatography,DHPLC)检测副溶血性弧菌的方法,并了解该菌携带毒力基因的情况。方法:根据副溶血性弧菌的毒力基因tdh、trh和种特异性基因toxR进行引物设计,以其单一PCR扩增产物在DHPLC出现的色谱峰作为标准色谱峰,建立MPCR-DHPLC的检测方法。结果:该方法能有效扩增副溶血性弧菌的tdh、trh和toxR基因,25株副溶血性弧菌的MPCR扩增产物经DHPLC分析所得的色谱峰在位置和峰型与标准色谱峰有很好的符合性,其他菌属的菌株均无特异性扩增,对模拟污染样品可正确检测,灵敏度达到1*103CFU/ml,特异性达到100%。结论:本文建立的MPCR-DHPLC方法可准确检测副溶血性弧菌,并了解该菌携带毒力基因的情况。     

武汉市64株副溶血性弧菌水产品分离株分子特征的研究

目的了解武汉地区水产品中副溶血性弧菌的分子特征,为防止副溶血性弧菌引起的食源性疾病提供基础数据。方法采用PCR的方法,对武汉市2008年-2013年从水产品中分离的64株副溶血性弧菌进行了耐热性溶血毒素基因tdh、耐热性溶血毒素相关溶血素基因trh、不耐热溶血素基因tlh、毒力表达基因toxR和大流行株O3:K6特征基因片段orf8进行检测,并进行统计分析。结果在64株副溶血性弧菌中,tdh、trh基因的阳性率为14.06%和4.69%,orf8基因的阳性率为7.81%,而toxR和tlh基因的阳性率为100.00%。结论 tlh和toxR基因可作为副溶血性弧菌的快速初筛和辅助鉴定手段。武汉地区水产品中副溶血性弧菌tdh,orf8阳性率较高,建议卫生监督部门加强水产品监管,提防公共卫生事件的发生。     

应用PCR法检测副溶血性弧菌

目的 研究副溶血性弧菌的PCR检测方法。方法 引物选择副溶血性弧菌耐热溶血素（TDH）上的基因，应用PCR法，检测副溶血性弧菌。结果 PCR能检测经选择性增菌液培养的副溶血性弧菌，扩增片段在430bp：结论 应用PCR检测副溶血性弧菌，具有快速、特异、灵敏和简便的特点。     

水产品中副溶血性弧菌交叉引物恒温扩增检测技术的建立与应用

目的建立水产品中副溶血性弧菌的交叉引物恒温扩增(CPA)检测技术。方法用加热煮沸法提取菌株和增菌液中的DNA,在对副溶血性弧菌基因序列进行分析、对比基础上,选择特异性强且高度保守的目的基因序列,设计合成交叉恒温扩增引物。对CPA技术反应条件优化,建立副溶血性弧菌的的快速检测方法,检测方法的敏感性和特异性,并和荧光定量PCR方法进行比较。同时利用该法对采集的水产品中的副溶血性弧菌进行监测。结果该法60℃、40 min即可完成反应,敏感性和特异性高,最低检测限为14 CFU/mL,与荧光定量PCR法类似。结论建立的副溶血性弧菌交叉引物恒温扩增检测法,不需要昂贵的PCR仪,仅需1台水浴锅或金属浴即可完成细菌DNA的扩增,密闭的核酸检测试纸条使结果判定直观、客观,且可有效避免气溶胶污染,方法的敏感性和特异性高,可用于副溶血性弧菌的现场快速检测。     

提高贝类海鲜中副溶血性弧菌PCR快速检测方法灵敏度的研究

[目的]提高贝类海鲜中副溶血型弧菌PCR快速检测方法灵敏度。[方法]选取副溶血性弧菌的属特异性tl基因设计引物,对PCR反应体系进行优化,20μl体系中加入了20μg牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)。[结果]13株不同来源的副溶血性弧菌均扩增出450bp条带,纯培养菌液的检出限低至4×103cfu/ml,污染样品的检出限低至4cfu/g。[结论]适量的牛血清白蛋白浓度可显著提高检测方法的灵敏度。     

应用SYBR Green Ⅰ荧光PCR快速检测副溶血弧菌及其毒力基因

目的利用SYBR Green Ⅰ荧光PCR反应检测副溶血弧菌及其trh和tdh毒力基因。方法根据副溶血弧菌tlh基因设计引物,建立检测副溶血弧菌SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,利用33株副溶血弧菌分离株以及22株其他种属细菌进行特异性和灵敏度评价。根据副溶血弧菌trh和tdh毒力基因序列设计引物,建立检测副溶血弧菌毒力基因的单重和双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,并对这两种方法进行特异性和灵敏度评价。结果本研究中基于tlh基因的荧光PCR检测对全部33株副溶血弧菌检测为阳性,检测下限为5×101拷贝/μl,而22株其他种属细菌均为阴性。毒力基因trh和tdh均能特异性检测,其单重荧光PCR检测下限为5×101拷贝/μl,双重荧光PCR检测下限为5×102拷贝/μl。结论本研究建立了tlh作为靶基因检测副溶血弧菌的单重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法和同时检测副溶血弧菌trh和tdh毒力基因的双重SYBR Green Ⅰ荧光PCR检测方法,简化了毒力基因检测,有良好的实际应用前景。     

荧光PCR检测副溶血性弧菌

[目的]建立荧光PCR检测副溶血性弧菌的快速方法。[方法]根据基因库公布的副溶血性弧菌的耐热直接溶血素基因（TDH）的保守序列,设计一对引物,用FAM荧光剂标记探针的5＇,进行特异性和灵敏性分析,使用于食物中毒样品的快速检测。[结果]检测灵敏度为170.8fg/μl,菌液的灵敏度为30~70cfu/ml。用此反应体系检测53株副溶血性弧菌均出现特异的荧光信号,未见与其它试验种属细菌交叉。对3起食物中毒样品45份用荧光PCR法和国标法检测副溶血性弧菌,荧光PCR检测阳性22份,国标法阳性20份。荧光PCR检测从样品处理到结果只需8h。[结论]荧光PCR检测副溶血性弧菌灵敏度高、特异性强、简便快速,可用于副溶血性弧菌引起食物中毒的快速诊断和海产品副溶血性弧菌的快速检测。     

Taqman MGB探针实时PCR快速检测副溶血性弧菌

[目的]建立一种对食品中副溶血性弧菌的快速检测方法。[方法]根据GenBank公布的副溶血性弧菌的toxR基因的保守序列,设计1对引物和Taqman MGB探针,建立基于Taqman MGB探针的实时PCR快速检测副溶血性弧菌方法。[结果]通过对20种细菌的DNA进行扩增,结果6株副溶血性弧菌均可产生特异性扩增,与其他细菌无交叉反应;对纯菌而言,菌液灵敏度为23／ml,DNA浓度为130Pg。定量关系式为：y=3．353151Ln（x）＋43．797989,R^2=0．947952。67份冷冻海产品中2份副溶血性弧菌实时PCR检测结果阳性,相对应的有1份样品副溶血性弧菌培养阳性,检测时间仅需2h。[结论]该反应体系具有高度的灵敏度和极高的特异性,可用于食品和食物中毒样品中副溶血性弧菌的快速检测。